Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Anestezjologia Intensywna Terapia 1/2003, s. 8-16
Alicja Pawińska1, Marek Migdał2, Wanda Kamińska1, Jan Patzer1, Rafał Błasiak2, Elżbieta Lech2, Tadeusz Szreter2, Danuta Dzierżanowska1
Wykorzystanie metod biologii molekularnej w ocenie związku pomiędzy endogenną florą bakteryjną, a rozwojem wentylacyjnego zapalenia płuc u pacjentów oddziału intensywnej terapii
Molecular biology for the assessment of the association between endogenous bacterial flora and the development of ventilation pneumonia in intensive therapy unit patients
1Zakład Mikrobiologii Klinicznej, kierownik: prof. dr hab. med. D. Dzierżanowska
2Oddział Intensywnej Terapii, kierownik: prof. dr hab. med. T. Szreter
Instytut „Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka” w Warszawie
Streszczenie
Cel pracy. Ocena związku pomiędzy endogenną florą pacjenta, a patogenezą wentylacyjnego zapalenia płuc (VAP).
Metodyka. Badaniem objęto 43 dzieci, które przebywały w oddziale intensywnej terapii w 2000 r. i wymagały leczenia oddechem zastępczym przez co najmniej 7 dni. W dniu przyjęcia do oddziału oraz po każdym kolejnym dniu hospitalizacji u pacjentów wykonywano posiewy popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, wymazu z gardła oraz wymazu z odbytu. Szczepy bakteryjne były typowane przy zastosowaniu elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (PFGE).
Wyniki. Spośród 45 pacjentów u 15 w dniu przyjęcia uzyskano dodatni wynik posiewu popłuczyn pęcherzykowo--oskrzelowych. Z posiewu popłuczyn wyhodowano: Klebsiella pneumoniae [4], Pseudomonas aeruginosa [3], MRSA [2], Streptococcus viridans [1], Staphylococcus epidermidis [1], Acinetobacter baumanii [1], Serratia marcescens [1], Enterobacter cloacae [1], Candida sp. [1]. Spośród 28 pacjentów, u których wynik badania popłuczyn pęcherzykowo--oskrzelowych w dniu przyjęcia był ujemny, u 15 wystąpiło zapalenia płuc w czasie hospitalizacji. Z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych izolowano u nich: Pseudomonas aeruginosa [6], Klebsiella pneumoniae [3], Enterobacter cloacae [3], Stenotrophomonas maltophilia [3], Serratia marcescens [2], MRSA [1]. W dwóch przypadkach z posiewu materiału wyhodowano po dwa drobnoustroje. W grupie 15 chorych, u których wystąpiło szpitalne zapalenie płuc, w 12 przypadkach drobnoustroje, będące czynnikiem etiologicznym zakażenia, izolowano także z innych materiałów: u 9 pacjentów – z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, z gardła i z odbytu, u 2 pacjentów – z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych i z gardła, a u 1 pacjenta – z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych i z odbytu.
Wnioski. Typowanie PFGE wykazało istnienie związku pomiędzy florą endogenną pacjentów leczonych w oddziale intensywnej terapii, a występowaniem wentylacyjnego zapalenia płuc.
Summary
Background. The aim of the study was an assessment of the relation between a patient´s endogenous flora and the pathogenesis of ventilation-acquired pneumonia (VAP).
Method: The study included 43 ICU children requiring artificial ventilation for at least seven days. On the day of admission, and at the end of every following day cultures of bronchoalveolar lavage (BAL), throat swabs, and anal swabs were done. Bacterial strains were typed using electrophoresis in an alternating electric field (PFGE).
Results. In 15 cases positive BAL results were obtained on the day of admission. The following bacteria were found: Klebsiella pneumoniae [4], Pseudomonas aeruginosa [3], MRSA [2], Streptococcus viridans [1], Staphylococcus epidermidis [1], Acinetobacter baumanii [1], Serratia marcescens [1], Enterobacter cloacae [1], Candida sp. [1]. Out of 28 BAL-negative patients, 15 developed pneumonia during hospitalisation. Their BAL cultures revealed: Pseudomonas aeruginosa [6], Klebsiella pneumoniae [3], Enterobacter cloacae [3], Stentotrophomonas maltophilia [3], Serratia marcescens [2], MRSA [1]. In two cases two micro-organisms were cultured. Among 15 nosocomial pneumonia patients, in 12 cases micro-organisms that were the aetiological factors of the infections were also isolated from other materials. In nine patients, from BAL, throat and anal swabs, in two from BAL and throat swabs, and in one from BAL and anal swabs. Genetic typing showed that only one case had the aetiological factor of VAP [Klebsiella pneumoniae] in the pharyngeal mucosa on the day of admission. In the remaining cases the VAP aetiological factors included hospital flora.
Conclusions. PFGE typing demonstrated a correlation between the endogenous flora of patients treated in the intensive therapy department and the occurrence of ventilation-acquired pneumonia.
Zapalenie płuc należy do najcięższych postaci zakażeń szpitalnych, obarczonych wysoką śmiertelnością, która wynosi od 0,5 do 2% u chorych w oddziałach internistycznych i sięga 50% przypadków w oddziałach intensywnej opieki medycznej [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Wystąpienie zapalenia płuc u pacjentów leczonych oddechem zastępczym określane jest mianem respiratoropochodnego zapalenia płuc (VAP). Czynnikami, które sprzyjają rozwojowi VAP są: przewlekła niewydolność oddechowa, długotrwała hospitalizacja, kolonizacja dróg oddechowych oporną na antybiotyki florą szpitalną, urazy klatki piersiowej lub operacje na klatce piersiowej i nadbrzuszu, obecność chorób podstawowych, takich jak choroby sercowo-naczyniowe, dystrofia mięśniowa [3, 4, 7, 8]. Ryzyko wystąpienia VAP rośnie o 1% z każdym dniem leczenia oddechem zastępczym i jest najwyższe w pierwszych 10 dniach sztucznej wentylacji [3]. Stosowanie w leczeniu wspomagającym związków obniżających kwasowość soku żołądkowego sprzyja kolonizacji błony śluzowej przez pałeczki Gram-ujemne i aspiracji treści jelitowej do płuc [2, 3, 4]. Czynnikami etiologicznymi szpitalnych zapaleń płuc są w większości przypadków pałeczki Gram-ujemne, takie jak Pseudomonas, Acinetobacter, Enterobacter, Klebsiella [3, 9]. Ciężki przebieg zakażenia i wysoka śmiertelność są m.in. konsekwencją wysokiej oporności na antybiotyki drobnoustrojów wywołujących VAP [8, 9]. Wystąpienie zapalenia płuc jest często poprzedzone kolonizacją górnych dróg oddechowych drobnoustrojami potencjalnie patogennymi [9, 10]. W następstwie stosowania antybiotyków o szerokim spektrum aktywności, fizjologiczna flora błon śluzowych jest zastępowana florą szpitalną [1, 2, 4, 9].
Zapalenie płuc jest rozpoznawane na podstawie charakterystycznych objawów klinicznych. Należą do nich m.in.: gorączka, odkrztuszanie ropnej plwociny, postępujące nacieczenie płuc. Rozpoznanie zakażenia jest utrudnione u chorych cierpiących na przewlekłą niewydolność oddechową, długotrwale leczonych oddechem zastępczym. Istotne znaczenie w rozpoznaniu ma bakteriologiczna i histopatologiczna ocena materiału pobranego z dolnych dróg oddechowych [4, 9]. Rodzaj i sposób pobierania materiału diagnostycznego, a także interpretacja wyniku posiewu, wciąż są przedmiotem dyskusji [1, 4, 5]. Ponieważ w czasie pobierania istnieje ryzyko zanieczyszczenia próbki florą jamy ustnej, zalecane jest stosowanie takich technik pobierania materiału, które pozwolą na wykonanie ilościowego badania bakteriologicznego [1, 4]. Możliwe jest wówczas odróżnienie faktycznego zakażenia od zanieczyszczenia próbki. Materiałem często przysyłanym do badań bakteriologicznych jest treść odessana z tchawicy [1, 4, 8]. Ocena wyniku posiewu może być trudna, jeżeli materiał został pobrany przez rurkę intubacyjną skolonizowaną przez bakterie. Interpretacja wyniku możliwa jest wyłącznie przy ilościowym posiewie wydzieliny. Wyhodowanie 105 cfu ml-1 (liczba komórek bakterii w 1 ml materiału) przyjmuje się za wynik dodatni [1, 8]. Czułość i specyficzność metody oceniana jest na 70-85%. Pobieranie materiału w czasie bronchoskopii metodą płukania pęcherzykowo-oskrzelowego (BAL) lub przy pomocy szczoteczki (PBS) uznane jest za metodę najmniej obciążoną ryzykiem wprowadzenia zanieczyszczenia do próbki [10]. Wynik interpretowany jest jako dodatni przy wyhodowaniu> 103 bakterii z 1 ml materiału [1, 8]. Wysoko oceniana jest czułość i specyficzność badania (75-90%).
Bronchoskopia jest techniką inwazyjną i nie zawsze może być stosowana w rutynowej diagnostyce. Coraz szerszą akceptację zyskuje niebronchoskopowa technika pobierania popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych [1]. Wprowadzanie soli fizjologicznej do płuc i odsysanie popłuczyn odbywa się przez cewnik wprowadzany do dolnych dróg oddechowych przez rurkę dotchawiczą. Ryzyko zanieczyszczenia materiału jest w tej metodzie wyższe niż przy technice bronchoskopowej, dlatego przyjmowane są inne kryteria interpretacji wyniku (ł 104 cfu ml-1).
Szpitalne zapalenie płuc może być wywołane przez bakterie, które były obecne na błonach śluzowych górnych dróg oddechowych przed przyjęciem do szpitala lub którymi pacjent skolonizował się w czasie hospitalizacji [9, 11, 12]. W pierwszym przypadku zakażenie określane jest jako pierwotnie endogenne, natomiast w drugim – jako wtórnie endogenne. Wykrywanie potencjalnie patogennych drobnoustrojów w fazie kolonizacji pozwala zapobiec powikłaniom infekcyjnym lub odpowiednio wcześnie zastosować właściwy antybiotyk, jeżeli dojdzie do rozwoju zakażenia [9, 11, 12]. U chorego, u którego w czasie pobytu w szpitalu rozwinęło się VAP, identyfikacja czynnika etiologicznego i konfrontacja z drobnoustrojami wcześniej od niego izolowanymi pozwalają sklasyfikować zakażenie jako pierwotnie lub wtórnie endogenne. Do oceny podobieństwa szczepów izolowanych z różnych materiałów od tego samego pacjenta stosowane jest typowanie genetyczne. Miernikiem stopnia pokrewieństwa drobnoustrojów jest podobieństwo chromosomalnego DNA [13]. Metodą najczęściej wykorzystywaną dla celów epidemiologicznych jest elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (PFGE). Umożliwia ona ocenę całych genomów bakteryjnych oraz przeprowadzenie analizy porównawczej od kilkunastu do kilkudziesięciu szczepów w czasie jednego badania.
Celem naszej pracy była próba oceny udziału endogennej flory bakteryjnej w rozwoju wentylacyjnego zapalenia płuc u pacjentów oddziału intensywnej opieki medycznej przy zastosowaniu typowania genetycznego metodą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym.
MATERIAŁ I METODY
Badaniem zostały objęte dzieci, wymagające leczenia oddechem zastępczym przez co najmniej 7 dni. Gromadzone były dane dotyczące wieku pacjentów, płci, choroby podstawowej, powodu przyjęcia do szpitala, czasu hospitalizacji, antybiotyków jakie pacjent otrzymywał w dniu przyjęcia (ryc. 1).
Nr historii choroby
Data
BADANIE BAKTERIOLOGICZNE „E”
Oddział Intensywnej Terapii
Imię i nazwisko
Wiek
Rozpoznanie kliniczne
Jakie otrzymuje antybiotyki
Czas pobrania materiału:
a) badanie w dniu przyjęcia
b) po kolejnym tygodniu hospitalizacji
Rodzaj materiału (podkreślić)
a) wymaz z gardła
b) BAL-f
c) wymaz z okolicy okołoodbytniczej
Lekarz kierujący
Uwagi
Ryc. 1. Skierowanie na badanie bakteriologiczne
Do badań bakteriologicznych flory kolonizującej przewód pokarmowy i górne drogi oddechowe pobierane były następujące materiały: wymaz z gardła, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe, wymaz z okolicy okołoodbytniczej. Badania wykonywane były w dniu przyjęcia chorego do oddziału oraz po każdym następnym tygodniu hospitalizacji.
Bakteriologiczne badanie popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych
Popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe pobierane były metodą niebronchoskopową do jałowych pojemników (Uno Plast, Skamex). Materiał przed badaniem poddawany był homogenizacji (przez 30 minut) przy użyciu preparatu Mistabron, który dodawano do próbki w ilości od 3 do 5 kropli (w zależności od objętości pobranego materiału). Następnie wykonywany był posiew ilościowy. W tym celu materiał wysiewany był w ilości po 100 mcl na podłoża bakteriologiczne umożliwiające izolację bakterii tlenowych (agar krwawy, AK) oraz grzybów (podłoże Sabourauda). Po posiewie płytki z podłożem AK inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin, zaś płytki z podłożem Sabourauda inkubowano w temperaturze 30°C przez 10 dni. Wyrosłe na podłożach kolonie były zliczane i podawano ostateczną liczbę bakterii w 1 ml próbki (cfu ml-1). Jako wynik dodatni przyjęto obecność ł 104 cfu w 1 ml materiału.
Identyfikacja fenotypowa drobnoustrojów
Wszystkie drobnoustroje, wyizolowane z materiałów pobranych od chorych, były identyfikowane do gatunku przy użyciu systemu API (BioMerieux, Francja). Wrażliwość na antybiotyki oznaczana była metodą dyfuzyjno-krążkową wg NCCLS [14].
Kolekcjonowanie i przechowywanie szczepów bakteryjnych do dalszych analiz
Drobnoustroje, wyizolowane od pacjentów w dniu przyjęcia oraz w czasie hospitalizacji, były kolekcjonowane celem wykonywania dalszych analiz. Bakterie zawieszane były w bulionie tryptozowo-sojowym z dodatkiem 20% glicerolu i zamrażane w -70°C. Przed użyciem do typowania genetycznego szczepy były odmrażane i dwukrotnie pasażowane na podłożu AK.
Typowanie genetyczne
Typowanie genetyczne prowadzone było metodą elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (PFGE) przy użyciu aparatu CHEF DRII (BioRad).
Chromosomalne DNA drobnoustrojów izolowane było w bloczkach agarozowych. Komórki bakteryjne były pobierane z płynnych hodowli całonocnych i zatapiane w bloczkach agarozowych, a następnie poddawane lizie (końcowo: lizozym 0,8 mg ml-1) i proteolizie (końcowo: proteinaza K 200 mg ml-1). Po odpłukaniu roztworów litycznych DNA w bloczkach poddawane było trawieniu restrykcyjnemu. Trawienie poszczególnych rodzajów pałeczek Gram-ujemnych prowadzone było przy zastosowaniu odpowiednich enzymów restrykcyjnych: Xba I – dla Enterobacter i Klebsiella, Dra I – dla Pseudomonas. Zastosowano następujące warunki rozdziału:
- Klebsiella: blok I: 20s/50s przez 12 godzin, blok II: 5s/17s przez 17 godzin: w temperaturze 12°C przy napięciu 5V/cm.
- Enterobacter: 5s/50s przez 25 godzin, w temperaturze 12°C przy napięciu 5V/cm.
- Pseudomonas: 4s/40s przez 20 godzin, w temperaturze 12°C przy napięciu 5,4V/cm.
Stopień pokrewieństwa izolatów w obrębie żelu określany był zgodnie z sugestiami Tenover [13].
WYNIKI
Charakterystyka pacjentów
Do badań zakwalifikowanych zostało 43 dzieci. Wiek pacjentów wynosił od 0 do 15 lat, w tym 22 (51%) dzieci nie przekroczyło miesiąca życia, a 33 (77%) pacjentów stanowiły niemowlęta (tab. I). Z innego oddziału przyjęto 37% pacjentów, zaś z innego szpitala – 53% pacjentów. Spośród pacjentów objętych badaniem 10% przyjętych było spoza środowiska szpitalnego. Najczęściej występującą chorobą podstawową była wada serca, a co 5 pacjent wymagał intensywnej opieki z powodu wcześniactwa (tab. II). W dniu przyjęcia do oddziału aż 40 (93%) pacjentów było leczonych antybiotykami: 20 – otrzymywało 2 antybiotyki, 5 – 3 antybiotyki i 14 – 1 antybiotyk (tab. III). Czas leczenia oddechem zastępczym wynosił od 8 dni do 2 miesięcy – średnio 33 dni w grupie dzieci, które rozwinęły zapalenie płuc i 14 dni w grupie dzieci, u których nie wystąpiło zakażenie. Spośród 43 dzieci objętych badaniem – u 15 (35%) rozpoznano (klinicznie i bakteriologicznie) zapalenie płuc w dniu przyjęcia do oddziału, w 13 (30%) przypadkach u pacjentów nie odnotowano klinicznych i bakteriologicznych symptomów zakażenia dolnych dróg oddechowych przez cały czas pobytu na oddziale. Natomiast u 15 (35%) chorych, u których w dniu przyjęcia z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych nie wyhodowano drobnoustrojów, w czasie hospitalizacji wystąpiło zapalenie płuc. Częstość występowania wentylacyjnego zapalenia płuc rosła wraz z czasem trwania leczenia oddechem zastępczym (ryc. 2). Najwięcej przypadków zachorowań odnotowano w pierwszych dwóch tygodniach hospitalizacji. Zapalenie płuc występowało u 19% pacjentów po 10 dniach leczenia, u 26% pacjentów po 20 dniach leczenia, a po 30 dniach – u 35% pacjentów.
Tabela I. Wiek pacjentów objętych badaniem
Podział pacjentów na grupy w zależności od wystąpienia zapalenia płucGrupy wiekowe
< 1 miesiąca1 mies. - 1 rok1 rok - 2 lata> 2 lat
Pacjenci przyjęci z zapaleniem płuc103-2
Pacjenci, którzy rozwinęli zapalenie płuc w czasie hospitalizacji103-2
Pacjenci bez zapalenia płuc przez cały okres hospitalizacji2524
Łącznie n = 4322 (51%)11 (26%)2 (5%)8 (18%)
Tabela II. Choroba podstawowa u pacjentów objętych badaniem (n = liczba pacjentów)
Choroba podstawowaPacjenci przyjęci z zapaleniem płucPacjenci, którzy rozwinęli zapalenie płuc w czasie hospitalizacjiPacjenci bez zapalenia płuc przez cały okres hospitalizacjiŁącznie
Wada serca64515
Wcześniactwo2619
Stan po urazie komunikacyjnym1-23
Uszkodzenie OUN2-13
Stan po wytrzewieniu12-3
Wielowadzie11-2
Zapalenie płuc z niewydolnością oddechową2--2
Choroba nowotworowa--22
Cholestaza o nieznanej etiologii--11
Choroba syropu klonowego-1-1
Zapalenie rdzenia kręgowego-1-1
Stan po zachłyśnięciu--11
Tabela III. Antybiotyki, które pacjenci otrzymywali w dniu przyjęcia na oddział
Nazwa antybiotykuIlość zastosowań antybiotyku
netilmycyna17
imipenem/cilastatyna8
amoksycylina/kwas klawulanowy8
wankomycyna6
cefuroksym5
ceftazydym4
kotrimoksazol3
cefotaksym3
metronidazol3
ceftriakson2
ciprofloksacyna2
piperacylina2
amikacyna2
cefepim1
klarytromycyna1
erytromycyna1
klindamycyna1
Ryc. 2. Częstość występowania zapaleń płuc w kolejnych dniach leczenia oddechem zastępczym
Wyniki badań bakteriologicznych
Z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych od pacjentów przyjętych z zapaleniem płuc (15 dzieci) wyhodowano: Klebsiella pneumoniae [4], Pseudomonas aeruginosa [3], MRSA [2], Streptococcus viridans [1], Enterobacter cloacae [1], Staphylococcus koagulazo-ujemny [1], Acinetobacter baumanii [1], Serratia marcescens [1], Candida sp. [1]. Natomiast u 15 chorych, u których wystąpiło zapalenia płuc w czasie hospitalizacji wyhodowano: Pseudomonas aeruginosa [6], Klebsiella pneumoniae [3], Enterobacter cloacae [3], Stenotrophomonas maltophilia [2], Serratia marcescens [2], MRSA [1]. W dwóch przypadkach z posiewu materiału hodowano po dwa drobnoustroje.
Wrażliwość na antybiotyki pałeczek Gram-ujemnych, które izolowano z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych pacjentów ze szpitalnym zapaleniem płuc przedstawiona została w tabelach IV, V, VI. Analiza wrażliwości na antybiotyki wszystkich izolowanych od pacjentów pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae (w dniu przyjęcia oraz w czasie hospitalizacji) wykazała, iż 50% szczepów opornych było na III generację cefalosporyn. Wysoką aktywność wykazywały antybiotyki aminoglikozydowe (79% szczepów wrażliwych na amikacynę, 71% szczepów wrażliwych na gentamycynę i netilmycynę). Jedynym w pełni aktywnym wobec nich antybiotykiem pozostawał imipenem. Natomiast wśród pałeczek niefermentujących 69% szczepów było opornych na imipenem, a najwyższą aktywność wykazywały antybiotyki aminoglikozydowe (70-77% szczepów wrażliwych) oraz połączenie piperacyliny z tazobaktamem (69% szczepów wrażliwych). Spośród 15 chorych z rozpoznanym szpitalnym zapaleniem płuc w 3 przypadkach bakterie w liczbie ł 104 cfu ml-1 izolowano wyłącznie z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych. Natomiast w 12 przypadkach takie same drobnoustroje (ten sam rodzaj i gatunek oraz identyczna lub podobna wrażliwość na antybiotyki) izolowano z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych oraz z innych materiałów: w 9 przypadkach – z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, z gardła i z odbytu, w 1 przypadku – z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych i z odbytu, a w 2 przypadkach – z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych i z gardła.
Tabela IV. Wrażliwość na antybiotyki szczepów Enterobacter cloacae przedstawionych na rycinie 3
PacjentTIMTZPCXMCTXCAZAMCATMIPMANGECIP
D.W. szczepy 1-3wwwwwowwwww
Sz.S. szczepy 4-5owooooowwww
Sz.S. szczep 6owooooowwww
R.S. szczep 7-9wwowwowwwww
Tabela V. Wrażliwość na antybiotyki szczepów Pseudomonas aeruginosa przedstawionych na rycinie 4
PacjentTIMTZPCAZCFPATMIPMCIPANGE
B.D. szczepy 1-2wwwwwowww
O.N. szczepy 3-5wwwwwowww
S.P. szczepy 6-7wwwwwowww
M.G. szczepy 8-9wwwwwowww
M.G. szczep 10wwwwwowww
Sz.P. szczepy 11-13wwwwwowww
W.N. szczepy 14-15wwwwwowww
Tabela VI. Wrażliwość na antybiotyki szczepów Klebsiella pneumoniae przedstawionych na rycinie 5
PacjentTIMTZPCXMCTXCAZAMCATMIPMCIPANGE
D.W. szczepy 1-5wwoowwowwoo
Sz.S. szczepy 6-9wwowwwowwww
R.S. szczep 10wwowooowwww
R.S. szczep 11wwoowoowwoo
R.S. szczepy 10-14wwoowwowwwo
Wyniki typowania genetycznego
Typowanie genetyczne wykazało bliskie pokrewieństwo pomiędzy szczepami kolonizującymi błony śluzowe przewodu pokarmowego i gardła, a szczepami izolowanymi z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych (ryc. 3, 4, 5). Na rycinie 4 przedstawiono typowanie metodą PFGE szczepów Pseudomonas aeruginosa izolowanych z materiałów klinicznych od 6 pacjentów. U wszystkich pacjentów za zapalenie płuc odpowiedzialne były szczepy o identycznym wzorze restrykcyjnym, co świadczy o ich wspólnym pochodzeniu. Typowanie genetyczne pałeczek Enterobacter cloacae, przedstawione na rycinie 3 wykazało, że u każdego z trojga pacjentów za zakażenie odpowiedzialny był inny szczep. Rycina 5 przedstawia typowanie szczepów Klebsiella pneumoniae, izolowanych od trojga pacjentów. U pierwszego z nich za zapalenie płuc odpowiedzialny był szczep, którym pacjent skolonizowane miał błony śluzowe gardła i przewodu pokarmowego w dniu przyjęcia do oddziału. Typowanie genetyczne wykazało, iż był to szczep identyczny z izolowanymi od innych pacjentów, zatem były to endemiczne bakterie szpitalne, którymi pacjent skolonizował się na innym oddziale. Natomiast u pacjenta 3 z przewodu pokarmowego i z gardła izolowano w dniu przyjęcia różne pałeczki Klebsiella (o innym wzorze restrykcyjnym) od szczepów, które wywołały zapalenie płuc i skolonizowały pacjenta w czasie pobytu na oddziale.
Ryc. 3. Typowanie genetyczne szczepów Enterobacter cloacae izolowanych od pacjentów, którzy rozwinęli zapalenie płuc w czasie hospitalizacji. Linie 1-3 – pacjent 1, linie 5-6 – pacjent 2, linie 7-9 – pacjent 3. Linie 1, 4, 7 – szczepy izolowane z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, linie 2, 5, 8 – szczepy izolowane z gardła, linie 3, 6, 9 – szczepy izolowane z odbytu. l – wzorzec wielkości
Ryc. 4. Typowanie genetyczne szczepów Pseudomonas aeruginosa izolowanych od pacjentów, którzy rozwinęli zapalenie płuc w czasie hospitalizacji. Linie 1, 2 – pacjent 1, linie 3, 4, 5 – pacjent 2, linie 6, 7 – pacjent 3, linie 8, 9, 10 – pacjent 4, linie 11, 12, 13 – pacjent 5, linie 14, 15 – pacjent 6. Linie 1, 3, 6, 8, 11, 14 – szczepy izolowane z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, linie 2, 4, 9, 12, 15 – szczepy izolowane z gardła, linie 5, 7, 10, 13 – szczepy izolowane z odbytu. l – wzorzec wielkości
Ryc. 5. Typowanie genetyczne szczepów Klebsiella pneumoniae izolowanych od pacjentów, którzy rozwinęli zapalenie płuc w czasie hospitalizacji. Linie 1-5 – pacjent 1, linie 6-9 – pacjent 2, linie 10-14 – pacjent 3. Linie 3, 6, 8, 12 – szczepy izolowane z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych, linie 1, 4, 7, 10, 13 – szczepy izolowane z gardła, linie 2, 5, 9, 11, 14 – szczepy izolowane z odbytu. l – wzorzec wielkości
OMÓWIENIE
W naszej pracy zamierzaliśmy wykazać istnienie związku pomiędzy nosicielstwem potencjalnie patogennych drobnoustrojów na błonach śluzowych przewodu pokarmowego i gardła, a etiologią szpitalnego zapalenia płuc u pacjentów leczonych oddechem zastępczym.
Liczne analizy dowodzą, że intubacja i sztuczna wentylacja są najistotniejszymi czynnikami ryzyka rozwoju szpitalnego zapalenia płuc. Wyniki programu EPIC wykazały, że zapalenie płuc występuje 21 razy częściej u chorych zaintubowanych (wentylacyjne zapalenie płuc, VAP) w porównaniu do pacjentów, którzy nie wymagają leczenia przy zastosowaniu respiratora [15]. W ocenie statystycznej częstość występowania zapalenia płuc u pacjentów w Oddziale Intensywnej Terapii jest kilkakrotnie wyższa niż generalnie w całym szpitalu [1, 4]. Wraz z czasem trwania sztucznej wentylacji rośnie ryzyko wystąpienia infekcyjnych powikłań [1, 2, 3, 4, 5].
Wyniki przeprowadzonych przez nas badań potwierdziły wcześniejsze obserwacje. Zapalenie płuc wystąpiło u 35% pacjentów, u których w dniu przyjęcia nie obserwowano objawów zakażenia. Największy wzrost liczby zachorowań odnotowano w pierwszych 10 dniach leczenia oddechem zastępczym. Po tym czasie zapalenie płuc występowało u 19% chorych objętych badaniem. Podobne spostrzeżenia opisali Iregui i wsp. W swoich badaniach wykazali, że zapalenie płuc występowało najczęściej w pierwszych dwóch tygodniach sztucznej wentylacji i zostało w tym czasie rozpoznane u 6,5% pacjentów [16]. Natomiast po 30 dniach leczenia 28% pacjentów rozwinęło VAP. Z kolei Richardson i wsp. podają, że już po pierwszej dobie sztucznej wentylacji VAP występuje u 5% chorych, a po miesiącu leczenia – u 68,8% chorych [17]. Różnice w opisywanej przez różnych autorów liczbie chorych, którzy rozwinęli zakażenie, korelują z charakterem oddziału i ciężkością stanu klinicznego pacjentów [6, 16, 17]. Szereg czynników ryzyka, związanych bezpośrednio z pacjentem wpływa na możliwość wystąpienia i ciężkość przebiegu zakażenia [2, 3, 6, 10]. W grupie pacjentów objętych naszym badaniem blisko 80% stanowiły niemowlęta, a co 5 dziecko przyjęte było na oddział z powodu wcześniactwa, a zatem byli to pacjenci szczególnie podatni na zakażenia ze względu na niedojrzałość układu odpornościowego.
U wcześniaków dodatkowym czynnikiem predysponującym do zakażeń jest niedojrzałość i w konsekwencji – niewydolność wielu układów oraz niedostateczne stężenie immunoglobuliny IgG, której przechodzenie przez łożysko znacznie wzrasta w ostatnim okresie ciąży [18]. Również choroba podstawowa pacjenta jest czynnikiem usposabiającym do wystąpienia zakażenia. Wady serca oraz inne choroby przebiegające z zaburzeniami krążeniowo-oddechowymi sprzyjają występowaniu zakażeń dolnych dróg oddechowych [3, 17]. Jak wykazały badania Ibrahima i wsp., u chorych leczonych oddechem zastępczym, u których występowały te nieprawidłowości, częściej dochodziło do rozwoju VAP [19]. Co trzeci pacjent objęty naszym badaniem miał wadę serca i w tej grupie najczęściej występowało zapalenie płuc.
Etiologia VAP zasadniczo różni się w pierwszych 96 godzinach hospitalizacji od etiologii zakażenia, które występuje po dłuższym pobycie pacjenta w szpitalu. W ocenie wielu autorów za szpitalne zapalenie płuc w pierwszych dniach hospitalizacji zwykle odpowiedzialne są ziarenkowce Gram-dodatnie i Haemophilus, a w mniejszym stopniu pałeczki Gram-ujemne [1, 8, 9, 11]. Natomiast w późniejszym okresie dominują pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae oraz pałeczki niefermentujące. Wyniki naszych badań nie wykazały istnienia tak wyraźnej różnicy w etiologii zakażeń występujących w różnych okresach hospitalizacji, co najprawdopodobniej wynikało z faktu, iż 90% pacjentów przyjętych zostało bezpośrednio z innego szpitala lub z innego oddziału, a więc byli już skolonizowani florą szpitalną.
Wysoka oporność na antybiotyki szczepów szpitalnych, którymi kolonizują się pacjenci, stwarza poważne problemy w leczeniu VAP [8, 20]. Wyniki naszych badań wykazały, że zaledwie połowa izolowanych z popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych pałeczek z rodziny Enterobacteriacae była wrażliwa na cefalosporyny III generacji, a blisko 70% szczepów pałeczek niefermentujących wykazywała oporność na imipenem. Trudności w planowaniu terapii empirycznej wynikają z faktu, iż większość pacjentów przed przyjęciem do oddziału była leczona antybiotykami [17, 20]. Analiza badań Rello i wsp. wykazała, że u pacjentów, którzy otrzymywali antybiotyki przed przyjęciem do szpitala częściej za zapalenie płuc odpowiedzialne były pałeczki Gram-ujemne, w szczególności Pseudomonas aeruginosa i częściej zakażenia wywoływane były przez szczepy oporne na wiele antybiotyków [20]. Spośród pacjentów objętych naszym badaniem aż 40 (93%) otrzymywało antybiotyki w dniu przyjęcia do oddziału, w tym 25 pacjentów otrzymywało 2 lub 3 antybiotyki. Konsekwencją takiej sytuacji była wysoka oporność na antybiotyki bakterii izolowanych od pacjentów przyjmowanych do oddziału.
Badania bakteriologiczne, które wykonywane są u pacjentów w dniu przyjęcia pozwalają wykryć kolonizację niebezpiecznymi patogenami i podjąć działania zapobiegające ich przeniesieniu na innych pacjentów [9, 11, 12]. Prowadzone przez nas typowanie genetyczne ujawniło, że niestety działania te nie były wystarczająco skuteczne i szczepy były przenoszone pomiędzy pacjentami (ryc. 4, 5). Spośród 15 pacjentów, którzy rozwinęli VAP, w 14 przypadkach czynnikami etiologicznymi były bakterie, którymi pacjenci skolonizowali się na oddziale. Tylko w jednym przypadku zakażenie wywołane zostało przez pałeczki Klebsiella, które wykryto w dniu przyjęcia na błonach śluzowych gardła i przewodu pokarmowego pacjenta (ryc. 5, pacjent 1). Typowanie genetyczne wykazało iż był to szczep identyczny z izolowanymi od innych pacjentów, zatem były to również bakterie szpitalne, którymi pacjent skolonizował się na innym oddziale.
Z analizy epidemiologicznej wynika, iż głównym problemem w oddziale intensywnej terapii naszego szpitala są wtórne zakażenia endogenne, za które odpowiedzialne są endemiczne szczepy szpitalne. Przemawiają za tym wyniki typowania genetycznego, w którym pałeczki Klebsiella i Pseudomonas, izolowane od różnych pacjentów mają identyczne wzory restrykcyjne.
W wielu szpitalach poważny problem stanowią wielooporne szczepy endemiczne, które są odpowiedzialne za powikłania hospitalizacji [8]. Mogą one zagrozić powodzeniu leczenia, a nawet życiu pacjenta. Konsekwencją przenoszenia bakterii między pacjentami (zakażenia krzyżowe) i rozprzestrzeniania się zakażeń wywoływanych przez szczepy klonalne jest narastająca oporność na antybiotyki w środowisku danego szpitala [8, 13]. Zapobieganie kolonizacji pacjenta, do której dochodzi najczęściej przy czynnościach pielęgnacyjnych, jest równie ważne jak zapobieganie zakażeniom krzyżowym [8, 11].
Ochrona pacjenta przed kolonizacją florą szpitalną jest niezwykle trudnym zadaniem. Jak podaje Lode, pomimo przestrzegania higieny przy pielęgnacji pacjenta i stosowania w szpitalu zasad racjonalnej antybiotykoterapii, około 70-90% pacjentów leczonych oddechem zastępczym kolonizuje się florą szpitalną w pierwszym tygodniu hospitalizacji [4]. Po dwóch tygodniach pobytu w oddziale u większości pacjentów dochodzi do rozwoju jednego lub więcej rodzajów zakażeń.
Nasze badania powtarzaliśmy w odstępach tygodniowych. Nie możemy zatem jednoznacznie stwierdzić, że w pierwszym etapie dochodziło do kolonizacji błon śluzowych, a następnie – do rozwoju VAP. W materiale pobieranym z gardła, lub odbytu oraz w popłuczynach pęcherzykowo-oskrzelowych równocześnie wykrywaliśmy obecność takich samych drobnoustrojów. Niemniej i taka informacja może być przydatna w praktyce klinicznej. Jak wykazano, kolonizacja błon śluzowych florą odpowiedzialną za VAP sprzyja występowaniu nawracających zapaleń płuc [1, 4, 16].
W naszych badaniach wydzielinę z dolnych dróg oddechowych uzyskiwaliśmy techniką niebronchoskopową, która w ostatnich latach budzi coraz większe uznanie na świecie [1]. Wielu autorów porównując technikę bronchoskopową i niebronchoskopową uznało, iż wyniki uzyskane w obu metodach cechuje zbliżona wiarygodność i powtarzalność. Pobieranie popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelowych techniką niebronchoskopową jest metodą prostszą w wykonaniu, tańszą, mniej obciążającą dla pacjenta. Może być z powodzeniem stosowana w rutynowej diagnostyce do uzyskiwania materiału z dolnych dróg oddechowych u pacjentów z podejrzeniem wentylacyjnego zapalenia płuc.
WNIOSKI
Wyniki naszych badań wskazują na istnienie związku pomiędzy rozwojem wentylacyjnego zapalenia płuc, a kolonizacją błon śluzowych przewodu pokarmowego i górnych dróg oddechowych pacjentów intensywnej terapii florą potencjalnie patogenną.
Piśmiennictwo
1. Flanagan PG:Diagnosis of ventilator-associated pneumonia. J Hosp Infect 1999; 41: 87-99.
2. Kollef MH:The prevention of ventilator-associated pneumonia. New Engl J Med 1999; 340: 627-634.
3. Nieuwenhoven CA, Bergmans D, Bonten M: Ventilator--associated pneumonia: risk factors and patient mortality. Hosp Med 1999; 60: 558-562.
4. Lode HM, Schoberg T, Raffenberg M, Mauch H: Nosocomial pneumonia in the critical care unit. Crit Care Clin 1998; 14: 119-133.
5. CDC: Guidelines for Prevention of Nosocomial Pneumonia. MMWR 1997; 46: 1-79.
6. Takano Y:Prognostic factors on nosocomial pneumonia in general wards: a prospective multivariate analysis in Japan. Respir Med 2002; 96: 18-23.
7. Ibrahim EH, Wards S, Sherman G, Schaiff R, Fraser VJ, Kollef MH:Experience with a clinical guideline for the treatment of ventilator-associated pneumonia. Crit Care Med 2001; 29: 1109-1115.
8. Sintchenko V, Iredell JR, Gilbert GL: Antibiotic therapy of ventilator-associated pneumonia – a reappraisal of rationale in the era of bacterial resistance. Intern J Antimicrob Ag 2001; 18: 223-229.
9. Silvestri L, Monti Bragadin C, Milanese M, Gregori D, Consales C, Gullo A, van Saene HK:Are most ICU infections really nosocomial? A prospective observational cohort study in mechanically ventilated patients. J Hosp Infect 1999; 42: 125-133.
10. Vanhems PI, Lepape A, Savey A, Jaubou P, Fabry J: Nosocomial pulmonary infection by antimicrobial-resistant bacteria of patients hospitalised in intensive care units: risk factors and survival. J Hosp Infect 2000; 45: 98-106.
11. Saene FHK, Damjanovic V, Alcock SR: Basics in microbiology for the patient requiring intensive care. Curr Anaesth Crit Care 2001; 12: 6.
12. Bouletreau A, Dettenkofer M, Forster DH, Babikir R, Hauer T, Schullgen G, Daschner FD:Comparison of effectiveness and required time of two surveillance methods in intensive care unit. J Hosp Infect 1999; 41: 281-289.
13. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH, Swaminathan B:Interpreting chromosomal DNA restrictrion patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233-2239.
14. NCCLS. Methods for dilution for antimicrobial susceptibility testing. Supplemental tables, M 100-S; in: Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2001.
15. Vincent JL, Bihari DJ, Suter MP: The prevalence of nosocomial infection in intensive care units in Europe. JAMA 1995; 23/30: 639-644.
16. Iregui MG, Kollef MH: Ventilator-associated pneumonia complicating the acute respiratory distress syndrom. Respir Crit Care Med 2001; 22: 317-325.
17. Richardson CJ, Rodriguez LJ: Identification of patients at highest risk for ventilator-associated pneumonia in the intensive care unit. Am J Surg 2000; 79, Suppl. 2A: 8-11.
18. Papierkowski A: Choroby wieku rozwojowego. PZWL 1982.
19. Ibrahim EH, Tracy L, Hill C: The occurrence of ventilator-associated pneumonia in a community hospital. Chest 2001; 120: 555-561.
20. Rello J, Jubert P, Valles J, Artigas A, Rue M, Niederman MS: Evaluation of outcome for intubated patients with pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa. Clin Infect Dis 1996; 23: 973-978.
Adres do korespondencji:
Zakład Mikrobiologii IPCZD<
Al. Dzieci Polskich 20<
04-730 Warszawa

Anestezjologia Intensywna Terapia 1/2003

Pozostałe artykuły z numeru 1/2003: