Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Stomatologia 1/2006, s. 47-50
*Anna Maria Wasilewska1, Sylwia Małgorzata Słotwińska1, Robert Słotwiński2,3
Występowanie w ślinie inhibitorów cytokin u osób z przewlekłym i agresywnym zapaleniem przyzębia
The saliva levels of cytokines inhibitors in patients with chronic and aggressive periodontitis
1Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii AM w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. n. med. E. Jodkowska
2 Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Żywienia AM w Warszawie,
Kierownik: prof. dr hab. med. I. W. Krasnodębski
3Zakład Chirurgii Transplantacyjnej, Instytut Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa
Kierownik: prof. dr hab. med. W. Olszewski
Zainicjowanie i przebieg procesu zapalnego jest wynikiem wzajemnego oddziaływania antygenów bakteryjnych oraz tzw. mediatorów zapalenia, które są wyzwalane w odpowiedzi na antygen przez pobudzone komórki (makrofagi, komórki śródbłonka, limfocyty, fibroblasty, keratynocyty, komórki tuczne). Do podstawowych mediatorów biorących udział w odpowiedzi immunologicznej należą cytokiny, które są glikoproteinami uwalnianymi podczas procesu zapalnego przez komórki układu odpornościowego. Po związaniu cytokiny z odpowiednim receptorem błony komórkowej dochodzi do aktywacji komórki docelowej. Te hormonopodobne polipeptydy mogą również łączyć się z receptorami rozpuszczalnymi, które powstają w wyniku proteolizy i degradacji błon komórkowych. Jedną z ról, jaką mogą pełnić odłączone od komórki molekuły, jest konkurencja z receptorami błonowymi i blokowanie cytokin. Tego typu działanie antagonistyczne stwarza możliwość regulacji funkcji określonych cytokin (1).
Podstawowym zadaniem cytokin jest kontrola odpowiedzi zapalnej i immunologicznej organizmu. Interleukina-1 (IL-1) oraz czynnik martwicy nowotworów (TNF) należące do głównych cytokin prozapalnych, mają bardzo szeroki wachlarz oddziaływań biologicznych w organizmie. Z jednej strony są aktywnymi uczestnikami i stymulatorami reakcji zapalnej, z drugiej zaś, zgodnie z zasadą sprzężenia zwrotnego, uruchamiają naturalne mechanizmy supresyjne, które hamują niekontrolowany rozwój zapalenia. Monocyty i keratynocyty w odpowiedzi, m. in. na endotoksyny bakteryjne, wytwarzają naturalny inhibitor interleukiny pierwszej – hormonopodobne białko, funkcjonujące jako antagonista receptora IL-1 (IL-1ra). Inhibitor ten występuje w dwóch różnych formach: wewnątrzkomórkowej – icIL-1ra oraz zewnątrzkomórkowej, rozpuszczalnej – sIL-1ra. Gen dla ludzkiego IL-1ra jest zlokalizowany na długim ramieniu chromosomu drugiego. IL-1ra może brać udział w regulacji zwrotnej; wykorzystując swoje podobieństwo strukturalne do IL-1, wiąże się z receptorami IL-1I i IL-1II, blokując ich działanie. Zatem wytwarzanie IL-1ra jest częścią regulacyjnej odpowiedzi organizmu na prozapalne działanie interleukiny pierwszej. Wykazano, że IL-1ra hamuje nie tylko osteoklastyczną resorpcję kości, ale pobudza również różnicowanie się komórek macierzystych w dojrzałe postacie osteoblastów. Antagonista receptora IL-1 blokuje wiązanie interleukiny pierwszej z receptorami komórek T i fibroblastów, ale nie wpływa na wiązanie TNF z ich receptorami. Wykazano, że rekombinowana forma IL-1ra o masie 17 kDa (bez grupy glikozylowej) jest nadal zdolna do wiązania receptora dla IL-1 (1, 2).
TNF, podobnie jak IL-1, może również uruchomić mechanizmy immunosupresji. We krwi człowieka pojawiają się rozpuszczalne formy receptorów dla TNF, zwane białkami wiążącymi TNF. Są one zewnątrzkomórkowymi fragmentami receptorów błonowych, które powstają po zadziałaniu odpowiednich enzymów. W surowicy ludzkiej i w moczu zidentyfikowano dwa receptory: TNF-R55-BP (sTNFRI) i TNF-R75-BP (sTNFRII). Te rozpuszczalne receptory są zdolne do wiązania cytokin, działając już jako inhibitory rywalizujące z receptorami błonowymi. Komórka po oddzieleniu receptora traci zdolność do odbierania sygnału. Forma wolna receptora TNF w małym stężeniu może wykazywać efekt agonistyczny w stosunku do TNF, natomiast w dużym stężeniu, pełni rolę inhibitora w kolejnym systemie samoregulacji organizmu, działając antagonistycznie, poprzez wiązanie nadmiaru cytokiny w miejscu toczącego się procesu zapalnego.
Pobudzone komórki posiadają ponadto zdolność wydzielania innych cytokin o działaniu antagonistycznym w stosunku do IL-1 i TNF; np. IL-10 i/lub IL-4. Funkcje inhibitorów mogą pełnić również cząsteczki lipoprotein, lipidy, makroglobuliny. Jednak nie są to inhibitory specyficzne, ponieważ mogą blokować równolegle działanie innych cytokin (2).
W publikacjach dotyczących udziału cytokin w chorobach przyzębia, występują nieliczne doniesienia na temat stężenia inhibitorów cytokin prozapalnych w ślinie. Przede wszystkim oceniano stężenie cytokin w płynie dziąsłowym. Ślina jest środowiskiem, do którego przenikają ze szczeliny dziąsłowej składniki układu odpornościowego i produkty reakcji zapalnych, w tym między innymi enzymy uwalniane przez komórki immunokompetentne i/lub pochodzące z rozpadu martwiczych komórek bakteryjnych, enzymy oksydacyjne oraz enzymatyczne i nieenzymatyczne antyoksydanty. Łatwa i nieinwazyjna metoda pobierania śliny w celach diagnostycznych może służyć do analizy stężenia wybranych cytokin w przebiegu zapalenia przyzębia (3).
Celem prezentowanej pracy była ocena występowania w ślinie inhibitorów cytokin prozapalnych: antagonisty receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalnego receptora czynnika martwicy nowotworów (sTNF RI) u pacjentów z agresywnym i przewlekłym zapaleniem przyzębia.
Materiał i metody
Badaniami objęto 90 osób w wieku 19-51 lat. Grupę badaną stanowiło 28 osób z przewlekłym zapaleniem przyzębia w wieku 34-51 lat (12 kobiet i 16 mężczyzn) oraz 17 osób z agresywnym zapaleniem przyzębia w wieku 19-37 lat (9 kobiet i 8 mężczyzn). Grupę kontrolną stanowiło 45 osób w wieku 18-43 lata (25 kobiet i 20 mężczyzn) z klinicznie zdrowym przyzębiem: bez utraty przyczepu łącznotkankowego, bez patologicznych kieszonek dziąsłowych oraz wskaźnikiem krwawienia <10%. Do badań kwalifikowano osoby bez chorób ogólnoustrojowych, nie przyjmujące żadnych leków oraz nie leczone krwią i preparatami krwiopochodnymi. Próbki do badań, mieszanej niestymulowanej śliny, pobierano dwie godziny po śniadaniu, następnie zamrażano i przechowywano w temperaturze – 20° C. Po rozmrożeniu, wszystkie próbki wirowano 1000xg przez 20 minut. Poziom antagonisty receptora interleukiny pierwszej (IL-1 ra) oraz rozpuszczalnego receptora typu I czynnika martwicy nowotworów (s TNF RI, p55) w ślinie oznaczano w oparciu o metodę immunoenzymatyczną ELISA za pomocą fabrycznie gotowego ilościowego testu enzymatycznego Quantikine, R&D System Europe Ltd., Abingdon, Oxon, United Kingdom, zgodnie z zaleceniami producenta. Stężenie badanych cytokin podawano w pg/ml. Minimalny poziom cytokin możliwy do wykrycia przy użyciu tych testów, wynosi: 22 pg/ml dla IL-1 ra oraz 3 pg/ml dla s TNF RI. Przed wykonaniem testów sprawdzono specyficzność reakcji. W tym celu do wybranych próbek śliny dodano przeciwciała anti-IL-1 ra (AF-280-NA) oraz anti-s TNF RI (AF225) firmy R&D w stężeniach zalecanych przez producenta. Inkubację prowadzono w temperaturze pokojowej przez 1 h. Po tym czasie sprawdzano stężenie IL-1 ra i s TNF RI w próbkach z przeciwciałami i bez, przy użyciu opisanych testów enzymatycznych firmy R&D. Wyniki badań poddano analizie statystycznej stosując test U Mann-Whitney.
Wyniki badań
W tabeli 1 zestawiono średnie wartości stężenia w ślinie IL-1ra i sTNF RI u pacjentów z przewlekłym i agresywnym zapaleniem przyzębia oraz u osób z grupy kontrolnej. Średnie stężenie IL- 1ra w ślinie pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia wyniosło 29733 pg/ml (± 9708,94) i było statystycznie znamiennie wyższe, w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie kontrolnej: 20088,22 pg/ml (± 7639,58). Średnia wartość stężenia w ślinie IL-1ra u pacjentów z agresywnym zapaleniem przyzębia wyniosła 27153,53 pg/ml (± 12039,06) i była istotnie wyższa (p<0,001) w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 1). Nie stwierdzono znamiennych statystycznie różnic pomiędzy średnimi wartościami stężenia w ślinie IL-1ra u pacjentów z agresywnym i przewlekłym zapaleniem przyzębia. Średnie stężenie sTNF RI w ślinie pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia wyniosło 679,71 pg/ml (± 457,24), pacjentów z agresywnym zapaleniem przyzębia – 680,19 pg/ml (± 450,33) oraz 689,52 pg/ml (± 414,70) u osób z klinicznie zdrowym przyzębiem. Stwierdzone różnice nie były istotne statystycznie. Nie wykazano także różnic znamiennych statystycznie pomiędzy stężeniem poszczególnych inhibitorów w ślinie a płcią.
Tabela 1. Średnie wartości stężenia w ślinie IL-1ra i sTNF RI u osób z przewlekłym i agresywnym zapaleniem przyzębia oraz w grupie kontrolnej.

Badany parametr

Przewlekłe zapalenie przyzębia Agresywne zapalenie przyzębia Grupa kontrolna
X ? SDX ? SDX ? SD
IL-1ra [pg/ml]29733 ? 9708, 94*27153,53 ? 12039,06*20088,22 ? 7639,58
sTNF RI [pg/ml] 679,71 ? 457,24 680,19 ? 450,33 689,52 ? 414,70
Ryc. 1. Stężenie IL-1ra w ślinie.
Dyskusja
Przeprowadzone badania własne wskazały na możliwość związku pomiędzy stężeniem w ślinie antagonisty receptora IL-1(IL-1ra) a procesem zapalnym toczącym się w przyzębiu. Potwierdzają to również wyniki badań innych autorów. Holmlund i wsp. stwierdzili wyższe stężenie IL-1ra w płynie dziąsłowym pobranym z kieszonek patologicznych, w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto zaobserwowano istotne obniżenie stężenia IL-1ra po leczeniu (4). W badaniach na myszach Nishihara i wsp. wykazali, że IL-1ra uwalniany przez komórki stymulowane lipopolisacharydami Actinobacillus actinomycetemcomitans hamuje resorpcję kości (5). Podobne wyniki uzyskali też Graves i wsp. (6), Oates i wsp. (7), oraz Rasmussen i wsp.(8). Delima i wsp. (9) zastosowali ludzki, rekombinowany IL-1ra oraz sTNF RI w postaci iniekcji do brodawek dziąsłowych małp, u których wywołano eksperymentalne zapalenie przyzębia. Po zastosowanym leczeniu zaobserwowano znamienne statystycznie zahamowanie utraty kości wyrostka zębodołowego (o 91%) oraz istotną redukcję utraty przyczepu łącznotkankowego (o 51%). Kjeldsen i wsp. wykazali różnice w stężeniu inhibitora interleukiny pierwszej w surowicy krwi u pacjentów z różnymi formami zapalenia przyzębia: podwyższone stężenie IL-1ra w grupie z agresywnym zapaleniem przyzębia w porównaniu z grupą z zapaleniem przewlekłym (10). Natomiast wyniki badań Ishihary i wsp. (11) oraz Rawlinsona i wsp. (12) różnią się znacznie od wspomnianych powyżej. Autorzy ci wykazali, że w płynie dziąsłowym kieszonek pacjentów z zapaleniem przyzębia stężenie IL-1ra było niższe w porównaniu do stężenia tej cytokiny w płynie dziąsłowym osób z klinicznie zdrowym przyzębiem, co może sugerować ochronną rolę IL-1ra. Wyniki kolejnych badań Rawlinsona i wsp. (13) potwierdziły wcześniejsze obserwacje o znacznie niższym stężeniu IL-1 ra w płynie dziąsłowym u osób z zapaleniem przyzębia w porównaniu z osobami zdrowymi. Na uwagę zasługuje fakt wykrycia wysokich stężeń IL-1ra w płynie owodniowym, co może sugerować, że zdrowy organizm jest zdolny do miejscowej produkcji dużej ilości tego inhibitora (14). Opisane powyżej glikoproteiny w pewnych warunkach mogą nie wykazywać funkcji inhibitorów cytokin podczas toczącego się w przyzębiu procesu zapalnego. Periopatogenne bakterie mogą oddziaływać na sieć cytokinową w tkankach przyzębia i w płynie dziąsłowym poprzez zablokowanie aktywności inhibitorów. Fletcher i wsp. wykazali, że przeciwzapalne działanie IL-1ra może zostać osłabione przez bakterie z gatunku Porphyromonas gingivalis, które posiadają zdolność hydrolizowania tej cytokiny (15). Natomiast Schytte-Blix i wsp. w badaniach in vitro i in vivo wykazali, że na przebieg procesu chorobowego w przyzębiu ma wpływ proporcja cytokin prozapalnych do przeciwzapalnych (16). Tylko bardzo wysokie stężenia IL-1ra, wielokrotnie przewyższające stężenie IL-1b mogą wpływać hamująco na bioaktywność tej cytokiny. Wciąż jednak, pomimo intensywnych badań na poziomie molekularnym, brak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, czy i jak choroba przyzębia i jej różne stadia są skorelowane ze zróżnicowaną odpowiedzią wydzielanych przez pobudzone komórki cytokin.
Diagnostyka chorób przyzębia wyłącznie na podstawie objawów klinicznych może prowadzić do niepowodzeń w leczeniu, dlatego też celowe wydają się wszelkie poszukiwania metod diagnostycznych, które pozwolą na szybkie wykrywanie i różnicowanie patologii. Interesujące wydają się poszukiwania aktywatorów i inhibitorów procesów prowadzących do destrukcji tkanek przyzębia. W wielu badaniach, w tym również z zakresu periodontologii, jako materiał diagnostyczny wykorzystywana jest ślina, która stanowi specyficzne źródło produktów reakcji zapalnych i odpornościowych oraz enzymów uwalnianych przez komórki immunokompetentne, martwicze i bakteryjne. Jej skład zależy zarówno od zmian miejscowych zachodzących w obrębie jamy ustnej, jak i od stanu ogólnego całego organizmu. W złożonym procesie odpowiedzi immunologicznej w przebiegu zapalenia przyzębia istotną rolę pełnią cytokiny. Przeprowadzone badania własne wskazują na związek IL-1ra z rozwojem i przebiegiem zapalenia przyzębia. Monitorowanie zmian stężenia w ślinie IL-1ra może być zatem przydatne w ocenie stopnia zaawansowania procesu zapalnego w przyzębiu.
Piśmiennictwo
1. Dinarello Ch. A.: Induction of Interleukin- 1 and Interleukin- 1 Receptor Antagonist. Seminars in Oncology., 1997, 24, 3, suppl 9, 59-93. 2.Roitt I., et al.: Immunology, London 2000. 3.Sahingur S.E., Cohen R.E.: Analysis of host responses and risk for disease progression. Periodontology 2000., 2004, 34, 57-83. 4. Holmlund A., et al.: Bone resorbing activity and cytokine levels in gingival crevicular fluid before and after treatment of periodontal disease. J. Clin. Periodontol., 2004, 31, 6, 475- 482. 5.Nishihara T., et al.: Mouse Interleukin- 1 Receptor Antagonist Induced by Actinobacillus Actinomycetemcomitans lipopolysaccharide Blocks the Effects of Interleukin-1 on Bone Resorption and Osteoclast Like Cell Formation. Infect. Immun., 1994, 62, 2, 390-397. 6. Graves D.T., et al.: Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol., 1998, 69, 12, 1419-1425. 7.Oates T. W., et al.: Clinical, radiographic and biochemical assessment of IL-1/TNF-a antagonist inhibition of bone loss in experimental periodontitis. J. Clin. Periodont., 2002, 29, 2, 137-143. 8.Rasmussen L., et al.: Characterization of bone resorbing activity in gingival crevicular fluid from patient with periodontitis. J. Clin. Periodontol., 2000, 27, 1, 41-52. 9.Delima A.J., et al.: Soluble antagonists to interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF) inhibits loss of tissue attachment in experimental periodontitis. J. Clin. Periodontol., 2001, 28, 233-240. 10. Kjeldsen M., et al.: Bacterial- Stimulated cytokine production of peripheral mononuclear cells from patients of various periodontitis categories. J. Periodontol., 1995, 66, 139-144. 11. Ishihara Y., et al.: Gingival crevicular interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist levels in periodontally healthy and diseased sites. J. Periodont. Res., 1997, 32, 6, 524- 529. 12. Rawlinson A., et al.: Interleukin-1 and IL-1 receptor antagonist in gingival crevicular fluid. J. Clin. Periodont., 2000, 27, 10, 738- 743. 13. Rawlinson A., et al.: Interleukin 1 and receptor antagonist levels in gingival crevicular fluid in heavy smokers versus non- smokers. J. Clin. Periodontol., 2003, 30, 1, 42-48. 14. Arend W.P.: Interleukin-1 Receptor Antagonist. Adv. Immunol. 1993, 54, 167-227. 15.Fletcher J., et al.: Interactions between periodonthopathogenic bacteria and cytokines. J. Periodont. Res., 1997, 32, 200- 205. 16.Schytte Blix I. J., et al.: Lipopolysaccharide from Actinobacillus actinomycetemcomitans stimulates production of interleukin-1b, tumor necrosis factor-a, interleukin-6, and interleukin-1 receptor antagonist in human whole blood. J. Periodont. Res., 1999, 34, 34-40.
otrzymano: 2006-02-13
zaakceptowano do druku: 2006-02-22

Adres do korespondencji:
*Anna Maria Wasilewska
Zakład Stomatologii Zachowawczej IS AM w Warszawie
ul. Miodowa 18, 00-246 Warszawa
tel. (0-22) 502-20-31
e-mail: M.Sobczak@mediclub.pl

Nowa Stomatologia 1/2006
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia