Czytelnia Medyczna » Nowa Stomatologia » 4/2003 » Poszukiwanie naturalnych inhibitorów aktywności glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych

- reklama -

Fitomed
kosmetyki ziołowe

Usługi na jak najwyżym poziomie - serwis narciarski Warszawa

- reklama -

Małgorzata Pleszczyńska¹, Adrian Wiater¹, Janusz Szczodrak¹, Teresa Bachanek²

Poszukiwanie naturalnych inhibitorów aktywności glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych

Searching for natural substances inhibiting glucosyltransferases from mutans streptococci

¹ z Zakładu Mikrobiologii Przemysłowej, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Janusz Szczodrak
² z Katedry i Zakładu Stomatologii Zachowawczej Akademii Medycznej w Lublinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Teresa Bachanek

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Stomatologia zachowawcza wieku rozwojowego

Stomatologia zachowawcza

Protezy szkieletowe

Próchnica zębów jest wypadkową wielu zjawisk, jednak podstawowe znaczenie ma w tym procesie płytka nazębna, czyli skupisko bakterii pokrywających powierzchnię zęba, osadzonych w podłożu zbudowanym z polimerów pochodzenia bakteryjnego lub ślinowego. Z całej gamy mikroorganizmów zasiedlających jamę ustną, najbardziej zaangażowane w wywoływanie i rozwój próchnicy zębów są paciorkowce zmienne, głównie Streptococcus mutans i S. sobrinus (1). Ich szczególne znaczenie w patogenezie próchnicy wynika z faktu, że wykorzystując sacharozę wytwarzają zewnątrzkomórkowe, rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie wielocukry (dekstrany i mutany), budujące szkielet płytki nazębnej. Enzymy biorące udział w syntezie wymienionych glukanów – glukozylotransferazy (GTF, E.C. 2.4.1.5) są więc istotnym czynnikiem wirulencji paciorkowców zmiennych (2). Funkcje glukanów w płytce nazębnej wyznacza ich budowa. Lepki, nierozpuszczalny mutan (liniowy a(1,3) glukan) ułatwia adsorbowanie się bakterii do powierzchni szkliwa, doprowadza do wytworzenia stabilnego połączenia pomiędzy paciorkowcami a błoną nazębną, a także umożliwia agregację bakterii występujących w niezależnych łańcuchach. W ten sposób odpowiada za zwiększenie masy płytki i jej ścisłe połączenie ze szkliwem (3). Rozpuszczalny dekstran (rozgałęziony a(1,6) glukan) stanowi rezerwę węglowodanową dla dalszych przemian metabolicznych w sytuacji niedoboru cukru w pożywieniu (4).

W praktyce stosowane są różne czynniki hamujące rozwój płytki nazębnej. Działają one poprzez redukcję istniejącej płytki, ochronę przed powstawaniem nowej, selektywne hamowanie wzrostu bakterii próchnicotwórczych i hamowanie czynników wirulencji, np. produkcji kwasu mlekowego i syntezy glukanów (5). Mogą to być zarówno środki chemiczne, np. chlorheksydyna, jak i – w ostatnich latach znowu coraz szerzej wykorzystywane – preparaty naturalne, np. wyciągi roślinne.

Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu wybranych surowców zielarskich na aktywność glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych.

MATERIAŁ I METODY BADAŃ

Do badań użyto dwóch szczepów paciorkowców zmiennych, Streptococcus sobrinus DSMZ 20381 i Streptococcus mutans CAPM 6067. Hodowano je na podłożu płynnym z wyciągiem mózgowo-sercowym – BHI (BTL, Polska) w warunkach statycznych i w temperaturze 37°C, przez okres 18 godz. Po zakończeniu hodowli bakterie usuwano przez wirowanie, a uzyskany supernatant, w postaci pierwotnej lub zagęszczony na drodze ultrafiltracji, służył jako surowy preparat zewnątrzkomórkowych glukozylotransferaz.

Zbadano jaki wpływ na aktywność GTF-az mają następujące surowce zielarskie: ziele jemioły, skrzypu, glistnika, liść pokrzywy, porzeczki czarnej, orzecha włos- kiego, kłącze pięciornika, korzeń mydlnicy lekarskiej (Zakład Zielarski „Kawon-Hurt”, Gostyń), kora dębu, owoc dzikiej róży, kłącze tataraku, korzeń prawoślazu lekarskiego, liść szałwii i mięty pieprzowej, ziele macierzanki i tymianku (Zakład Przetwórstwa Zielarskiego „Herba-Lux”, Warszawa). Wymienione zioła zastosowano w postaci 4% wyciągu wodnego, a kłącze pięciornika dodatkowo w postaci liofilizowanego ekstraktu etanolowo-wodnego. Dla porównania jako inhibitora enzymów użyto również kwasu elagowego (Sigma-Aldrich, USA) w postaci dwóch pochodnych, sodowej i argininowej, które w przeciwieństwie do związku wyjściowego dobrze rozpuszczają się w wodzie (6).

Do oceny wpływu badanych substancji na ogólną aktywność glukozylotransferaz wykorzystano metodę opisaną przez Smitha i wsp. (7). Mieszaninę reagującą zawierającą 0,9 ml 0,25 M sacharozy w 0,2 M buforze potasowo-fosforanowym o pH 6,0, surowy preparat GTF-az, inhibitor w odpowiednim stężeniu oraz bufor fosforanowy w uzupełnieniu do całkowitej objętości 2 ml, inkubowano w temperaturze 37°C w czasie 60 minut. Po tym czasie, wobec odpowiednich kontroli, oznaczano stężenie cukrów redukujących metodą kolorymetryczną z odczynnikiem DNS (8). Jednostkę aktywności GTF-az (U) definiowano jako 1 mmol fruktozy uwolniony przez enzym z sacharozy w opisanych warunkach w czasie jednej minuty.

Zbadano również oddziaływanie ziół na aktywność enzymów odpowiedzialnych za syntezę nierozpuszczalnego w wodzie mutanu. Wykonano w tym celu oznaczenia turbidymetryczne (9): mieszanina reagująca zawierała 1 ml niezagęszczonego preparatu glukozylotransferaz S. sobrinus, 2 ml 6% roztworu sacharozy w 0,1 M buforze potasowo-fosforanowym o pH 6,0, odpowiednią ilość inhibitora (ekstrakt z pięciornika lub pochodne kwasu elagowego) oraz bufor w uzupełnieniu do całkowitej objętości 4 ml. Jako środek konserwujący zastosowano azydek sodu w stężeniu 0,01%. Mieszaninę inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji, zmętnienie utworzone przez powstający glukan mierzono wobec właściwych kontroli w spektrofotometrze (Cecil, Wielka Brytania) przy długości fali 560 nm.

Wpływ inhibitora na właściwości adhezyjne nierozpuszczalnego w wodzie mutanu określano prowadząc syntezę tego biopolimeru w probówkach zawierających 10 ml niezagęszczonego surowego preparatu glukozylotransferaz S. sobrinus z dodatkiem 3% sacharozy i 0,01% NaN₃ oraz z odpowiednią ilością inhibitora. W probówkach zanurzano płytki szklane o szerokości 5 mm i inkubowano je 24 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie płytki wyjmowano, opłukiwano delikatnie w wodzie, a następnie barwiono osadzony na nich mutan roztworem erytrozyny. Intensywność zabarwienia, która odpowiadała ilości przyczepionego do płytek mutanu mierzono spektrofotometrycznie wobec właściwych kontroli.

Analizy wykonywano w trzech powtórzeniach. Zamieszczone wyniki stanowią średnią z wszystkich pomiarów. Procent zahamowania aktywności GTF-az i aktywność względną tych enzymów wyrażano w stosunku do kontroli bez inhibitora.

WYNIKI

W pierwszym etapie badań oceniono wpływ wyciągów wodnych z osiemnastu ziół na ogólną aktywność glukozylotransferaz dwóch szczepów Streptococcus. W tym celu aktywność enzymów oznaczano w obecności potencjalnych inhibitorów. Obniżenie aktywności GTF-az w stosunku do kontroli bez inhibitora zaobserwowano tylko w przypadku pięciu ziół: róży, porzeczki czarnej, tataraku, orzecha włoskiego i pięciornika kurze ziele (tab. 1). Najsilniej hamował ogólną aktywność GTF-az obu szczepów wodny wyciąg z kłącza pięciornika, przy czym wraz ze wzrostem zawartości inhibitora, w przedziale od 2,5 do 10 mg/ml, ilość glukanów syntetyzowanych przez glukozylotransferazy bakterii spadała stopniowo aż do poziomu około 80% (ryc. 1).

Tabela 1. Wpływ wyciągów wodnych z ziół na ogólną aktywność glukozylotransferaz badanych szczepów paciorkowców zmiennych.

Inhibitor	Aktywność ogólna glukozylotransferaz
	S. mutans 6067			S. sobrinus 20381
	(U/ml)	Względna(%)	Hamowanie(%)	(U/ml)	Względna(%)	Hamowanie(%)
Brak	0,9491	100,0	0	0,0748	100,0	0
Róża	0,8588	90,5	9,5	0,0707	94,5	5,5
Porzeczka czarna	0,7170	75,5	24,5	0,0629	84,1	15,9
Orzech włoski	0,8098	85,3	14,7	0,0660	88,3	11,7
Tatarak	1,0135	106,8	-	0,0557	74,5	25,5
Pięciornik	0,1728	18,2	81,8	0,0179	23,9	76,1

Ryc. 1. Wpływ wyciągu wodnego z pięciornika na ogólną aktywność glukozylotransferaz badanych szczepów paciorkowców zmiennych.

Biorąc pod uwagę fakt, że zdolność ekstraktu z pięciornika do hamowania ogólnej aktywności GTF-az była o wiele większa niż w przypadku pozostałych ziół, dalsze badania dotyczyły określenia wpływu tylko tego inhibitora na aktywność GTF-az odpowiedzialnych za syntezę nierozpuszczalnego glukanu oraz na przyczepność syntetyzowanego przez nie polimeru. W celu lepszego wyługowania substancji czynnych zawartych w kłączu pięciornika przygotowano w tym wariancie doświadczeń jego ekstrakt etanolowo-wodny i zastosowano go w miejsce używanego dotychczas wyciągu wodnego. Źródłem glukozylotransferaz syntetyzujących nierozpuszczalny w wodzie mutan był płyn po hodowli S. sobrinus, który to szczep uwalnia wspomniane GTF-azy do podłoża, w przeciwieństwie do S. mutans, gdzie są one związane z powierzchnią komórki i przez to trudniejsze do preparowania (10, 11).

Jak widać z przedstawionych danych, liofilizat ekstraktu etanolowo-wodnego z kłącza pięciornika już w stężeniu 320 mg/L powodował około 60% spadek aktywności GTF-az odpowiedzialnych za syntezę mutanu. Ponadto wykazano, że przy tym stężeniu obecność substancji zawartych w ekstrakcie w środowisku, w którym zachodzi synteza glukanu, powoduje prawie całkowitą utratę właściwości adhezyjnych polimeru.

Analogiczne badania przeprowadzono używając w charakterze inhibitora aktywności glukozylotransferaz pochodnych kwasu elagowego. Nie zaobserwowano ich negatywnego oddziaływania na ogólną aktywność glukozylotransferaz (dane niepublikowane), ale ustalono, że – aż do stężenia 200 mg/L – obie pochodne hamują aktywność GTF-az syntetyzujących mutan w sposób podobny do pięciornika, przy czym warunki eksperymentu nie pozwoliły na dalsze zwiększenie stężenia inhibitorów (ryc. 2 – str. 166). Oba związki powodują również około 80% obniżenie przyczepności mutanu już w stężeniach 25-50 mg/L (ryc. 3 – str. 166).

Ryc. 2. Oddziaływanie różnych stężeń ekstraktu z pięciornika oraz pochodnych kwasu elagowego na aktywność GTF S. sobrinus odpowiedzialnych za syntezę mutanu.

Ryc. 3. Wpływ ekstraktu z pięciornika i pochodnych kwasu elagowego na przyczepność mutanu syntetyzowanego przez GTF S. sobrinus.

DYSKUSJA

Glukozylotransferazy wytwarzane przez paciorkowce zmienne, takie jak S. mutans i S. sobrinus, odgrywają kluczową rolę w procesie powstawania próchnicy zębów, ponieważ syntetyzowane przez nie glukany – szczególnie typu mutanu – zwiększają przyczepność i kolonizację bakterii próchnicotwórczych. Połączenie zdolności do syntezy takich glukanów z możliwością fermentowania różnych cukrów do kwasów organicznych, czyni paciorkowce zmienne próchnicotwórczymi.

Wynika z tego, że można skutecznie przeciwdziałać próchnicy ograniczając aktywność glukozylotransferaz. Aktywność tą pośrednio hamują pewne cukry, np. fruktoza, izomaltoza i palatinoza. Bezpośrednio zaś działają na GTF-azy niektóre substancje pochodzenia naturalnego (10).

Wyciąg z kłącza pięciornika kurze ziele (Potentilla erecta) okazał się najsilniejszym inhibitorem glukozylotransferaz S. mutans i S. sobrinus spośród badanych w tej pracy surowców zielarskich. Związki zawarte w ekstrakcie silnie hamowały ogólną aktywność glukozylotransferaz, aktywność enzymów syntetyzujących nierozpuszczalny w wodzie glukan oraz redukowały przyczepność mutanu do twardych powierzchni.

W literaturze specjalistycznej brak jest danych o przeciwpróchnicowym działaniu pięciornika. Wiadomo jednak, że kłącze tej rośliny zawiera 18,5-23,5% związków polifenolowych należących do garbników (tanin) hydrolizujących i skondensowanych, terpeny, kwasy organiczne (m.in. kwas elagowy), substancje żywicowe, woski i sole mineralne (6). Prowadzone ostatnio badania wskazują, że efektywnymi czynnikami redukującymi próchnicę in vitro i in vivo są polifenole ekstrahowane z różnych roślin. Szczególnie silne działanie wykazują związki obecne w herbacie. Poza tym, że hamują one wzrost bakterii próchnicotwórczych, to powodują dodatkowo ograniczenie syntezy mutanu i zahamowanie wytwarzania kwasu mlekowego. Udowodniono, że takie właśnie działanie mają galusany (-) epikatechiny, (-) epigalokatechiny i (-) galokatechiny znajdujące się w liściach herbaty zielonej oraz teaflawiny i tearubiginy – utlenione i spolimeryzowane formy flawanoli obecne w fermentowanej herbacie czarnej i ulung (12, 13).

Jednak herbata to nie jedyne źródło polifenoli. Bliżej niezidentyfikowane wysokocząsteczkowe flawonoidy wykryto w ekstraktach z szyszek chmielowych. Wykazano, że związki te działają silnie hamująco na GTF. Lżejsza frakcja, obejmująca niskocząsteczkowe polifenole typu katechiny i epikatechiny, blokuje aktywność tych enzymów w stopniu nieco mniejszym, ale wciąż znaczącym (14). Również Yanagida i wsp. (15) donoszą o zdolności pewnych związków polifenolowych wyizolowanych z jabłek do hamowania aktywności glukozylotransferaz paciorkowcowych. Badacze ci starali się również ustalić związek pomiędzy strukturą polifenoli roślinnych a ich zdolnością do hamowania próchnicy. W tym celu porównali wpływ różnych polifenoli na aktywność GTF-az S. sobrinus i S. mutans. Wykazali, że większość niskocząsteczkowych polifenoli nie hamuje aktywności tych enzymów, wyjątek stanowią kwas elagowy i galusan epigalokatechiny. Silne działanie hamujące miały natomiast związki o dużym ciężarze cząsteczkowym, np. kwas taninowy i taniny skondensowane. Opisano też możliwy mechanizm działania tych związków. Według cytowanych badaczy, właściwości inaktywujące wielkocząsteczkowych garbników skondensowanych opierają się na ich zdolnościach do niespecyficznego wiązania się z białkami. Na przykład wiążą się one z hemoglobiną i to tym silniej im większa jest ich masa cząsteczkowa (16). Niemniej istnieją dane świadczące o pewnej selektywności działania tych polifenoli w stosunku do GTF-az. Taniny hydrolizujące oddziaływują na białka w sposób bardziej selektywny. Nie wiążą się one z hemoglobiną, natomiast inaktywują a-amylazę ślinową, która posiada podobną do glukozylotransferaz strukturę (b/a)₈ cylindra. Garbniki skondensowane wpływają na aktywność a-amylazy jedynie w znikomym stopniu.

Jak już wspomniano działanie przeciwpróchnicowe wykazują też taniny hydrolizujące. Pochodne kwasu elagowego zmniejszają zależne od sacharozy przyleganie bakterii do twardych powierzchni. Według Sawamury i wsp. (6) związki te silnie, a przy stęż. 40 mg/L – już całkowicie, hamują aktywność GTF-az uwalnianych do podłoża przez szczep S. mutans MT8148, podczas, gdy prawie nie wpływają one na GTF tego samego szczepu związane ze ścianą komórkową. Wolne enzymy syntetyzują tu głównie glukan rozpuszczalny, a związane ze ścianą – nierozpuszczalny. Badacze dostrzegli również, że pochodne kwasu elagowego hamują syntezę mutanu u S. sobrinus 6715, a nie wpływają na jego glukozylotransferazy syntetyzujące glukany rozpuszczalne w wodzie. Spostrzeżenia te są zbieżne z wynikami przedstawionymi w niniejszej pracy. Pochodne kwasu elagowego ograniczają syntezę glukanu nierozpuszczalnego i jego osadzanie się na powierzchniach twardych już w stężeniach rzędu 25-50 mg/L. Inaktywują one glukozylotransferazy produkowane przez S. sobrinus 20381, które są odpowiedzialne za syntezę mutanu (obie pochodne działają podobnie). Związki te nie hamują jednak aktywności ogólnej GTF-az. Znajdujący się w kłączu pięciornika kwas elagowy jest więc, obok garbników, jednym z potencjalnych czynników wpływających na zdolność tego kłącza do hamowania aktywności glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych.

W podsumowaniu należy stwierdzić, że głównym osiągnięciem przeprowadzonych badań było wykrycie, że substancje zawarte w ekstrakcie z kłącza pięciornika kurze ziele hamują aktywność paciorkowcowych glukozylotransferaz, co dotychczas nie zostało opisane w literaturze specjalistycznej. Wykazano, że wyciągi z pięciornika ograniczają zarówno ogólną aktywność glukozylotransferaz, jak i aktywność GTF-az syntetyzujących glukan nierozpuszczalny oraz znoszą przyleganie mutanu do twardych powierzchni.

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Biochemia jamy ustnej

Stomatologia zachowawcza tom 1

Periodontologiczno implantologiczna chirurgia plastyczna

Piśmiennictwo

1. Marsh P.D., Martin M.: Mikrobiologia jamy ustnej. Warszawa: PWN; 1994. 2. Fujiwara T. et al.: Molecular analyses of glucosyltransferase genes among strains of S. mutans. FEMS Microbiol Lett 1998; 161:331-6. 3. Jańczuk Z.: Stomatologia zachowawcza. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL; 1999. 4. Ebisu S. et al.: The structure of water-insoluble glucans of cariogenic S. mutans formed in the absence and presence of dextranase. Carbohydr Res 1974; 38:374-81. 5. Marsh P.D.: Microbiological aspects of the chemical control of plaque and gingivitis. J Dent Res 1992; 71:1431-8. 6. Sawamura S. et al.: Inhibitory effects of ellagic acid on glucosyltransferases from mutans streptococci. Biosci Biotech Biochem 1992; 56:766-8. 7. Smith D.J. et al.: Preparation of glucosyltransferase from Streptococcus mutans by elution from water-insoluble polysaccharide with a dissociating solvent. Infect Immun 1979; 23:446-52. 8. Miller G.L.: Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 1959; 31:426-8. 9. Kuramitsu H., Wondrack L.: Insoluble glucan synthesis by Streptococcus mutans serotype c strains. Infect Immun 1983; 42:763-70. 10. Hamada S. et al.: Development of preventive measures based on the aetiology of dental caries: A review. Microbial Ecol Health Dis 1996; 9:349-57. 11. Loesche W.J.: Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev 1986; 50:353-80. 12. Matsumoto M. et al.: Inhibitory effects of oolong tea extract on caries-inducing properties of mutans streptococci. Caries Res 1999; 33:441-5. 13. Ooshima T. et al.: Reduction of dental plaque deposition in humans by oolong tea extract. Caries Res 1994; 28:146-9. 14. Tagashira M. et al.: Inhibition by hop bract polyphenols of cellular adherence and water-insoluble glucan synthesis of mutans streptococci. Biosci Biotech Biochem 1997; 61:332-5. 15. Yanagida A. et al.: Inhibitory effects of apple polyphenols and related compounds on cariogenic factors of mutans streptococci. J Agric Food Chem 2000; 48:5666-71. 16. Okuda T. et al.: Relationship of the structures of tannins to the binding activities with hemoglobin and methylene blue. Chem Pharm Bull 1985; 33:1424-33.

Nowa Stomatologia 4/2003
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia

Powrót na górę strony

Pozostałe artykuły z numeru 4/2003:

- reklama -