Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Nowa Medycyna 3/1999, s. 10-14
Krzysztof Pastewka, Ewa Skopińska-Różewska
Angiogeneza w raku nerki
Advances in angiogenesis research in renal cell carcinoma
z Kliniki Urologii CMKP w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. Andrzej Borówka
z Zakładu Immunologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. med. Ewa Skopińska-Różewska
Zjawisko angiogenezy
Neowaskularyzacja (angiogeneza) jest jednym z głównych czynników decydujących o szerzeniu się rozrostu nowotworowego. Poznanie mechanizmów angiogenezy i wykrycie substancji antyangiogennych może stworzyć podstawy skutecznego leczenia chorób nowotworowych, szczególnie zaś ograniczenia inwazyjności nowotworów. Nadal jednak wiele pytań jakie się nasuwają podczas poznawania tego zjawiska pozostaje bez odpowiedzi. Równowaga mająca miejsce pomiędzy apoptozą (fizjologiczną śmiercią komórki) a proliferacją czyli wzrostem komórkowym może być zaburzona przez angiogenezę (7). O`Reilly i wsp. wykazali, że poprzez hamowanie angiogenezy wydłuża się faza spoczynkowa w cyklu komórkowym. Tym samym wstrzymywana jest proliferacja komórek nowotworowych (9). Czy jednak angiogeneza jest wtórnym procesem czy pierwotnym tego dotychczas nie udało się wyjaśnić.
Wiadomo, że proces rozrostowy nie jest jedynym czynnikiem wywołującym waskularyzację. Dochodzi do niej w życiu embrionalnym (organogeneza), podczas gojenia ran, odnowy endometrium. Badając procesy patologiczne wykazano nasiloną angiogenezę nie tylko w rozroście nowotworowym, ale także w chorobach reumatoidalnych, w łuszczycy, retinopatii, kolagenozach (5). Fakty te świadczą iż u podstaw zjawiska leżą reakcje uzależnione od substancji o działaniu miejscowym (cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu). Powstają one prawdopodobnie w wielu klinicznie odległych od siebie procesach patologicznych. Sam proces angiogenezy odbywający się na bazie istniejącego naczynia polega w pierwszej fazie na rozluźnieniu połączeń międzykomórkowych, uszkodzeniu błony podstawnej naczynia i w efekcie migracji komórek śródbłonka. Wzrost kapilar na długość odbywa się na drodze proliferacji komorek endothelium. Następnie tworzy się światło naczynia poprzez rozsunięcie się komórek śródbłonka. Na końcu dochodzi do dojrzewania nowego naczynia (ryc. 1).
Ryc. 1.
Modulatory angiogenezy
Poszczególne etapy angiogenezy są regulowane przez czynniki endogenne najczęściej produkowane przez same komórki nowotworowe, komórki tkanki łącznej, komórki układu odpornościowgo (cytokiny, czynniki wzrostowe) (tab. 1). Ich działanie polega głównie na aktywacji proteaz (kolagenaz, gelatynaz), które odpowiedzialne są za degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (Extracellularl Matrix, ECM) oraz białek błony podstawnej jak również na pobudzeniu proliferacji i migracji komórek śródbłonka.
Tabela 1. Ważniejsze czynniki modulujące angiogenezę.
Czynniki stymulujace angiogenezęCzynniki hamujące angiogenezę
- VEGF (vascular endothelial growth factor)
- AFGF (acidic fibroblast growth factor)
- BFGF (basic fibroblast growth factor)
- EGF (epidermal growth factor)
- Angiogena, angiopoetina
- Fibryna, heparynazy
- TF (tissue factor), IL - 4, IL - 8
- Prostaglandyny E1, E2, heparyna
- TGF alfa, beta (transforming growth factor alfa, beta)
- BCAF (bladder cancer angiogenic factor),
- Placental GF
- Angiostatyna, Endostatyna
- Sterydy, Trombosponyna, IL-12
- IFN alfa, beta (interferon alfa, beta)
- PF4 (czynnik płytkowy 4)
- TIMPs tkankowe czynniki metaloproteaz
Niektóre czynniki egzogenne hamujące angiogenezę:
- TPN-470, AGM-1470 (pochodna fumigiliny)*
- CAI (carboxyamido triazole)*
- PPS (pentosan pentosulfate)**
- MTP (maltose tetrapalmitate)**
- Leki hormonalne**
- Synthetic retinoid fenretinide**
- Talidomid
* badano w raku nerki;
** badano w raku stercza.

W fazie prób klinicznych znajduje się wiele substancji egzogennych w tym leków hamujących neowaskularyzację, co może mieć znaczenie w przyszłościowej terapii nowotworów (tab. 1). Klinicyści zainteresowani są nie tylko inhibitorami angiogenezy, których działanie można by wykorzystywać w onkologii ale również lekami proangiogennymi. Ich zastosowanie w leczeniu między innymi choroby wieńcowej czy innych chorób niedokrwiennych miałoby bardzo duże znaczenie.
Metody badania angiogenezy
Angiogenezę nowotworową bada się określając gęstość naczyniową (microvessel density – MVD) w guzach. Identyfikację naczyń w preparatach z guzów nowotworowych ułatwiają reakcje histochemiczne przy pomocy licznych przeciwciał reagujących ze składnikami śródbłonków. W przypadku raka nerki MVD jest większa niż w zdrowej tkance i wynosi 30-70 naczyń na pole widzenia w powiększeniu 200-krotnym (19). Wysuwa się przypuszczenie o prognostycznym znaczeniu MVD. Gęstość siatki naczyniowej jest większa w zaawansowanym stadium choroby z przerzutami (19).
Oprócz oceny gęstości naczyniowej (ocena statyczna), można śledzić dynamikę procesu na wielu modelach tkankowych i podłożach fizjologicznych (testy rogówkowe, skórne, błona kosmówkowo-omoczniowa zarodka kurzego, żele fizjologiczne) wywołując angiogenezę poprzez wszczepienie komórek nowotworowych (ryc. 2). Na modelach badania potencjału angiogennego określa się możliwość wytwarzania nowych naczyń krwionośnych. Naczynia powstające pod wpływem wszczepienia tkanki nowotworowej muszą spełniać kryteria podane przez Sidky, Auerbacha w 1975 roku, aby można je było uznać za naczynia wytworzone pod wpływem implantacji tkanki indukującej waskularyzację. Brane są pod uwagę między innymi: kształt, wielkość, średnica naczynia oraz kierunek proliferacji do punktu wstrzyknięcia (ryc. 2). Na tej podstawie obliczając liczbę naczyń można wysnuć podstawowe wnioski o potencjale angiogennym badanej tkanki. Odczytu wyników angiogenezy dokonuje się metodami tradycyjnymi w mikroskopie operacyjnym. Aktualnie opracowywane są metody liczenia naczyń polegające na komputerowej analizie obrazu mikroskopowego.
Ryc. 2. a) obraz angiogenezy nowotworowej uzyskany na błonie kosmówkowo omoczniowej zarodka kurzego. Widoczna jest gęstsza sieć naczyniowa zbiegająca się ku miejscu podania substancji proangiogennej; b) porównanie obrazu w którym nie widać wzbudzenia angiogennego (wg Jones BJU International., 1999, 83, 535).
Wykonując testy dynamiczne ocenia się wpływ czynników modulujących neowaskularyzację (substancji endogennych i egzogennych, między innymi leków wpływających na angiogenezę). O istnieniu preparatów farmakologicznych wpływających hamująco na angiogenezę przekonano się w latach sześćdziesiatych podczas stosowania Talidomidu, leku nasennego hamującego organogenezę embrionalną. Lek powodował między innymi niedorozwój kończyn. Obecnie intensywnie poszukuje się substancji modulujących neowaskularyzację, mając nadzieję na kliniczne zastosowanie preparatów mogących wpływać na wzrost guzów nowotworowych. Badając wpływ środków farmakologicznych, hormonów, enzymów i innych substancji na dynamikę wzrostu lub regresję guza poprzez modulowanie angiogenezy wykorzystuje się zwierzęce modele in vivo wszczepiając im czyste linie komórkowe guza nowotworowego. Dynamikę wzrostu tak hodowanych guzów śledzi się podając zwierzętom środki modulujące.
Angiogeneza w raku nerki
W okresie płodowym proces waskularyzacji rozwijającej się nerki jest najprawdopodobniej sterowany przez zarodkowy nerkopochodny czynnik naczyniotwórczy (embrionic kidney-derived angiogenesis factor), który pobudza proliferację naczyń kapilarnych. Nerka dojrzała natomiast nie wykazuje właściwości naczyniotwórczych, można więc przypuszczać, że znajduje się w niej jakiś czynnik blokujący angiogenezę (2). Rak nerki jest nowotworem o wysokim potencjale angiogennym o czym świadczą doniesienia badań gęstości naczyniowej (MVD). Bezpośrednia ocena siatki naczyniowej w preparatach histologicznych raka nerki (metodami immunohistochemicznymi) wykazuje podwyższoną gęstość angiogenną (vessel density) w zależności od stopnia zaawansowania guza. Niektórzy widzą znaczenie rokownicze tych pomiarów (19). W raku o małym stopniu zaawansowania T1-2N0M0 liczba naczyń krwionośnych powyżej 30 w mm3 łączyła się z gorszym rokowaniem. Nie brak prac negujących tę zależność. Jest to prawdopodobnie spowodowane brakiem standaryzacji techniki immunohistochemicznej, stosowania różnych rodzajów przeciwciał oraz różnorodnością guzów nerek pod względem typów histologicznych. W Polsce do 1994 roku badania siatki naczyniowej w guzie nerki przeprowadzał Bugajski. Sfotografował w mikroskopie elektronowym gęstą sieć naczyniową guzów nerek wraz z siecią naczyń wytworzonych w procesie neoangiogenezy. Wyniki opublikował w pracy „System naczyniowy guza, wielkość i lokalizacja jako czynnik prognostyczny raka nerki” (2). Klinicyści pośrednio uzyskują dane o unaczynieniu guza na podstawie wysycenia tkanki środkiem cieniującym podanym podczas badań obrazowych takich jak tomografia komputerowa, rezonans magnetyczny lub poprzez badanie przepływu z wykorzystaniem zjawiska Dopplera. Stopień gęstości tomograficznej guzów nerek waha się przeciętnie od 20 do 80 jednostek Hounsfielda (HU) w zależności od obecności ognisk rozpadu. Gęstość tomograficzna guzów wzrasta po podaniu środka cieniującego tym bardziej im silniej tkanka jest unaczyniona. Podczas angiografii uwidacznia się gęstsza siatka naczyniowa guza (1). Ogniska rozpadu guza z następową martwicą, które dominują w centralnej części guza, świadczą o różnym nasileniu neowaskularyzacji w różnych punktach tej samej zmiany nowotworowej. Zjawisko jednoczesnego pobudzania i hamowania wzrostu tkanki nowotworowej, które zachodzi w różnych miejscach tego samego guza było powodem poszukiwań czynników antyangiogennych produkowanych przez guz. Badanie zależności wzrostu guza od jego masy zakończyło się odkryciem endogennych inhibitorów pochodnych kolagenu i plazminogenu o bardzo silnym działaniu wstrzymującym angiogenezę (11, 12).
W raku nerki stwierdza się obecność dwóch podstawowych cytokin proangiogennych. Pierwsza z nich to VEGF (vascular endothelial growth factor). Aktywność genu VEGF w raku nerki potwierdzono w ponad połowie przypadków (67% wg. Sato) (17). Druga cytokina bFGF (basic fibroblast growth factor) jest również aktywna w raku nerki podobnie jak w innych guzach narządowych. W raku nerki wykryto obie cytokiny podkreślając znaczenie BFGF jako czynnika obecnego w ponad 50% guzów nerek (4, 6). Niektórzy jak Fujimoto, Nanus uważają tę cytokinę za czynnik prognostyczny, którym można posługiwać się w przypadku planowanych zabiegów guza nerki metodą oszczędzającą (nephron sparing) (6, 10).
W Polsce badania nad angiogenezą nerki prowadzone są w Zakładzie Immunologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc we współpracy z Kliniką Urologii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie. Z naszych badań wynika, że komórki nowotworowe raka jasnokomórkowego nerki wykazują wyższy potencjał angiogenny (średnio 14 naczyń krwionośnych w testach skórnych na myszach typu Balb/C) w porównaniu z angiogenezą uzyskaną po wstrzyknięciu makroskopowo prawidłowej tkanki nerki oraz angiogenezą kontrolną (urazową) wywołaną wstrzyknieciem płynu fizjologicznego Parkera (ryc. 3). W badaniach potwierdzono dużą koncentrację VEGF w homogenatach guzów nerek. Obecnie prowadzone są badania wpływu hamującego niektórych leków (niesterydowe leki przeciwzapalne i ich metabolity) na angiogenezę. Niektóre z nich jak Piroxicam silnie hamują angiogenezę do poziomu porównywalnego z angiogenezą kontrolną (18). Oprócz badań nad angiogenezą guzów nerek Zakład Immunologii IGiChP przeprowadza podobne w zaawansowanych guzach pęcherza moczowego. Równolegle opracowywane są metody obiektywizacji odczytu wyników angiogenezy poprzez komputerową analizę obrazu uzyskiwanego z mikroskopu operacyjnego.
Ryc. 3. Obraz mikroskopowy doświadczalnej angiogenezy wywołanej komórkami raka nerki. Małe, kręte naczynia końcowe zostały zliczone po 72 godzinach od wstrzyknięcia śródskórnego. Obok przedstawiono przekształcony metodą cyfrową obraz mikroskopowy ułatwiający identyfikację nowych naczyń krwionośnych.
W próbach terapii antyangiogennej hamującej progresję guzów nerek próby doświadczalne wykonywano między innymi z preparatem: TNP-470 (AGM 1470). Interferon alfa i interleukina (IL-2) oraz linomide wykazujące działanie antyangiogenne stosowano w terapii raka nerki z przerzutami. Obiecujące wyniki hamowania wzrostu doświadczalnych guzów nerek przy pomocy niedawno odkrytej endostatyny i angiostatyny hamujących proliferację i chemotaksję przedstawił zespół profesora O´Reilly z Bostonu. Oba związki nie działają bezpośrednio na komórkę nowotworową, lecz silnie hamują proliferację śródbłonka (14). W roku 1994 podczas badania wpływu masy guza na jego wzrost odkryto angiostatynę (11, 12). Jest ona fragmentem plazminogenu. Zaliczana jest do endogennych czynników hamujących angiogenezę, poprzez wstrzymywanie proliferacji na skutek wydłużania fazy spoczynkowej (G0) w cyklu komórkowym (13, 14). Rekombinowana angiostatyna wpływa na regresję guzów nowotworowych badanych na modelu zwierzęcym (16). Od 1994 roku zespół z Bostonu pracuje nad hamującym proliferację komórek endotelialnych działaniem angiostatyny. Osiągnięto obiecujące wyniki w zakresie regresji zmian pierwotnych i przerzutowych (12). Endostatyna jest natomiast fragmentem kolagenu XVIII oddzielonym elastazą, który ma właściwości hamujące przerzuty nowotworowe (15). Została wykryta w podobny sposób poprzez wyizolowanie z mysich hemangioendotelioma. Endostatyna hamuje wzrost guzków satelitarnych poprzez ograniczenie migracji komórek endotelialnych. Wyprodukowano już rekombinowaną endostatynę przy pomocy kolonii bakteryjnych. W Bostonie gdzie co roku odbywa się konferencja „Therapeutic Implications and Mechanisms of Angiogenesis – Novel Therapeutic Development” w 1998 roku doniesiono o produkcji endostatyny mysiej (na bazie mysiego kolagenu) przez hodowlę drożdży (3), co prawdopodobnie rozwiąże problem produkcji endostatyny na skalę kliniczną. Endostatynę podawano systemowo myszom z modelowym guzem nerki typu jasnokomórkowego dokumentując jej aktywność porównywalną z endostatyną otrzymywaną z bakterii. Oba inhibitory hamują proliferację śródbłonka. Endostatynę stosowano również in vivo w terapii systemowej powodując prawie całkowitą blokadę angiogenezy. Endostatyna nie wywoływała objawów toksycznych i działała hamująco na komórki śródbłonka. Wszystkie dotychczas badane guzy nowotworowe (w tym guzy nerek) wykazują reakcję na wymienione nowe czynniki antyangiogenne. Dodatkowo stwierdzono niezmienny efekt działania angiostatyny pomimo przerw w jej stosowaniu co wskazuje na brak oporności w trakcie leczenia (13).
Do czynników, których wpływ na angiogenezę guza nerki badano doświadczalnie zaliczają się hormony (analogi somatostatyny, analogi LHRH, bombezyna). Na XIII Kongresie Europejskiego Towarzystawa Urologicznego w Barcelonie Andreas Jungwirth z Nowego Orleanu przedstawił wyniki znamiennej zmniejszenia masy guza doświadczalnego z 480 mm3 do 160 mm3 po 4-tygodniowej terapii (8).
Prace nad angiogenezą jak dotychczas dają obiecujące wyniki. Po wielu latach badań nad właściwościami nowotworów to właśnie w nich samych odnaleziono czynniki, które mogą ograniczyć ich rozwój. Bardzo dobre wyniki doświadczalne jakie uzyskuje się po podaniu nowych inhibitorów angiogenezy stwarzają nadzieję na ograniczenie wzrostu guza nerki. Czy jednak zastosowanie ich w klinice będzie równie skuteczne? Dla porównania należy przypomnieć, iż doświadczalne wyniki nad immunoterapią zaawansowanych guzów nerek dają dużo lepsze rezultaty niż ilość remisji klinicznych.
Piśmiennictwo
1. Borkowski A. i wsp.: Rola ultrasonografii, tomografii komputerowej i arteriografii w diagnostyce guzów nerek. Urol. Pol. 1984, 37:311. 2. Bugajski A.: System naczyniowy guza, wielkość i lokalizacja jako czynnik prognostyczny raka nerki. Urol. Pol. 1994, 47,1-2, 12-22. 3. Dhanabal M. et al.: Anti-tumor effect on renal cell carcinoma of yeast produced endostatin. Therapeutic Implications and Mechanisms of Angiogenesis – Novel Therapeutic Development Abstracts Boston 1998 Renal and Cardiology Divisions Medical Center Boston. MA 02215. 4. Duensing S. et al.: Increased serum levels of basic fibroblast growth factor (bFGF) are associated with progressive lung metastases in advanced renal cell carcinoma patients. Anticancer Research. 15(5B):2331-3, 1995 Sep-Oct. 5. Folkman J.: Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature med. 1995,1:27-31. 6. Fujimoto K. et al.: Basic fibroblast growth factor as a candidate tumor marker for renal cell carcinoma. Japanese Journal of Cancer Research. 1995, 86(2):182-6. 7. Holmgren L. et al.: Dormancy of micrometastases. Balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis supression. Nature Medicine 1995, 1:149-53. 8. Jungwirth A. et al.: Somatostatin analog RC160, LHRH antagonist Cetrorelix and bombesin antagonist RC3940-II inhibit tumor growth in RCC cell line Caki-I in vivo. XIII Congress of the EUA Abstracts march 1998 nr. 57. 9. Michael S., O´Reilly M.D.: Dormancy of malignant cancers by angiogenesis blockade 1998 IBC Conference Therapeutic Implications and Mechanisms of Angiogenesis – Novel Therapeutic Development Abstracts Boston 1998. 10. Nanus D.M. et al.: Expression of basic fibroblast growth factor in primary human renal tumors: correlation with poor survival. Journal of the National Cancer Institute. 1993 Oct 6, 85(19):1597-9. 11. O´Reilly M.S. et al.: The suppression of tumor metastases by primary tumor. 1993 Surgical Forum 44:474-6. 12. O´Reilly M.S. et al.: Angiostatin: a circulating endothelial cell inhibitor that suppresses angiogenesis and tumor growth. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1994, 59:471-82. 13. O´Reilly 1998 IBC Conference Therapeutic Implication and Mechanisms of Angiogenesis 1998, April 23-24. 14. O´Reilly M.S. et al.: Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Medicine 1996, 2:689-92. 15. O´Reilly M.S. et al.: Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth. Cell 1997, 88:277-285. 16. Sim, B.K.L. et al.: A Recombinant Murine Angiostatin Protein Inhibits Experimental Primary and Metastatic Cancer. Cancer Research 1997, 57:1329-1334. 17. Sato K., Kato T.: Cancer therapy targeting tumor-induced neovascularisation (jap). Gan to Kagaku Ryoho (Japanese Journal of Cancer & Chemiotherapy). Sato K., Terada K., Sugiyama T., Takahashi S., Saito M., Moryama M., Kakinuma H., Suzuki Y., Kato M., Kato T. Frequent overexpression of vascular endothelial growth factor gene in human renal cell carcinoma. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 18. Sommer E., Skopińska-Różewska E.: Antynowotworowe działanie niesterydowych leków przeciwzapalnych ze szczególnym uwzględnieniem sulindaku, Terapia 7/1998. 19. Yoshino S. et al.: Prognostic significance of microvessel count in low stage renal cell carcinoma. International Journal of Urology. 1995 Jul., 2(3):156-60.
Nowa Medycyna 3/1999
Strona internetowa czasopisma Nowa Medycyna