Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Medycyna 6/1999, s. 5-6
Piotr Marianowski
Molekularne aspekty procesu zapłodnienia
Molecular aspects of the process of fertilization
z I Katedry i Kliniki Położnictwa i Ginekologii Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Katedry i Kliniki: prof. dr hab. n. med. Longin Marianowski
Streszczenie
Mammalian fertilization is a complex process in which sperm and egg participate in a series of ordered steps that culminate in formation of a zygote and development of a new individual. During the past two decades a great deal of progress has been made toward establishing a „molecular pathway” for fertilization in mammals, including the sperm acrosome reaction, fusion of acrosome-reacted sperm with egg plasma membrane, the egg cortical reaction and zona reaction.
Gotowa do zapłodnienia komórka jajowa jest oocytem II rzędu zahamowanym w stadium metafazy II podziału redukcyjnego czyli haploidalną komórką z I ciałkiem kierunkowym. Wraz z silnie rozbudowanym wzgórkiem jajonośnym, składającym się z komórek ziarnistych oraz bezpośrednio przylegających do osłonki przejrzystej komórek wieńca promienistego oocyt II rzędu wchodzi w skład kompleksu wzgórek jajonośny-oocyt (ang. OCC – cumulus oophorus-oocyte complex). Przestrzeń pomiędzy komórkami ziarnistymi wypełnia macierz pozakomórkowa (ECM – extracellular matrix). W wyniku owulacyjnego wzrostu poziomu gonadotropin przysadkowych dochodzi do zwiększenia objętości komórek wzgórka jajonośnego. Zachodzi proces tzw. ześluzowacenia (ang. mucification) macierzy pozakomórkowej. Jest on głównie związany ze wzmożoną syntezą kwasu hialuronowego przez komórki ziarniste.
Otaczająca komórkę jajową osłonka przejrzysta (ZP – zona pellucida) spełnia w procesie zapłodnienia trzy zasadnicze funkcje: zapobiega zapłodnieniu międzygatunkowemu, wiąże plemnik i indukuje reakcję akrosomową a zmodyfikowana po zapłodnieniu stanowi barierę dla plemników. Osłonka przejrzysta zbudowana jest z glikoprotein, z których dotychczas najlepiej poznano trzy: ZP1, ZP2 i ZP3. ZP3 jest właściwym receptorem dla plemników, które nie uległy reakcji akrosomowej zaś ZP2 stabilizuje wiązanie po jej ukończeniu.
Przed penetracją do komórki jajowej plemnik musi przejść dwa niezbędne procesy aktywacyjne, kapacytację i reakcję akrosomową. Kapacytacja, czyli tzw. proces nabywania zdolności do zapłodnienia, stanowi ostateczny etap dojrzewania plemników, zachodzi podczas wędrówki ejakulowanych plemników przez żeńskie drogi rodne. Czas konieczny do przeprowadzenia tego procesu jest różny u różnych gatunków, np. u człowieka – ok. 6 h, u myszy – mniej niż 1 h. Pod wpływem hydrolaz dróg rodnych z błony plemnika usuwane są sialoglikoproteiny i sulfoglicerolipidy, nałożone podczas dojrzewania w najądrzu. Usunięcie tych cząsteczek powoduje odsłonięcie enzymów zlokalizowanych w błonie cytoplazmatycznej okrywającej akrosom. Najlepiej udokumentowanymi wykładnikami morfologicznymi kapacytacji jest utrata cholesterolu i przemieszczanie się receptorów mannozowych w okolice akrosomu. Zjawiskiem czynnościowym towarzyszącym temu procesowi jest hiperaktywacja plemników. Charakterystyczne cechy hiperaktywacji to utrata postępowego charakteru ruchu z towarzyszącymi, gwałtownymi zmianami kierunku oraz dużą amplitudą bocznych wychyleń główki. W warunkach in vitro do kapacytacji dochodzi pod wpływem kontaktu plemnika z wzgórkiem jajonośnym lub płynem pęcherzykowym.
Ostatnim etapem aktywacji plemnika jest reakcja akrosomowa. Akrosom jest pęcherzykiem otaczającym jądro znajdujące się w przedniej części główki plemnika (6, 15). Część błony akrosomu znajdująca się w bezpośrednim sąsiedztwie błony cytoplazmatycznej plemnika jest nazywana zewnętrzną błoną akrosomu, natomiast warstwa otaczająca jądro – wewnętrzną błoną akrosomu. Reakcja akrosomowa polega na fuzji błony cytoplazmatycznej z zewnętrzną błoną akrosomu z wytworzeniem licznych pęcherzyków. Reakcję akrosomową inicjuje wiązanie plemnika z białkiem ZP3, spełniającym rolę receptora na osłonce przejrzystej (1, 2, 5, 13). Uwolnione enzymy: hialuronidaza, neuraminidaza, fosfataza kwaśna oraz akrozyna umożliwiają transport plemnika przez macierz pozakomórkową otaczającą oocyt oraz służą do trawienia osłonki przejrzystej. Odsłonięcie wewnętrznej błony akrosomu pozwala na uwidocznienie białka PH20 wiążącego się z receptorem ZP2 osłonki przejrzystej.
Stymulacja receptora ZP3 uaktywnia reakcję białka G. Istnieje prawdopodobieństwo, że rolę przekaźnika spełnia również drugie białko, Gq/11 (12). Następuje również aktywacja kanałów wapniowych typu T (1, 8). Połączenie z ZP3 powoduje depolaryzację błony plemnika (z -60 mV do -30 mV), wnikanie jonów pozakomórkowego wapnia czego rezultatem jest wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego wapnia. Jest to warunek sine qua non dla prawidłowego przebiegu reakcji akrosomowej. W warunkach in vitro reakcję akrosomową można wywołać przy pomocy jonoforu A23187 czyli substancji ułatwiającej transport wapnia przez błonę komórkową (4).
Analiza plemników w kolejnych etapach aktywacji wykazała, że stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia wykazuje w nich tendencję wzrostową. I tak w plemniku nieskapacytowanym wynosi 50-100 nM, w plemniku skapacytowanym – 125-175 nM a w plemniku po zajściu reakcji akrosomowej – 300-500 nM (1).
Od momentu związania się z białkiem receptorowym ZP3 w plemniku obserwowany jest również stały wzrost pH (z 6,6 do 7,0). Zmiana ta wystarcza do wywołania kaskady wewnątrzkomórkowych reakcji (wiązanie IP3 z receptorem) prowadzących do uwalniania wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia (1). Wzrost poziomu pH może być związany z działalnością wymieniaczy jonowych lub nie poznanego dotychczas mechanizmu transportowego. Alkalizacja plemnika w odpowiedzi na wiązanie z ZP3 prowadzi do aktywacji kalmodulinozależnej cyklazy adenylowej, fosfatazy białkowej, kinaz białkowych (A i C), kinazy tyrozynowej oraz fosfolipaz (A2, C i D) (1).
Kolejnym etapem jest wejście plemnika do przestrzeni okołożółtkowej i bezpośredni kontakt z błoną komórkową oocytu. W fuzji błon komórkowych gamet biorą udział antygen CD4 oocytu wiążący się z białkiem sp56 plemnika. Antygen CD4 rozpoznaje plemnik własnego gatunku. W proces fuzji zaangażowane są również integryny i ich ligandy. Obecnie uważa się, że białkiem odgrywającym główną rolę w procesie fuzji błon podczas zapłod-nienia jest fertylina (3, 10). Fertylina (PH30) jest heterodimerem składającym się z dwóch podjednostek – α (60 kDa) i β (40 kDa). Podjednostka α stanowi ligand integryny oocytu. Podjednostka β jest homologiczna z disintegrynami, niszczy kompleks integryna/ligand, by nastąpiło wnikanie plemnika wgłąb cytoplazmy. Obie podjednostki należą do grupy białek transportowych ADAM (zawierających domenę disintegryny i metalloproteazy; ang. A Disintegrine and A Metallprotease).
Równolegle z fuzją następuje wnikanie plemnika do cytoplazmy oocytu. Proces ten przypomina fagocytozę. Główka, wstawka i aksonema witki zostają wchłonięte wgłąb cytoplazmy. Aksonema witki ulega w cytoplazmie fragmentacji, a jej fragmenty wykrywane są w komórkach zarodka do stadium moruli. Dyskusyjny jest los mitochondriów wniesionych wraz z wstawką – u szczurów mitochondria plemnika ulegają degeneracji, u myszy – zastępują mitochondria oocytu.
Wynikiem fuzji błon plemnika i oocytu jest aktywacja oocytu. Przejawia się ona wzrostem stężenia jonów wapnia wskutek wnikania wapnia pozakomórkowego i uwalniania jonów wapnia z siateczki gładkiej oocytu. Prowadzi to do dezaktywacji czynnika cytostatycznego CSF (ang. cytostatic factor) utrzymującego oocyt w stadium metafazy II oraz czynnika promującego fazę M (MPF – maturation/mitosis promoting factor). MPF jest dimerem białkowym składającym się z podjednostki p34cdc2 (kinaza serynowotreoninowa) oraz podjednostki B (cyklina). Aktywacja MPF jest wynikiem fosforylacji podjednostki B lub działania kinazy MAP (mitogen-activated protein kinase) (4). Cykl komórkowy znajduje się pod kontrolą 40-50 genów, zwanych cdc (cell-division-cycle). Kluczową rolę odgrywa gen cdc2 kodujący kinazę białkową p34.
Zwiększenie stężenia wewnątrzkomórkowego jonów wapnia wyzwala również tzw. reakcję korową: ziarnistości korowe zespalają się z błoną komórkową i na drodze egzocytozy wydzielają enzymy hydrolityczne do przestrzeni okołożółtkowej. Enzymy te modyfikują fizyczne i chemiczne właściwości osłonki przejrzystej, czyniąc ją nieprzepuszczalną dla innych plemników. Mechanizm ten warunkuje u człowieka monospermię (zapłodnienie jednym plemnikiem), zabezpieczając przed polispermią.
Skutkiem inaktywacji CSF oraz działania MPF jest ukończenie II podziału dojrzewania i przejście komórki jajowej w stadium interfazy I cyklu embrionalnego. Wyrzucone zostaje drugie ciałko kierunkowe. Wprowadzony do ooplazmy plemnik traci błonę jądrową, chromatyna ulega dekondensacji i powstaje męskie, a następnie żeńskie przedjądrze. Czynniki cytoplazmatyczne, takie jak: czynnik wzrostu męskiego przedjądrza (MPGF – male pronucleus growth factor) i czynnik rozwoju przedjądrza z plemnika (SPDF) reagują z chromatyną jądrową rozdzielając mostki disiarczkowe i częściowo degradując białka jądrowe, prowadzą do uwolnienia protamin i zastąpienia ich przez histony. Następuje migracja przedjądrzy do centrum oocytu, błony przedjądrzy zanikają, po czym dochodzi do asocjacji rodzicielskich chromosomów z wrzecionem pierwszego podziału.
Piśmiennictwo
1. Arnoult C.et al.: Egg activation of sperm T-type Ca2+ channels regulates acrosome reactions during mammalian fertilization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:13004-13009. 2. Bleil J.D., Wassarman P.M.: Sperm-egg interactions in the mouse: sequence of events and induction of acrosome reaction by a zona pellucida glycoprotein. Dev. Biol., 1983, 95:317-324. 3. Blobel C.P. et al.: A potential fusion peptide and an intigrin ligand domain ina protein active in sperm-egg fusion. Nature, 1992, 356:248-252. 4. Dale B., Elder K.: In-vitro fertilization. Cambridge University Press, 1998, 19-45. 5. Darszon A. et al.: Ion channels: key elements in gamete signaling. Curr. Topics Dev. Biol., 1996, 34:117-167. 6. Eddy E.M., O´Brien D.A.: The spermatozoon. In the physiology of reproduction. E. Knobil, J.D. Neill (New York: Raven Press), 1994, 29-78. 7. Kuczyński W.: 1997, Techniki wspomaganego rozrodu w niepłodności męskiej – problemy diagnostyczne i lecznicze, Medipress Ginekologia, 1997, 3, 2:5-11. 8. Lievano A. et al.: T-type channels and a1E expression in spermatogenic cells and their possible relevance to the sperm acrosome reactions. FEBS Lett, 1996, 388:150-154. 9. Moskalewski S., Sawicki W.: Histologia z elementami biologii molekularnej. Warszawska Akademia Medyczna, 1996, 223-238. 10. Snell W.J., White J.M.: The molecules of mammalian fertilization, Cell, 1996, 85:629-637. 11. Tesarik I. et al.: Human oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction, 1994, 9:511-514. 12. Walensky L.D., Snyder S.H.: Inositol 1,4,5-triphosphate receptors selectively localizes to the acrosomes of mammalian sperm. J. Cell Biol., 1995, 130:857-869. 13. Ward C.R., Kopf G.S.: Molecular events mediating sperm activation. Dev. Biol., 1993, 104:287-296. 14. Wasserman P.M.: Mammalian Fertilization: Molecular Aspects of Gamete Adhesion, Exocytosis, and Fusion, Cell, 1999, 96:175-183. 15. Yanagimachi R.: Mammalian fertilization. In the physiology of reproduction. E. Knobil, J.D. Neill (Raven Press, New York), 1994, 187-317.
Nowa Medycyna 6/1999
Strona internetowa czasopisma Nowa Medycyna