Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Nowa Medycyna 10/2000
Jacek Nikliński1, Wiesława Niklińska2, Lech Chyczewski3
Badania molekularne w rozpoznawaniu nowotworów
Molecular approaches to cancer diagnosis
1 z Kliniki Chirurgii Klatki Piersiowej Akademii Medycznej w Białymstoku
Kierownik Kliniki: dr hab. med. Jerzy Laudański
2 z Zakładu Histologii i Embriologii Akademii Medycznej w Białymstoku
Kierownik Zakładu: dr hab. Bogusław Sawicki
3 z Zakładu Klinicznej Biologii Molekularnej Akademii Medycznej w Białymstoku
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Lech Chyczewski
Streszczenie
Malignant tumors arise as a consequence of the accumulation of genetic and epigenetic alterations within a single cell or group of cells. A number of new molecular approaches have recently been described that may have a significant impact on cancer diagnosis and prognosis. These approaches are introduced and discussed in the context of their potential applications in clinical practice.
Badania ostatnich lat sugerują, że złośliwa zmiana nowotworowa powstaje jako wynik nagromadzenia błędów genetycznych w prawidłowej komórce, która przestaje podlegać fizjologicznym mechanizmom kontrolującym jej wzrost i różnicowanie (4). Zasadniczym zjawiskiem w przebiegu onkogenezy jest pojawienie się kolejnych mutacji aktywujących protoonkogenny i unieczynniających antyonkogeny (geny supresorowe). Końcowym efektem tego procesu jest pełne rozregulowanie aparatu genetycznego. Wieloletni proces kancerogenezy obejmuje zainicjowanie procesu przekształcania się komórek zdrowych w komórki nowotworowe, namnażanie tych komórek i nabywanie fenotypu angiogenicznego, a następnie wzrost guza pozwalający na wykrycie go badaniami obrazowymi. W tym czasie może dochodzić do powstania niezwykle istotnych dla przebiegu choroby procesów naciekania otoczenia, tworzenia mikroprzerzutów oraz nabywania przez komórki raka oporności na cytostatyki.
Szybki rozwój różnorodnych technik biologii molekularnej stał się podstawą do praktycznego zastosowania oceny zaburzeń materiału genetycznego w chorobach nowotworowych. Obecnie trwają intensywne badania nad mechanizmami predyspozycji genetycznych do chorób nowotworowych, a także poszukiwanie czynników ułatwiających wczesną diagnostykę i markerów mających znaczenie rokownicze.
Zaburzenia genetyczne pojawiające się w komórkach nowotworowych lub niejednokrotnie w zmianach przednowotworowych można analizować na poziomie DNA oraz RNA, a także produktów białkowych genów.
Badania oparte na analizie DNA
Materiałem do oceny jest DNA pochodzący z wycinków guza nowotworowego, komórek nowotworowych obecnych w płynach ustrojowych, wolnego surowiczego DNA pochodzącego z komórek nowotworowych lub leukocytów krwi obwodowej. Etapem wyjściowym dla analizy genów jest amplifikacja fragmentów badanego DNA metodą reakcji łańcuchowej z udziałem polimerazy – PCR (ang. polymerase chain reaction). Dalsze etapy mogą dostarczyć informacji o zaburzeniach w obrębie genu.
Pierwszą kategorię informacji stanowi dokładna analiza mutacji, a metodą pozwalającą na jej uzyskanie jest bezpośrednie badanie sekwencji nukleotydów w uprzednio zamplifikowanych odcinkach genu. DNA można sekwencjonować przez chemiczne rozrywanie łańcucha przy określonych zasadach (metoda Maxama-Gilberta) lub przez kontrolowane zakończenie replikacji (metoda Sangera). Ta druga metoda jest obecnie najczęściej stosowanym sposobem analizy DNA. W ostatnich latach opracowano odmianę metody Sangera, w której stosuje się znakowanie fluorescencyjnie startery (primery) lub dideoksynukleotydy. Znakowane fluorescencyjnie produkty sekwencjonowania rozdziela się w specjalnych aparatach zwanych „sekwenatorami” które automatycznie odczytują sekwencję nukleotydów w DNA i zapisują ją w pamięci komputera. Daje to możliwość błyskawicznej analizy uzyskanych danych i pozwala między innymi na wykrywanie mutacji i polimorfizmów. Metody powyższe są bardzo czułe i swoiste oraz pozwalają na dokładną lokalizację mutacji, a także na określenie jej charakteru.
Inne metody umożliwiają wykrycie mutacji bez jej pełnej charakterystyki. Do stwierdzenia obecności mutacji w określonym eksonie genu wykorzystuje się metody pośrednie, takie jak badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA – SSCP (ang. single strand conformation polymorphism), elektroforezę w gradiencie denaturującym – DGGE (ang. denaturating gradient gel electrophoresis) oraz analizę heterodupleksów. Metoda SSCP oparta jest na zmianie konformacji (kształtu) pojedynczej nici DNA, będącej wynikiem mutacji, co prowadzi do różnicy w migracji DNA w żelu poliakrylamidowym. Metoda DGGE oparta jest na zależnej od składu zasad zdolności denaturacji DNA w różnych temperaturach i stężeniach substancji denaturującej. Analiza heterodupleksów polega na różnicy ruchliwości podczas elektroforezy na żelu poliakrylamidowym heterodupleksów (struktur dwuniciowych DNA zawierających miejsca niesparowane z powodu mutacji punktowych) w porównaniu do homodupleksów (struktur dwuniciowych w pełni komplementarnych). Metody te są łatwiejsze do wykonania w porównaniu z bezpośrednim sekwencjonowaniem genu, ale nie pozwalają na pełne scharakteryzowanie mutacji.
Opracowano ostatnio metody, które dają możliwość wykrycia mutacji występujących w bardzo małym odsetku badanej populacji komórek (2). Najczęściej taką analizę przeprowadza się stosując technikę „enriched-PCR” z jej modyfikacjami, alleloswoistej hybrydyzacji, oraz łańcuchowej reakcji ligazy (LCR). Metody te są wykorzystywane do wykrywania mutacji znanych, takich jak mutacje w kodonie 12 genu K-ras oraz mutacji w tzw. „gorących” miejscach w genie P53.
Metoda enriched-PCR polega na wybiórczej degradacji allela „dzikiego” przy zachowaniu allela zmutowanego przed amplifikacją genu w układzie PCR. W wyniku tego powstające produkty PCR stanowią jednorodną populację DNA pod względem sekwencji nukleotydów, a obecność produktu amplifikacji świadczy o obecności mutacji w badanym materiale. W przypadku, gdy oceniany na obecność mutacji kodon genu nie posiada miejsca cięcia dla żadnego ze znanych enzymów restrykcyjnych, w analizie enriched-PCR stosuje się przed etapem cięcia matrycy dodatkową amplikację DNA ze starterami określonymi jako mismatched (metodę tę określa się jako PCR-PIREMA). W wyniku tego matryca genu prawidłowego będzie przecinana przez enzym restrykcyjny, nie dając produktu amplifikacji. Natomiast w genie zmutowanym takie miejsce cięcia nie powstaje, a amplifikowany gen świadczy o obecności mutacji (ryc. 1).
Ryc. 1. Schemat metody „PCR-PIREMA”.
Metoda alleloswoistej hybrydyzacji polega na wykorzystywaniu alleloswoistych sond molekularnych w hybrydyzacji ze zamplifikowanym genem. W tej metodzie zazwyczaj stosuje się technikę dot-blotting, w której produkty amplifikacji nanoszone są w postaci plamek na dwie błony nitrocelulozowe. Następnie jedna z błon jest hybrydyzowana z sondą o sekwencji prawidłowej, druga zaś z sondą swoistą dla sekwencji zmutowanej. Dodatni sygnał z sondą dla sekwencji zmutowanej świadczy o obecności mutacji w badanej próbce.
W metodzie LCR stosuje się powielanie in vitro fragmentu poprzez wielokrotne powtórzenie reakcji ligacji dwóch oligonukleotydów, która jest poprzedzona hybrydyzacją tych oligonukleotydów na jednej nici DNA. W metodzie tej stosowane są oligonukleotydy komplementarne do zmienionej sekwencji i powielany jest gen zmutowany (ryc. 2).
Ryc. 2. Schemat metody „LCR”.
Powyższe metody pozwalają na analizę mutacji genów, co może być wykorzystane zarówno w diagnostyce nowotworów dziedzicznych (12), jak również w ocenie molekularnej nowotworów nabytych (13). W ostatnich latach zidentyfikowano wiele genów, których mutacje predysponują do rozwoju nowotworów (18). Programy postępowania profilaktyczno-diagnostycznego zostały już opracowane dla wielu postaci nowotworów dziedzicznych. Stwarzają one nadzieję na wykrycie nowotworu we wczesnym stadium zaawansowania oraz wczesne wdrożenie postępowania terapeutycznego. W przypadku nowotworów nabytych szczególne znaczenie mają badania mutacji w celu obiektywnego wyselekcjonowania przypadków wysokiego ryzyka wystąpienia niepowodzenia leczenia. Przewidywanie przebiegu choroby u osób obciążonych nowotworem ma istotne znaczenie kliniczne, pozwala bowiem wybrać odpowiedni sposób leczenia i określić rokowanie.
W odniesieniu do raka płuca, trzustki czy jelita grubego szczególne znaczenie mają badania mutacji genów P53, P16 i K-ras (6, 9, 11). Wykazano obecność mutacji tych genów we wczesnych postaciach wyżej wymienionych nowotworów oraz w zmianach przednowotworowych. Ponadto mutacje te można wykryć izolując DNA z komórek nabłonkowych zawartych w materiale cytologicznym w stolcu, soku trzustkowym, plwocinie oraz płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Uzyskane wyniki wskazują, że molekularna ocena materiału cytologicznego może w przyszłości okazać się przydatną metodą wczesnego wykrywania raka płuca, a być może i innych nowotworów (1, 16).
Obecnie trwają intensywne badania nad nowymi metodami wykrywania mutacji, które pozwoliłyby na ocenę wielu genów podczas jednego badania. Taką nadzieję stwarza metoda DNA-chip, polegająca na hybrydyzacji DNA lub RNA izolowanego od chorego na nowotwór, do znacznej liczby sond reprezentujących prawidłowe i wariantowe sekwencje badanych genów umieszczonych na stałym podłożu. Analiza mutacji w tej metodzie odbywa się za pomocą skanera fluorescencyjnego wykrywającego różnice w intensywności sygnałów fluorescencji powstałych w wyniku hybrydyzacji sond do sekwencji prawidłowych i zawierających mutacje (3).
Badania z użyciem metod biologii molekularnej pozwalają nie tylko na zidentyfikowanie mutacji punktowych, lecz również na określenie ubytku fragmentów chromosomów. Oznaczanie delecji wiąże się często z badaniem utraty heterozygotyczności (LOH, ang. loss of heterozygosity). LOH jest jako utratą jednej kopii zdefiniowanego locus chromosomu, na którym zlokalizowany może być m.in. gen supresorowy. Powoduje to, że w komórce może być obecna tylko jedna kopia danego genu, którego ewentualna mutacja mogłaby doprowadzić do powstania zmienionego białka. Ostatnio najczęściej używanymi markerami genetycznymi w analizie LOH są sekwencje mikrosatelitarne. Są to wielokrotne powtórzenia sekwencji dwu- (np. CA) lub trójnukleotydowej (np. GTC). Poszczególne allele różnią się liczbą powtórzeń. W przypadku raka płuca badania cytogenetyczne i badania LOH wykazały, że często spotyka się delecje w obrębie chromosomów 3p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p. Wykazano tego typu zaburzenia w ok. 40% przypadków w I stadium zaawansowania niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Ponadto zauważono, że niektóre fragmenty chromosomów ulegają delecji przede wszystkim w guzach przerzutowych (np. w niedrobnokomórkowym raku płuca są to delecje w obrębie 2q, 18q, 22q) co wskazuje, że w regionach są zlokalizowane geny hamujące inwazyjność komórek nowotworowych (7).
Innym zaburzeniem ocenianym na poziomie DNA są badania niestabilności mikrosatelitarnych. Mikrosatelity to odcinki DNA składające się z wielu powtórzeń sekwencji (np. [CA]n). W trakcie replikacji materiału genetycznego względnie łatwo dochodzi do trwałego wypętlenia nici DNA będącej matrycą lub wypętlenia nici nowo zsyntetyzowanej. Prowadzi to, odpowiednio, do wypadnięcia lub dodania w nowej nici DNA jednego lub kilku powtórzeń, z których składa się sekwencja mikrosatelitarna. W prawidłowej komórce tego typu błędy są szybko usuwane przez „system nieprawidłowo sparowanych nukleotydów” (ang. DNA mismatch repair system). Analizując próbki DNA chorych na nowotwory zauważono, że czasami pojawia się w nich różnica w długości sekwencji mikrosatelitarnych, w DNA z tkanki prawidłowej i nowotworowej pochodzących od tego samego chorego. To zjawisko jest nazywane niestabilnością sekwencji mikrosatelitarnych (ang. microsatellite instability). Wykazano częste występowanie tych zaburzeń we wrodzonym niepolipowatym raku okrężnicy. W tym typie nowotworu występuje dziedziczna mutacja jednego z genów białek systemu usuwania nieprawidłowo sparowanych nukleotydów. Niestabilność mikrosatelitarna jest również często obserwowana w innych nowotworach, np. w raku płuca i jest związana z niepomyślnym rokowaniem (2, 7).
Pojawiają się pierwsze doniesienia dotyczące możliwości wczesnej diagnostyki niedrobnokomórkowego raka płuca na podstawie analizy zaburzeń mikrosatelitarnych w DNA uwolnionego z guza do krwi chorego. Wykazano, że wyżej wymienione zaburzenia występują u chorych w I stadium zaawansowania w około 40% (20).
Kolejnym badaniem na poziomie DNA jest zmiana wzoru metylacji DNA. Metylacja DNA odgrywa bardzo istotną rolę w procesie regulacji ekspresji genów (2, 5). Wykazano, że metylacja dużej liczby dinukleotydów CG w obrębie promotora genu powoduje wyciszenie jego ekspresji. Toteż gen może ulec unieczynnieniu nie tylko poprzez delecję lub mutację punktową, ale również poprzez metylację promotora. Szczególnie dotyczy to genu P16, którego inaktywacja jest często związana z hipermetylacją promotora tego genu. Zjawisko to wykazano nie tylko w guzach nowotworowych, ale również w stanach przednowotworowych w płucu (2).
Wykrywanie hipermetylacji promotora prowadzono z wykorzystaniem hybrydyzacji typu Southern oraz przy użyciu enzymów restrykcyjnych, których aktywność zależy od stanu metylacji rozpoznawanej sekwencji. Ostatnio opisano metodę nazwaną MSP (ang. methylation specific PCR), dzięki której można określić stan metylacji wybranego fragmentu promotora genu w próbce, która zawiera niewielką ilość DNA.
Badania oparte na analizie RNA
Pierwszym etapem badań jest izolacja RNA (w diagnostyce nowotworów najczęściej materiałem do badań są komórki nowotworowe lub limfocyty krwi obwodowej). W dalszej kolejności doprowadza się do przejścia RNA w cDNA (komplementarne DNA) za pomocą metody zwanej odwrotną transkrypcją (RT) i namnożenia cDNA przy użyciu PCR. Produkt reakcji RT-PCR może być następnie badany wcześniej omówionymi technikami lub poddany analizie funkcjonalnej genu.
W ostatnich latach podkreśla się potencjalne znaczenie nowej metody oceny genów, a zwłaszcza genu P53, opartej na analizie funkcjonalnej w systemie drożdżowym (10). W metodzie tej przeprowadzana jest transformacja cDNA genu P53 do określonego szczepu drożdży. Szczep taki charakteryzuje się obecnością mutacji endogennego genu ADE2 dla syntezy adeniny, i jednocześnie obecnością drugiej kopii tego genu, którego promotor jest pod kontrolą białka p53. Obecność prawidłowego wzrostu kolonii drożdży (duże kolonie białe) na podłożu ubogim w adeninę świadczy o pobudzaniu dodatkowej kopi genu ADE2 i syntezie tego aminokwasu, co jest uwarunkowane obecnością prawidłowego białka p53. Z kolei ograniczony wzrost kolonii (małe kolonie czerwone) świadczy o braku prawidłowego białka p53, co jest skutkiem mutacji genu P53 (ryc. 3).
Ryc. 3. Schemat metody funkcjonalnej oceny genu p53 Yeast Functional Assay.
Sugeruje się, że analiza czynnościowa genu P53 w systemie drożdżowym jest zdecydowanie czulszą i bardziej swoistą metodą w porównaniu do tradycyjnych metod przesiewowych (SSCP, DGGE). Inną istotną zaletą tego nowego testu jest jednoczasowa ocena znacznie większego fragmentu genu P53 niż tradycyjnie oceniany obszar pomiędzy eksonami 5-8 (zakres badany: aminokwasy 53-364), a także możliwość wykrycia mutacji w obecności znacznej ilości prawidłowych komórek podścieliska. Przeprowadzone badania wstępne wskazują, że czynnościowa ocena genu P53 może mieć istotne znaczenie w ocenie klinicznej nowotworów płuca, głowy i szyi oraz jelita grubego, szczególnie w aspekcie prognostycznym.
Badania na poziomie RNA pozwalają również na wykrycie z dużą częstością i swoistością pojedynczych komórek nowotworowych wśród setek tysięcy komórek prawidłowych (8, 14). Poszukiwanie komórek nowotworowych oparto głównie na metodzie ich wykrywania za pomocą RT-PCR. Badanie to jest ukierunkowane na poszukiwanie mRNA kodującego cząsteczki antygenów lub enzymów charakterystycznych dla danego nowotworu. Dzięki tej metodzie wykrywa się komórki czerniaka krążące we krwi obwodowej, komórki nowotworów przewodu pokarmowego, a także raka piersi i płuca w szpiku i węzłach chłonnych (tab. 1). Przykładem mo-że być wykrywanie mRNA cytokeratyny 19 i glikoproteiny MUC1 w węzłach chłonnych i szpiku w przypadku raka płuca (17). Ocena taka pozwala na dokładniejsze określenie stadium zaawansowania nowotworu, a potwierdzone w ten sposób mikroprzerzuty związane są z niepomyślnym rokowaniem. Badania te wykorzystywane są nie tylko w diagnostyce mikroprzerzutów, ale również w monitorowaniu leczenia chorób przebiegających z rozsiewem komórek nowotworowych we krwi (głównie dotyczy to chłoniaków i białaczek oraz komórek przerzutowych guzów litych). W ten sposób można również wykryć tzw. chorobę resztową (ang. minimal residual disease).
Tabela 1. RT-PCR w wykrywaniu mikroprzerzutów i krążących komórek nowotworowych.
Rodzaj nowotworuRodzaj specyficznego mRNA
Rak płuca
Rak tarczycy
Nowotwory przewodu pokarmowego
Rak sutka
Rak gruczołu krokowego
Rak szyjki macicy
Czerniak złośliwy
CK19 mRNA, MUC1 mRNA
TGB mRNA, TPO mRNA
CEA mRNA
Muc1 mRNA
PSA mRNA, PSMA mRNA, PTI-1 mRNA
SCC mRNA, HPV E6 mRNA
mRNA tyrozynazy, MART 1 mRNA
Badania oparte na analizie białek
Badania te mogą obejmować zarówno ocenę białkowego produktu genu, jak i obecności przeciwciał w płynach ustrojowych. Białko można wykryć metodami immunologicznymi za pomocą swoistych przeciwciał. Odmianą metody immunologicznej, pozwalającą na wykrycie białek w komórkach nowotworowych, jest metoda immunohistochemiczna i immunocytochemiczna. Wykorzystuje się w niej właściwość wydłużenia czasu półtrwania białek, jak to ma miejsce w przypadku zmutowanego białka p53, lub zanik ekspresji białek pod wpływem mutacji punktowej. Metoda ta pozwala także na wykrycie komórek nowotworowych w materiale pochodzącym z węzłów chłonnych lub szpiku kostnego. Używając przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla komórek nabłonkowych (Ber-Ep4 lub CK2) w około 15% przypadków raka płuca wykazano obecność mikroprzerzutów w węzłach chłonnych pierwotnie ocenionych jako nie zawierające przerzutów.
Ilościową ocenę białka można przeprowadzić za pomocą testu immunologicznego wykorzystującego swoiste powinowactwo przeciwciała związanego ze stałym podłożem do badanego białka. Wykrycie takiego kompleksu może odbywać się za pomocą drugiego przeciwciała znakowanego izotopem (test radioimmunologiczny) lub przy użyciu reakcji barwnej wytworzonej przez enzym związany z drugim przeciwciałem – test immunoenzymatycznym ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay). Metodę ELISA, z wykorzystaniem ludzkiego rekombinowanego białka p53, zastosowano z powodzeniem do oceny obecności przeciwciał anty p53 w surowicy. Metoda ta pozwala na ocenę humoralnej odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko białku p53. Podkreśla się, że analiza serologiczna p53 może stanowić uzupełnienie badań molekularnych i immunohistochemicznych, szczególnie cenne w monitorowaniu skuteczności leczenia (19). Wiąże się z nią również nadzieja na wczesne wykrycie raka, zwłaszcza u osób znajdujących się w grupie zawodowego ryzyka zachorowania na nowotwór i u wieloletnich palaczy tytoniu (19).
Podsumowanie
Mimo że tradycyjne rozpoznawanie nowotworów opiera się w dalszym ciągu na metodach morfologicznych, obecnie możliwe jest zastosowanie metod biologii molekularnej w celu wykrycia swoistych zmian w materiale genetycznym różnych nowotworów. Niewątpliwą zaletą tych ostatnich metod jest ich wysoka swoistość oraz wykorzystanie niewielkiej ilości materiału klinicznego. Z drugiej strony badania molekularne stwarzają nadzieję na opracowanie wczesnego rozpoznawania nowotworów, a w niektórych typach guzów mogą mieć wartość rokowniczą. Ponadto badania molekularne są podstawą do wprowadzenia terapii genowej nowotworów, której głównym celem jest przywrócenie prawidłowej czynności genów.
Piśmiennictwo
1. Ahrendt S.A. et al.: Molecular detection of tumor cells in bronchoalveolar lavage fluid from patients with early stage lung cancer. J. Natl. Cancer. Inst. 1999, 91:332. 2. Cairns P., Sidransky D.: Molecular methods for the diagnosis of cancer. Biochim Biophys Acta 1999, 1423:C11. 3. Cheng J. et al.: Microchip-based devices for molecular diagnosis of genetic diseases. Mol. Diagn. 1997, 1:183. 4. Chorąży M.: Molekularne aspekty kancerogenezy. Nowotwory 1997, 47:251. 5. Dumont N.: Genetic and epigenetic contributions to colorectal cancer. APMIS 1999, 107:711. 6. Dziadziuszko R. et al.: Clinical implications of molecular abnormalities in lung cancer. Cancer Treat. Rev., 1998, 24:317. 7. Fong K.M. et al.: Molecular pathogenesis of lung cancer. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1999, 118:1136. 8. Ghossein R.A. et al.: Molecular detection of micrometstases and circulating tumor cells in solid tumors. Clin. Cancer. Res. 1999, 5:1950. 9. Goggins M. et al.: Progress in cancer genetics: lessons from pancreatic cancer. Ann Oncol. 1999, 10 (suppl. 4):4. 10. Inga A. Et al.: Determining mutational fingerprints at the human p53 locus with a yeast functional assay: a new tool for molecular epidemiology. Oncogene 1997, 14:1307. 11. Romanowski P., Limon J.: Aberacje chromosomowe i mutacje genowe w raku jelita grubego. Nowotwory 1996, 46:213. 12. Lubiński J. i wsp.: Nowotwory dziedziczne – profilaktyka, wczesna diagnostyka i leczenie. Współczesna Onkologia 1997, 1:5. 13. Nikliński J., Furman M.: Clinical tumour markers in lung cancer. Eur. J. Cancer. Prev. 1995, 4:129. 14. Pantel K. et al.: Detection and clinical importance of micrometastatic disease. J. Natl. Cancer. Inst. 1999, 91:1113. 15. Passlick B. et al.: Detection of disseminated lung cancer cells in lymph nodes: impact on staging and prognosis. Ann. Thorac. Surg. 1996, 61:177. 16. Rimm D.L.: Molecular biology in cytopathology-current applications and future directions. Cancer Cytopathol. 2000, 90:1. 17. Salerno C.T. et al.: Detection of occult micrometastases in non-small cell lung carcinoma by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Chest 1998, 113:1562. 18. Steffen J.: Dziedziczne uwarunkowania w zachorowaniu na nowotwory złośliwe: udział genów o wysokiej i umiarkowanej penetracji. Nowotwory 1999, 49:71. 19. Soussi T.: p53 antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Res. 2000, 60:1777. 20. Sozzi G. et al.: Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients: a prospect for early diagnosis. Clin. Cancer Res. 1999, 5:2689.
Nowa Medycyna 10/2000
Strona internetowa czasopisma Nowa Medycyna