Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Medycyna 3/1999, s. 15-17
Stanisław Wroński
Przeszczepy komórek i tkanek – nowe perspektywy urologii
Cells and tissues transplantation – new perspectives of urology
z Oddziału Urologii Szpitala Wojewódzkiego im. dr. J. Biziela w Bydgoszczy
Ordynator Oddziału: dr n. med. Zdzisław Jarzemski z Regionalnego Banku Tkanek, Szpitala Wojewódzkiego im. dr. J. Biziela w Bydgoszczy
Na początku lat osiemdziesiątych rozpoczęła się jedna z najważniejszych rewolucji w historii ludzkości – rewolucja technologiczna, która zaowocowała gwałtownym rozwojem elektroniki prowadzącym do opanowania nieomal wszystkich dziedzin życia przez komputery oraz wszelkiego rodzaju nośniki i przekaźniki informacji.
Obecnie, choć być może nie w pełni zdajemy sobie z tego sprawę, tworzy się nowy przełom – rewolucja biotechnologiczna, która, jak się wydaje doprowadzi do jeszcze większych przemian niż jej poprzedniczka. W wielu laboratoriach realizowane są projekty i programy których efekty wkrótce wpłyną, choć nie wiadomo czy w sposób jednoznacznie pozytywny, na funkcjonowanie naszej cywilizacji. Przykładem jest Human Genome Project, gigantyczne dzieło realizowane w wielu instytutach na całym świecie pod kierunkiem C. Ventera.
Dziedziną biotechnologii znajdującą już teraz praktyczne zastosowanie jest hodowla komórek i tkanek. Hodowane in vitro komórki i tkanki stosowane są w transplantologii, a w przyszłości staną się jej niezastąpionym elementem. Wynika to z kilku powodów. Po pierwsze zapotrzebowanie na tkanki i narządy do przeszczepów przekracza znacznie liczbę dawców. Po drugie tkanki tworzone z komórek pacjenta nie są odrzucane jak ma to miejsce w przypadku przeszczepów allogenicznych, wgajają się szybko (wykazane to będzie na materiale własnym). Po trzecie hodowla in vitro już teraz pozwala na kształtowanie całych brakujących narządów w oczekiwanym kształcie i o wymaganych funkcjach, czego nie można było się spodziewać za pomocą innych technik.
Do chwili obecnej pierwszym przeszczepionym człowiekowi a ukształtowanym in vitro narządem jest pęcherz moczowy. Dokonał tego zespół kierowany przez A. Atalę z Uniwersytetu Harvarda. Prócz tego hodowany nabłonek urotelialny wykorzystano w zabiegach powiększania pęcherza za pomocą wstawki jelitowej pokrytej takim nabłonkiem po uprzednim usunięciu jelitowej błony śluzowej.
Od niedawna w leczeniu pacjentów oparzonych stosowany jest hodowany naskórek pacjenta. Pobrany niewielki fragment skóry dostarcza materiału do stworzenia nieomal dowolnej wielkości płata naskórka służącego do pokrywania rany w późnych etapach leczenia lub też do korekcji przerosłych blizn pooparzeniowych. Metoda ta jest też zaaprobowana przez FDA do leczenia trudno gojących się zmian skórnych (ryc. 1).
Ryc. 1. Obraz przedatawia moment położenia autologicznego naskórka hodowanego in vitro dziecku z rozległym oparzeniem obu kończyn dolnych. Wyhodowany płat widoczny jest na fotografii jako przezroczysta, biaława powierzchnia (pomiędzy dwoma strzałkami).
Wiele ośrodków naukowych prowadzi prace nad konstrukcją – gdyż wydaje się że inaczej nazwać tego nie można – kolejnych narządów. Osiągnięte wyniki oraz dalsze zamierzenia są zdumiewające dla osób nie zaangażowanych w tego typu prace, a przez wielu traktowane z niedowierzaniem. Przykładem jest hodowla kości dla pacjentów po urazach dłoni przez Ch. i J. Vacanti, zakończona skuteczną transplantacją. Obiecujące wydają się prace nad zbudowaniem naczyń krwionośnych, szczególnie tętnic. W pracach tych wyróżniają się zespoły kierowane przez F. Augera z Uniwersytetu w Quebec i J. Vacanti z Bostonu. Naczynia takie wszczepiono z sukcesem zwierzętom laboratoryjnym. Budowa tętnic z hodowanych tkanek znajduje się także w kręgu zainteresowań Banku.
Na zakończenie tego krótkiego przeglądu wspomnieć należy o prowadzonym programie budowy z hodowanych tkanek całego serca. O wadze tych badań świadczy fakt przeznaczenia na jego realizację 5 miliardów dolarów.
Dla urologów niewątpliwie najbardziej interesujące są doniesienia o konstrukcji narządów układu moczowego. Prace te podjęto w celu rozszerzenia możliwości i poprawy efektywności zabiegów rekonstrukcyjnych wad wrodzonych pęcherza moczowego. Niektóre powikłania enterocystoplastyki jak zaburzenia metaboliczne, produkcja śluzu przez wstawkę jelitową oraz pewne ryzyko rozwoju nowotworu w obrębie wstawki wynikają z różnic strukturalnych i funkcjonalnych nabłonka dróg moczowych i nabłonka jelitowego. Jak się wydaje, niedogodności te można ominąć stosując deepitelializowany segment jelitowy, wtórnie pokryty nabłonkiem urotelialnym wyhodowanym in vitro z komórek pobranych od danego pacjenta. Zabiegi takie wykonane m.in. w Niemczech i USA zakończyły się pełnym sukcesem. Kolejnym celem chirurgii rekonstrukcyjnej stało się stworzenie pęcherza moczowego w pełni złożonego z hodowanych tkanek. Badania takie prowadzone są przez czołowe laboratoria, natomiast największe efekty osiągnięte zostały przez A. Atalę z Uniwersytetu Harvarda. Kierowany przez niego zespół przeszczepił wyhodowany narząd kilkuletniemu chłopcu z wynicowaniem pęcherza moczowego. Zakończony pełnym sukcesem zabieg spowodował iż FDA wydała zgodę na wykonanie dalszych 30 takich zabiegów u chorych dzieci. Proces hodowli tkanek pęcherza jest taki sam jak hodowli ściany cewki moczowej a różnica polega na użytym rusztowaniu na którym rosną hodowane komórki.
Regionalny Bank Tkanek działający w strukturach Wojewódzkiego Szpitala im. dr. J. Biziela w Bydgoszczy prowadzi działalność w zakresie konserwacji i bankowania tkanek w celu przeszczepów a także zajmuje się hodowlą komórek i tkanek. Główna aktywność skierowana jest na konserwację skóry pobieranej ze zwłok a używanej do leczenia ciężko poparzonych pacjentów oraz hodowlę autologicznego naskórka do leczenia poważnych powikłań jakimi są przerosłe, ograniczające ruchomość kończyn blizny. Obraz mikroskopowy wyhodowanej in vitro i przeszczepionej skóry prezentuje poniższa fotografia. Przedstawia ona obraz bioptatu pobranego 4 miesiące od położenia autologicznej skóry dziecku po uprzednim usunięciu przerosłych blizn. Widoczny jest wielowarstwowy nakórek soplami wrastający w kierunku głębszych tkanek, uformowana palisadowata warstwa rozrodcza a także widoczne jest rogowacenie i złuszczanie powierzchni. Świadczy to o tym, że przeszczepiona hodowana skóra żyje oraz namnaża się. Zrozumiały jest brak gruczołów potowych, łojowych i mieszków włosowych (ryc. 2).
Ryc. 2. Obraz mikroskopowy bioptatu pobranego 4 miesiące po położeniu autologicznego naskórka hodowanego in vitro. Widoczna jest palisadowata warstwa rozrodcza, kilkuwarstwowy (choć jeszcze nieregularny) układ warstw komórek oraz rogowacenie i złuszczanie powierzchni. Naskórek soplami wrasta do skóry właściwej. Po stronie lewej widoczne jest ognisko ziarniny zapalnej.
Doświadczenia uzyskane dzięki hodowli skóry a także innych komórek i tkanek pozwoliły o pokuszenie się o konstrukcję innych niż skóra narządów. Pomocną była także współpraca i wymiana doświadczeń z czołowymi ośrodkami zagranicznymi. W pracy nad hodowlą tkanek istotnym dopingiem jest swoisty wyścig w celu osiągnięcia wyników, co najmniej tak dobrych jak inne laboratoria. Wydaje się, że jeżeli chodzi o hodowlę skóry, urotelium, komórek tkanki łącznej, pracownia nasza dorównuje laboratoriom zagranicznym. Istniejące wyposażenie pozwala na prowadzenie dalszych prac, m.in. hodowlę wspomnianych powyżej naczyń. Nad zagadnieniem tym pracują także inne, zaprzyjaźnione ośrodki i w chwili obecnej trudna jest ocena, który pomysł okaże się być najefektywniejszy.
Zagadnienie odtworzenia in vitro ściany narządów układu moczowego interesowało nas od dawna, choć ciekawszym wydawało się protezowanie, za pomocą autologicznych tkanek, brakujących fragmentów moczowodu. Konieczność odtwarzania uszkodzonych odcinków cewki moczowej spowodowała zmianę pierwotnych zamierzeń. Próby laboratoryjne nad możliwością adaptacji urotelium, tkanki łącznej oraz elementów tkanki mięśniowej namnażanych poza organizmem przeprowadzone zostały na myszach, którym przeszczepiono tkanki ksenogeniczne. Co ciekawe wielokrotnie pasażowane komórki nie wywoływały u biorcy reakcji odrzucania. Wyjaśnienie takiego zjawiska przekracza ramy tego przeglądu, choć jak sądzę stanowić może interesujące zagadnienie transplanologiczne.
Pierwszy zabieg przeszczepienia odtworzonej in vitro ściany cewki moczowej wykonany został w Polsce u 20-letniego pacjenta, u którego na skutek urazu komunikacyjnego, w trakcie złamania miednicy doszło do uszkodzenia cewki moczowej w części błoniastej. Ze względu na fakt iż zastosowane metody operacyjne nie doprowadziły do uzyskania drożności cewki, zapadła decyzja o odtworzeniu brakującego odcinka na drodze hodowli tkankowej. Szczegółowy opis hodowli komórek i tkanek potrzebnych do odtworzenia ściany może być interesujący raczej dla czytelnika pism zajmujących się biotechnologią, dlatego też przedstawiono jedynie ogólny jej zarys.
Fibroblasty, które posłużyły do odtworzenia warstwy zewnętrznej uzyskane zostały z bioptatu skóry pacjenta. Komórki urotelium otrzymane zostały z błony śluzowej pęcherza moczowego, w podobny sposób pobrane były komórki mięśniowe. Metody hodowli fibroblastów oraz miocytów są w ogólnym rysie zbliżone. Uzyskuje się je z bioptatów tkanek poprzez wymigrowanie stosunkowo niewielkiej liczby komórek będących pierwotną populacją, z której w ciągu kilku tygodni, po kolejnych pasażach, pozwalających na uzyskanie potrzebnej liczby komórek, tworzy się jednolitą warstwę nowej tkanki.
Hodowla komórek urotelium, zbliżona jest do hodowli komórek epidermalnych.
Miocyty gładkie i komórki urotelium wchodzące w skład nowo utworzonej „pseudocewki” cechują się małą dynamiką namnażania, dlatego też one właśnie determinują długi, bo ok. 5-tygodniowy czas trwania całej procedury. Hodowla przebiega w specjalnych naczyniach, umieszczanych w inkubatorach ze stale monitorowaną temperaturą i składem wewnętrznej atmosfery. Naczynia te wypełnione są płynem odżywczym, o ściśle ustalonym, odmiennym dla różnych komórek składzie. Płyn ten wymieniany jest co ok. 3 dni, zależnie od zmian jego pH. W końcowym etapie naczynia te są rozcinane i nowo utworzona tkanka „odklejana” jest za pomocą kąpieli enzymatycznej od podłoża. Otrzymuje się delikatne płaty tkanek wymagające bardzo ostrożnego przeniesienia na podłoże stanowiące ich nośnik i rusztowanie odtwarzanej ściany. Kolejne warstwy klejone są klejem fibrynowym.
Wszczepiony odcinek cewki wygoił się bez powikłań. Po usunięciu cewnika pęcherzowego pacjent po raz pierwszy od roku oddał mocz drogą naturalną. Uretrocystoskopia wykonana po 5 miesiącach od zabiegu nie wykazała cech nawrotu zwężenia czy też bliznowacenia. Co więcej, wgojenie się nowej tkanki jest tak dobre iż zlokalizowanie miejsca przeszczepu nastręcza pewne trudności, gdyż makroskopowy wygląd błony śluzowej ściany „naturalnej” i wszczepionej jest taki sam, a dyskretne różnice dotyczą rysunku naczyniowego. Nowa ściana ma naczynia drobniejsze, o gęstszej sieci. Podobny obraz spotykamy także w miejscu wgojenia się płatów skóry hodowanej in vitro. Wyżej opisana uretroskopia jest sfilmowana w celu uzupełnienia dokumentacji procedury.
W chwili przygotowywania powyższego przeglądu (IV 1999) trwa hodowla tkanek dla kolejnego pacjenta (ryc. 3-10).
Ryc. 3. Naczynie służące do hodowli tkanek. Dno pokryte jest warstwą nowo utworzonego urotelium widocznego na zdjęciu w postaci mlecznobiałej pokrywy dna. W prawym dolnym rogu płyn hodowlany o różowym zabarwieniu.
Ryc. 4. Pojedyncze fibroblasty otrzymane ze skóry pacjenta (1 tydzień wzrostu).
Ryc. 5. 2 tydzień hodowli fibroblastów – komórki zaczynają się łączyć, przybierają swój typowy kształt (jest to obraz przed kolejnym pasażem).
Ryc. 6. Jednolita warstwa komórek tkanki łącznej – sformowana warstwa mogąca służyć do utworzenia zewnętrznej ściany np. cewki lub naczynia (5-6 tydzień hodowli).
Ryc. 7. Pierwsza doba hodowli. Strzałki wskazują nieliczne komórki urotelium zgrupowane na tzw. komórkach odżywczych.
Ryc. 8. Wyspa komórek urotelium (koniec 2 tygodnia hodowli).Widoczne komórki odżywcze zepchnięte na obwód.
Ryc. 9. Komórki urotelium. Rozmaz barwiony w celu potwierdzenia jednolitego charakteru hodowli (reakcja z przeciwciałami przeciw cytokeratynowymi).
Ryc. 10. Uformowana, jednolita warstwa komórek urotelialnych, (nabłonek paraurotelialny). Po odklejeniu od podłoża tworzy płat który przenoszony jest na podłoże.
Nowa Medycyna 3/1999
Strona internetowa czasopisma Nowa Medycyna