Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Medycyna 6/1999, s. 57-60
Waldemar Kuczyński1, 2, Grzegorz Mrugacz2, Sławomir Wołczyński1, Tadeusz Wasilewski2, Robert Czech2, Marian Szamatowicz1
Nowe metody w leczeniu niepłodności męskiej
New methods in the treatment of male infertility
1 z Instytutu Położnictwa i Chorób Kobiecych Akademii Medycznej w Białymstoku
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. n. med. Marian Szamatowicz
2 KRIOBANK, Centrum Leczenia Niepłodności Małżeńskiej
Kierownik Centrum: doc. dr hab. n. med. Waldemar Kuczyński
Streszczenie
In clinical terms male infertility is not well defined and with vague etiopathogenesis. Pharmacological tratment of men is greatly ineffective. Thus, empirical therapeutic methods based on artificial reproduction techniques have been instituted. Since evaluation of the reproductive potential of patients with oligo-, astheno-, and teratozoospermia encounters a number of problems, treatment with homologous insemitation or even classic in vitro fertilization were effective only in a small percentage of childless couples. Recent years have brought advanced techniques of artificial reproduction which use microsurgical injection of sperm to the cytoplasm of oocytes, radically changing management strategy in diagnostics and therapy of infertile married couples, in which male factor is the predominant or concomitant cause of childlessness.
Klasyczne techniki wspomaganego rozrodu (ART) zastosowane w leczeniu niepłodności małżeńskiej uwarunkowanej czynnikiem męskim pozwalały uzyskać ciąże tylko w niewielkim odsetku leczonych par. Wiązało się to głównie ze stopniem upośledzenia jakości nasienia, jednak nawet w grupach pacjentów o niewielkim obniżeniu potencjału rozrodczego mężczyzn całkowity brak zapłodnień (TFF) miał miejsce u ponad jednej trzeciej par leczonych klasyczną metodą pozaustrojowego zapłodnienia (IVF-ET). Znaczna liczba pacjentów z ciężką oligo-, astheno-, teratozoospermią czy też niepłodnością immunologiczną, nie mogła liczyć na skuteczne leczenie standardowymi metodami ART. W chwili obecnej można stwierdzić, że problem niepłodności męskiej w sensie uzyskania potomstwa przestał istnieć. Jedynie około 3% mężczyzn, uważanych za niepłodnych w rzeczywistości nie ma szansy na posiadanie własnego potomstwa. Stało się tak za sprawą wprowadzenia technik mikrochirurgicznego zapłodnienia komórki jajowej tzw. microassisted fertilization (MAF). Techniki mikromanipulacyjne dokonywane na gametach mają na celu ułatwienie syngamii poprzez mechaniczne lub chemiczne przerwanie ciągłości osłonki przejrzystej (PZD) oraz wprowadzenie plemników do przestrzeni okołożółtkowej (SUZI), bądź pojedynczego plemnika do cytoplazmy komórki jajowej (ICSI).
Najprostszą z mikrochirurgicznych technik zapłodnienia jest przerwanie ciągłości osłonki przejrzystej oocytu (partial zona dissection – PZD). W przypadkach ograniczonej zdolności zapładniającej męskich komórek płciowych, w szczególności związanych z oligospermią, asthenospermią oraz brakiem wiązania plemników z osłonką przejrzystą, otwarcie przestrzeni okołożółtkowej umożliwia wniknięcie do niej plemników oraz fuzję z oolemmą, a w konsekwencji – zapłodnienie. Zasadniczym mankamentem metody jest jednak wysoki odsetek komórek zapłodnionych polispermicznie oraz wysoka częstość braku zapłodnień.
Bardziej zaawansowaną techniką jest podotoczkowe wstrzyknięcie plemników (subzonal sperm insertion – SUZI). Zabieg ten polega na wprowadzeniu pod osłonkę przejrzystą oocytu kilku lub kilkunastu, skapacytowanych plemników. Metoda ta umożliwia uzyskanie ciąży w 19% leczonych par. Wyniki te są zbliżone do uzyskiwanych w warunkach IVF-ET u pacjentek z czynnikiem jajowodowym. Skuteczność metody ograniczona jest przede wszystkim wysokim, sięgającym bowiem aż 50% odsetkiem oocytów zapłodnionych polispermicznie. Obie wymienione metody, wymagają prawidłowo przebiegającej fuzji błon komórkowych plemnika i komórki jajowej z następową jej aktywacją.
Opisane metody straciły obecnie znaczenie praktyczne wobec zdecydowanie korzystniejszych wyników uzyskiwanych za pomocą bardziej radykalnych technik mikrochirurgicznych. Metodą taką, jest docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (intracytoplasmic sperm injection – ICSI). Wskazania do leczenia tą metodą mają miejsce gdy:
1. Liczba plemników jest mniejsza od wymaganego minimum, niezbędnego do leczenia standardową techniką IVF (np.: mniej niż 500 000),
2. Poprzednie próby leczenia standardową metodą IVF, zakończone zostały brakiem zapłodnień oocytów,
3. Odsetek zapłodnionych komórek jajowych w poprzednich próbach był niższy od 20%,
4. Stwierdza się przeciwciała przeciwplemnikowe (niepłodność immunologiczna).
Leczenie tą metodą nie różni się od pozaustrojowego zapłodnienia w zakresie takich procedur, jak: kontrolowana hiperstymulacja jajników i jej monitorowanie, pobranie oocytów, transfer zarodków, czy też substytucja drugiej fazy. Jedynie proces zapłodnienia odbywający się w standardowym programie IVF w sposób samoistny zastąpiony został mikrochirurgicznym wprowadzeniem plemnika do ooplazmy. Przeprowadzenie tego zabiegu możliwe jest jedynie w wysoko wyspecjalizowanych ośrodkach, dysponujących odpowiednim przygotowaniem i sprzętem.
Najistotniejsze etapy ICSI obejmują uzyskanie i przygotowanie nasienia, przygotowanie komórki jajowej i wykonanie mikroiniekcji, specjalnie przygotowanymi narzędziami.
Uzyskanie nasienia
Nasienie uzyskuje się zazwyczaj drogą masturbacji, równolegle do pobrania komórek jajowych partnerki. Po 20 min wykonuje się ocenę seminologiczną i kwalifikuje się do specyficznej preparatyki. Należy w tym miejscu stwierdzić, iż w trakcie leczenia zaawansowanymi technikami wspomaganego rozrodu, dosyć często pojawiają się problemy z uzyskaniem nasienia lub też z brakiem plemników w nasieniu czy też brakiem żywych plemników u pacjentów u których wcześniej były one obecne. Jest to bardzo stresowa sytuacja zarówno dla zespołu leczącego jak i pacjentów, dlatego racjonalne jest wcześniejsze zdeponowanie nasienia w „banku” co daje pewność, że gamety są dostępne na „żądanie”. W tej sytuacji uzyskanie nasienia świeżego jest mniej stresogenne a ejakulat ma zazwyczaj lepszą jakość. Nie jest to jedyny powód uzasadniający wykorzystanie technik kriokonserwacyjnych w leczeniu niepłodności. Inne możliwości, to gromadzenie kolejnych ejakulatów od pacjentów z ciężką oligospermią, kryptospermią, asthenospermią czy nekrospermią (pooling) z późniejszym ich wykorzystaniem dla potrzeb ICSI. W przypadku pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, wstecznym wytryskiem nasienia, zaburzeniami wzwodu i ejakulacji oraz u tych gdzie uzyskuje się w nasieniu okresowo pojedyncze plemniki kriokonserwacja stwarza unikalną szansę skutecznego leczenia. Zmniejsza również do minimum ryzyko braku możliwości wykonania mikroiniekcji pobranych już komórek jajowych. Oddzielny, ważny problem dotyczy przechowywania plemników ekstrahowanych z najądrza lub jądra oraz mrożenie tkanki jądrowej w celu późniejszego odzyskania z niej plemników celem użycia ich dla potrzeb ICSI. Są to metody funkcjonujące na poziomie klinicznym, możliwe do wykorzystania w celu uniknięcia wielokrotnyh biopsji jąder. Wydaje się również, że materiał uzyskany z jąder dla potrzeb diagnostycznych, powinien zostać obligatoryjnie zamrożony.
Inna rola kriokonserwacji w terapii niepłodności małżeńskiej wiąże się z profilaktyką jatrogennej niepłodności mężczyzn. Zachowanie potencjału rozrodczego w obliczu planowanej terapii chemicznej, radiologicznej czy chirurgicznej, które mogą lub uczynią pacjenta niepłodnym, poważnie subfertylnym lub niezdolnym do normalnego życia seksualnego to obowiązek lekarzy prowadzących leczenie. Depozyt nasienia pozwala na uniknięcie ryzyka oddziaływania czynników mutagennych, powodujących liczbowe lub strukturalne aberracje chromosomowe w komórkach spermatogenezy. W wielu przypadkach użycie chemioterapii w leczeniu nowotworów prowadzi do zahamowania (niekiedy nieodwracalnego) spermatogenezy z możliwym zanikiem wyjściowych komórek spermatogenezy. Także w przypadkach leczenia operacyjnego rozległych przepuklin pachwinowych oraz zabiegach na układzie moczo-płciowym mężczyzny, szczególnie obejmującym okolicę szyi pęcherza moczowego, wskazane jest również rozważenie zdeponowania nasienia.
Należy stwierdzić iż utrata płodności przez leczonych pacjentów w omówionych sytuacjach klinicznych może prowadzić do konsekwencji nie tylko zdrowotnych i społecznych ale również roszczeniowych co należy brać pod uwagę szczególnie w obliczu dokonującej się reformy służby zdrowia.
Przygotowanie nasienia
Procedury izolacji plemników w przypadkach oligoasthenoteratospermi, kryptozoospermii czy też nasienia mrożonego, nie odbiegają w sposób istotny od stosowanych powszechnie w technikach wspomaganego rozrodu. Najczęściej wykorzystuje się separację plemników poprzez wirowanie na nieciągłym gradiencie Percollu. W przypadkach stwierdzania pojedynczych plemników w ejakulacie (1-2 plemniki co kilka pól widzenia w ocenie mikroskopowej) zastosowanie preparatyki percollowej wiąże się ze znacznym ryzykiem utraty nielicznych plemników. Przygotowanie plemników ogranicza się wtedy do płukania i odwirowania nasienia oraz zastosowania mikrometody – migracji wstępującej (mini-swim-up), niekiedy wielokrotnej. Szczególne trudności mogą wiązać się z uzyskaniem żywych plemników z ejakulatów pacjentów z nekrospermią oraz ciężką asthenospermią, przy relatywnie dużej ich liczbie. Odnalezienie plemników, o niekiedy bardzo słabych oznakach aktywności życiowej, związane jest z długotrwałym poszukiwaniem i może wymagać zastosowania wstępnej procedury odzysku przy pomocy mikromanipulatorów („hunting”).
Przygotowanie komórki jajowej
Przed przystąpieniem do mikrochirurgicznego zapłodnienia oocyt powinien być pozbawiony otaczających go komórek wzgórka jajonośnego i wieńca promienistego. Odbywa się to przy pomocy enzymatycznych i mechanicznych zabiegów, wykonywanych w stałej temperaturze 37°C, w podłożach hodowlanych pod sterylną, płynną parafiną. Pozbawione struktur wieńca promienistego i wzgórka jajonośnego komórki jajowe są wielokrotnie płukane podłożem Earle´a buforowanego HEPES-em z dodatkiem wysokiej jakości surowic. W razie konieczności odroczenia mikroiniekcji oocyty są przechowywane w podłożu hodowlanym Menezo B2 do czasu zabiegu. Uzyskane w ten sposób komórki jajowe poddawane są ocenie mikroskopowej. Potwierdzenie nienaruszonej struktury komórki oraz obecność pierwszego ciałka kierunkowego pozwala zakwalifikować oocyt jako dojrzały i poddać go dalszym procedurom. Ocenia się, że ponad 80% pobranych komórek, to oocyty na etapie metafazy II, pozostałe komórki jajowe mogą znajdować się na etapie germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD) oraz metafazy I. Te ostatnie, mają szansę na zakończenie dojrzewania in vitro, szczególnie w kokulturze z komórkami Vero. W pełni dojrzałe oocyty umieszczane są w mikrokropli podłoża hodowlanego – zazwyczaj Earle´a buforowanego HEPESEM, pod przykryciem oleju mineralnego i poddawane mikroin-iekcji.
Przygotowanie mikronarzędzi
Istotnym etapem przygotowawczym do ICSI jest wykonanie mikrochirurgicznych narzędzi, niezbędnych do wykonania tego zabiegu. Może to odbywać się tylko w profesjonalnie przygotowanych pracowniach, wyposażonych w odpowiedni sprzęt. Pipety iniekcyjne i przytrzymujące powinny być wykonane z nietoksycznego szkła, posiadającego odpowiednie i stałe właściwości fizyczne. Uzyskanie pipet o zakładanej zewnętrznej i wewnętrznej średnicy oraz odpowiednio ukształtowanym zakończeniu możliwe jest poprzez wyciąganie, obtapianie i szlifowanie ich przy użyciu specjalnego oprzyrządowania.
Wykonanie zabiegu ICSI
Zabieg ICSI odbywa się pod bezpośrednią kontrolą obrazu mikroskopowego, bądź przy użyciu systemów wizyjnych i obserwacji procedury na monitorze. Wskazane jest użycie kontrastu modulacyjnego Hoffmana, co zapewnia doskonałą jakość obrazu, umożliwiającą precyzyjną oceną oocytów, plemników i pozycji mikronarzędzi wobec gamet, jak również ułatwia pracę dzięki dużej odległości kondensora od pola operacyjnego. Niezbędnym elementem wyposażenia mikroskopu są mikromanipulatory umożliwiające precyzyjne posługiwanie się mikronarzędziami. Środowisko, w jakim przeprowadzany jest zabieg ICSI, stanowią mikrokrople z oocytami oraz oddzielne krople z przygotowanymi wcześniej plemnikami. Zwiększenie gęstości środowiska poprzez dodanie poliwinylopirolidonu (PVP), umożliwia spowolnienie ruchu plemników ułatwiając unieruchomienie plemnika poprzez mechaniczne uszkodzenie witki i wprowadzenie go do pipety iniekcyjnej. Stałość warunków w podłożu zapewnia odpowiednie buforowanie, umieszczenie kropli pod parafiną oraz używanie stolika o kontrolowanej i stałej temperaturze.
Wybrane plemniki o najlepszych parametrach morfologicznych są unieruchamiane poprzez mechaniczne złamanie witki. Można to osiągnąć dociskając witkę pipetą iniekcyjną do dna płytki hodowlanej, bądź też za pomocą gwałtownego uderzenia pipety kontrolowanej przez urządzenie piezoelektryczne. Pojedyncze plemniki wprowadzane są do pipety iniekcyjnej z minimalną objętością podłoża 10-15 µl.
Komórka jajowa unieruchomiona ujemnym ciśnieniem wytwarzanym w pipecie przytrzymującej, powinna być ustawiona ciałkiem kierunkowym na godzinie 6 lub 12, a punkt jej nakłucia na godz. 3, przy skierowaniu otworu pipety iniekcyjnej w odwrotną stronę w stosunku do ciałka kierunkowego. Taka technika zmniejsza prawdopodobieństwo uszkodzenia wrzeciona kariokinetycznego oocytu w trakcie jego nakłucia. Wstrzyknięcie pojedynczego plemnika do cytoplazmy odbywa się po przerwaniu ciągłości zarówno otoczki przejrzystej, jak i oolemmy. Po zabiegu komórki umieszczane są w płynie hodowlanym, a dalszy sposób postępowania jest identyczny jak w przypadku standardowego pozaustrojowego zapłodnienia. Wyniki uzyskiwane przez Van Steirteghema i wsp. dowodzą, że metoda ta cechuje się wysoką wydajnością. Prawie 90% nakłutych oocytów nie wykazuje cech uszkodzenia struktur komórkowych. Odsetek zapłodnionych prawidłowo komórek jajowych przekracza 50-60% ogólnej liczby nakłuwanych oocytów, podczas gdy liczba nieprawidłowo zapłodnionych nie przekracza kilku procent. Podobne wyniki uzyskują Kuczyński i wsp. z Kliniki Ginekologii Instytutu Położnictwa i Chorób kobiecych Akademii Medycznej w Białymstoku.
Całkowity brak zapłodnień po zastosowaniu ICSI, w ośrodkach o odpowiednim doświadczeniu nie przekracza 3%, a przypadki o niewyjaśnionej etiologii niepowodzenia występują nie częściej niż 0,3%. Całkowity brak zapłodnień obserwuje się w przypadkach, kiedy nakłuwane są pojedyncze oocyty, w nasieniu nie stwierdza się ruchomych plemników, uzyskane oocyty wykazują cechy degeneracji, bądź też kiedy wszystkie oocyty zostają uszkodzone w trakcie zabiegu. Niepowodzenia o typie poliploidii, często spotykane w komórkach zapłodnionych innymi technikami mikrochirurgicznego zapłodnienia, w przypadku ICSI nie stanowią znaczącego problemu i są najczęściej wynikiem braku wyrzucenia II ciałka kierunkowego.
Kliniczne wyniki leczenia niepłodności męskiej tą metodą są bardzo zachęcające. Według Van Steirteghema i wsp. odsetek ciąż uzyskanych w wyniku docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika przekracza 34% w przeliczeniu na cykl. Podobne wyniki uzyskiwane są przez zespół białostocki. Wskaźniki ciąż w przeliczeniu na cykl wynoszą od 25 do 44% i zależą od wieku pacjentek, jakości odpowiedzi jajników na leki oraz zastosowanego przygotowania pacjentów i nasienia.
Głęboka ingerencja w proces zapłodnienia zmusza do szczególnej uwagi w ocenie ewentualnego, niekorzystnego wpływu na zdrowie dzieci urodzonych w wyniku zastosowania tej metody. W klinicznym materiale autorów belgijskich, na 1160 ciąż uzyskanych w wyniku ICSI stwierdzono w 6 przypadkach anomalie chromosomalne, a na 699 urodzonych dzieci u 18 (2,7%) stwierdzono wady wrodzone. Odsetek wad nie różni się w sposób istotny statystycznie od występujących w populacji dzieci poczętych w warunkach in vivo, bądź in vitro bez udziału mikromanipulacji.
Pojawiły się pewne problemy bioetyczne związane ze stosowaniem ICSI. Dyskutuje się możliwość potencjalnego ryzyka przenoszenia z pokolenia na pokolenie chorób warunkowanych genetycznie, a także zwiększone ryzyko wprowadzenia heterogenicznego oraz uszkodzonego DNA, pochodzących z nieprawidłowych plemników. W chwili obecnej badania genetyczne przeprowadzone wśród potomstwa uzyskanego za pomocą mikromanipulacji nie wykazały zwiększonej częstości takich powikłań. Wydaje się, że mechanizmy wytworzone w toku ewolucji mające za zadanie ochronę i naprawę uszkodzonego DNA (np.: wiele kopii tych samych genów w łańcuchu DNA, koniugacja chromosomów) są wydolne na tyle, że eliminują ew. zagrożenia o jakich mowa.
Potencjalne zagrożenia związane ze stosowaniem technik mikrochirurgicznych nakazują prowadzenie stałej, na wysokim poziomie, kontroli jakości. Wyniki powinny być odnoszone do analogicznych w równolegle funkcjonującym klasycznym programie pozaustrojowego zapłodnienia. Stąd też wielu autorów uważa, że technologia ta powinna być wykorzystywana jedynie przez duże ośrodki leczenia niepłodności, dysponujące odpowiednim poziomem diagnostyki andrologicznej i genetycznej.
Mikrochirurgiczna aspiracja plemników z najądrzy (micro-epidydymal sperm aspiration – MESA)
W grupie mężczyzn z azoospermią, której przyczyną jest brak bądź niedrożność nasieniowodów, szansę na uzyskanie potomstwa stwarza opisana przez Ascha i Silbera technika uzyskiwania plemników poprzez mikrochirurgiczną aspirację plemników z najądrza (MESA). Plemniki uzyskiwane z najądrzy są stosowane zarówno w standardowej technice IVF, jak i mogą być przenoszone wraz z oocytami do jajowodów. Skuteczność tych technik pozostaje jednak dyskusyjna. Problem braku dojrzałości czynnościowej plemników najądrzowych może być skutecznie rozwiązany jedynie przy wykorzystaniu mikrochirurgicznych technik zapłodnienia. Uzyskiwane wyniki MESA nie odbiegają zasadniczo od wyników ICSI wykonywanej plemnikami pochodzącymi z nasienia. W grupie pacjentów z wrodzonym brakiem nasieniowodów uzyskuje się 22% ciąż w przeliczeniu na cykl, a średni odsetek dzieci urodzonych przekroczył 16%.
Izolacja plemników jądrowych (testicular sperm extraction – TESE), (testicular sperm aspiration – TESA)
W ostatnich latach pojawiła się również szansa na posiadanie własnego potomstwa u par, u których partner obarczony jest azoospermią spowodowaną dysfunkcją kanalików jądrowych. Technika TESE polega na ekstrakcji plemników z materiału uzyskanego w trakcie biopsji jądra, natomiast TESA pozwala na uzyskanie pojedynczych plemników z tkanki jądrowej uzyskanej w wyniku biopsji igłowej jądra. Wyizolowane przy pomocy mikromanipulatorów plemniki, są wstrzykiwane do komórek jajowych w sposób identyczny jak przy ICSI. Według Silbera i wsp. u około 60% par po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu plemnika jądrowego dochodzi do zapłodnienia a w około 30% uzyskuje się ciążę. Wyniki te są zbliżone do uzyskiwanych w przypadkach zastosowania technik mikrochirurgicznych zapłodnienia z wykorzystaniem plemników izolowanych z nasienia. Są już pierwsze doniesienia o urodzeniu dziecka po iniekcji do komórki jajowej spermatydy uzyskanej z jądra, a nawet mikroiniekcji gołych jąder spermatyd (ROSNI). Doniesienia te są dowodem na możliwość uzyskania ciąży przy udziale komórki prekursorowej o haploidalnej liczbie chromosomów. Należy stwierdzić, że zapłodnienie komórkami prekursorowymi lub niedojrzałymi plemnikami wiąże się ze szczególnym ryzykiem zaburzeń rozwojowych, związanych z nieprawidłową funkcją genów warunkujących rozwój somatyczny płodu (genomic imprinting).
Piśmiennictwo
1. Adashi E.Y. et al.: Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology Lippincott. Raven Philadelphia New York, 1995. 2. Cohen J. et al.: Micromanipulation in Clinical Menagement of Fertility Disorders. Sem. Reprod. Endcrinol. 1994; 12:3. 3. Edwards R.G.: Conception in the Human Female. Akademic Press London UK 1980. 4. Edwards R.G. Brody S.: Principles and practice of Assisted Human Reproduction. [W] B. Saunders. Philadelphia PA USA 1995. 5. Matthews C.D.: Microassisted fertilization in assisted conception: indications and patient impact. Bailliere´s Clin. Obstet. Gynecol. 1994; 8:1. 6. Palermo G.D, Rosenwaks Z.: Assisted Fertilization for Male-Factor Infertility. Sem. Reprod. Endocrinol. 1995; 13:1. 7. Wood C., Trounson A.: O Clinical in vitro Fertilization. Springer – Verlag Berlin New York 1988. 8. Van Steirteghem A. et al.: Intracytoplasmic sperm Injection. Bailliere´s Clin. Obstet. Gynecol. 1994; 8:1.
Nowa Medycyna 6/1999
Strona internetowa czasopisma Nowa Medycyna