Wybrane przykłady wykorzystania mikroskopii sił atomowych w badaniach nano-struktury szkliwa – doniesienie wstępne¹

Mikroskop sił atomowych (AFM), skonstruowany w 1986 roku, umożliwia uzyskanie obrazu powierzchni ze zdolnością rozdzielczą rzędu wymiaru atomów. Zasada działania tego systemu wykorzystuje siły oddziaływań międzyatomowych, powstałych podczas skanowania igłą powierzchni badanej próbki. Prezentowana technika znajduje szczególne zastosowanie w badaniach struktury, własności i dynamiki biomateriałów.

Podstawy teoretyczne budowy systemu AFM oraz możliwości jego wykorzystania omówiono we wcześniejszej publikacji (1).

W badaniach dla potrzeb stomatologii mikroskopia sił atomowych wykorzystywana jest od niedawna. Pozwala ona śledzić złożone zjawiska zachodzące na pograniczu powierzchni zęba i środowiska jamy ustnej. Przewidywana wysoka czułość techniki AFM umożliwia ocenę zmian toczących się w tkankach na poziomie subklinicznym, pod wpływem wielu zjawisk chemicznych i fizycznych. Analiza przeglądu piśmiennictwa zachęciła autorów do podjęcia badań własnych z zastosowaniem techniki AFM. Celem pracy była prezentacja wybranych przykładów zastosowania mikroskopii sił atomowych (AFM) w ocenie struktury szkliwa ludzkiego.

Jako materiał do badań in vitro wykorzystano ludzkie zęby usunięte z różnych wskazań stomatologicznych. Zęby po ekstrakcji płukano pod bieżącą wodą, oczyszczano mechanicznie i przechowywano w roztworze wody destylowanej z dodatkiem kryształków tymolu. Oczyszczone i utrwalone zęby wykorzystywano do dalszych badań w postaci próbek szkliwa.

Przygotowano 15 próbek szkliwa (3 mm x 4 mm) zatopionych w sześciennych bloczkach akrylowych (Durabase), które następnie płukano w myjce ultradźwiękowej i szlifowano oraz polerowano papierem z ostatecznym nasypem ziarna 0,3 ?m. Widok przygotowanych próbek przedstawia rycina 1. Próbki podzielono na cztery grupy i poddano wybranym procedurom chemicznym i fizycznym. Wykaz procedur zastosowanych w poszczególnych grupach badawczych zestawiono w tabeli 1. W grupie A wykorzystano kontrolne próbki szkliwa prawidłowego. W grupie B uwzględniono próbki szkliwa prawidłowego, które na okres 24 h umieszczono w cieplarce, w temperaturze 37°C, w mieszaninie ludzkiej śliny. W grupie C znalazły się próbki, które po 24-godzinnej inkubacji w ludzkiej ślinie poddano działaniu preparatu wybielającego zawierającego 14% H₂O₂ (blend a med, Whitestrips Supreme) przez okres 30 minut. Grupa D zawierała próbki, na powierzchnie których aplikowano 60 ?l coca-coli na okres 3 min.

Po przeprowadzeniu wyżej opisanych procedur, powierzchnie wszystkich próbek oceniano z zastosowaniem systemu nanotechnologii. W badaniach użyto Mikroskop Sił Atomowych AFM Digital Instruments (USA) NanoScope IV, pracując w trybie Taping mode (ryc. 2).

Obrazy powierzchni szkliwa poddanego wybranym procedurom badawczym, zarejestrowane z użyciem mikroskopu sił atomowych zaprezentowano na rycinach 3-6.

Na rycinie 3 widoczny jest obraz szkliwa prawidłowego (grupa A), z uporządkowaną strukturą krystaliczną, złożoną ze ściśle upakowanych kryształów, otoczonych przestrzeniami między-pryzmatycznymi o niewielkim świetle.

Rycina 4 obrazuje próbkę szkliwa prawidłowego, inkubowanego w ludzkiej ślinie (grupa B). Na gładkiej powierzchni szkliwa widoczne są ziarniste, nieregularnie rozmieszczone, pojedyncze złogi. Zaadsorbowane złogi cechuje budowa wielkocząsteczkowa.

Obraz AFM szkliwa poddanego działaniu środka wybielającego (grupa C) zaprezentowano na rycinie 5. Analiza fotogramu wykazała, tworzenie się regularnych mikro-zagłębień na powierzchni szkliwa, o ograniczonej głębokości, sięgającej od 1 do 5 nm (ryc. 5).

Powierzchnię szkliwa trawionego napojem Coca-cola (grupa D) zilustrowano na rycinie 6. Obrazy AFM pozwalają zaobserwować już po 3 min. pojawienie się na powierzchni szkliwa zagłębień o nieregularnym zarysie i zróżnicowanej głębokości, sięgającej od 10 do 30 nm.

– Mikroskopia sił atomowych umożliwia uzyskanie obrazu o dużej precyzji, przez co pozwala na szczegółową ocenę jakości badanej powierzchni.

– Użycie systemu AFM pozwala rejestrować i monitorować wczesne stadia wielu procesów toczących się na powierzchni szkliwa.

Prezentowane wyniki badań wstępnych świadczą o szerokiej gamie możliwości wykorzystania nano-technologii do oceny stanu tkanek zęba i analizy zjawisk zachodzących w jamie ustnej. Otrzymane fotogramy uznać można za specyficzne mapy topograficzne, które cechuje wysoka rozdzielczość i dokładność odwzorowania szczegółów. Na uwagę zasługuje również fakt, iż mikroskopia sił atomowych ma zdolność obrazowania bardzo wstępnych faz procesów biologicznych zachodzących na powierzchni szkliwa.

W obrazie próbek szkliwa inkubowanego w ślinie obserwowano nieregularnie rozmieszczone złogi, będące zaadsorbowanymi makromolekułami pochodzenia ślinowego. Uważa się, że struktura ta obrazuje powstanie bezkomórkowej białkowej błonki nabytej – wstępnej fazy tworzenia biofilmu bakteryjnego. Podobne obserwacje poczynili Hannig i wsp. (2) w badaniach in situ, w których obserwowali początkowe etapy tworzenia się pellikuli, adsorpcję biopolimerów i kolejnych warstw struktur bakteryjnych na powierzchni zębów. Badania niemieckich autorów umożliwiły dokładne poznanie morfogenezy i ultrastruktury biofilmu bakteryjnego, który uznawany jest za główny czynnik etiologiczny wielu procesów patologicznych toczących się w jamie ustnej. Uzyskane w obecnych badaniach wyniki potwierdzają możliwość obrazowania i monitorowania szybkości nawarstwiania się biofilmu bakteryjnego na powierzchni szkliwa.

W pracy oceniono stan powierzchni szkliwa po aplikacji środka wybielającego zawierającego 14% H₂O₂. Zaobserwowano zmiany w strukturze szkliwa już po 30 min. działania preparatu. Uzyskane fotogramy wykazały jednoznacznie tworzenie się regularnych mikrozagłębień, co świadczy o przenikaniu molekuł H₂O₂ przez pory szkliwa do jego wnętrza i destabilizacji jego struktury krystalicznej. Otrzymane wyniki znalazły potwierdzenie w badaniach Hegedusa i wsp. (3). Autorzy oprócz zmian strukturalnych szkliwa i zębiny powstałych pod wpływem H₂O₂ opisali przebieg reakcji nadtlenku wodoru z podpowierzchniową macierzą organiczną. Prowadzone w późniejszych latach badania Chnga i wsp. (4) potwierdziły wpływ stosowania wysokoprocentowych preparatów H₂O₂ na spadek twardości i elastyczności zębiny około-kanalikowej.

Przeprowadzona wstępnie rejestracja obrazów szkliwa poddanego działaniu coca-coli techniką AFM potwierdza możliwość obserwacji wstępnych faz zmian erozyjnych. Analiza odpowiadających fotogramów wykazała wyraźne pojawienie się nieregularnych zagłębień na powierzchni szkliwa. Uzyskane uszkodzenia struktury pryzmatycznej szkliwa są typowe dla wczesnych zmian erozyjnych, powstałych pod wpływem roztworów o niskim pH, zawierających jony fosforanowe.

Kinetykę procesów de- i remineralizacji wczesnych stadiów rozwoju erozji szkliwa, uwzględniając własności nano-mechaniczne i tempo odkładania się minerałów na odwapnionej powierzchni szkliwa badali również Lippert i wsp. oraz Charig i wsp. (5, 6). Autorzy dzięki technice AFM ocenili tempo procesów naprawy nano-uszkodzeń powierzchni szkliwa w postaci mikropęknięć, zmian erozyjnych czy naturalnych nierówności, po aplikacji różnych formuł past do zębów z zawartością dwuwęglanu wapnia.

Prezentowane badania wstępne świadczą o szerokiej gamie możliwości wykorzystania nanotechnologii do oceny stanu tkanek zęba i analizy zjawisk zachodzących w jamie ustnej. Mikroskopia sił atomowych jest tańszą alternatywą mikroskopii elektronowej, umożliwiającą uzyskanie obrazu o większej precyzji oraz szczegółowych informacji charakteryzujących własności fizyczne badanych powierzchni. Kontynuacja prowadzonych badań umożliwi bardziej szczegółowe poznanie przemian strukturalnych zachodzących w twardych tkankach zęba w przebiegu wielu procesów fizjologicznych i patologicznych.