Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Stomatologia 1/2004, s. 43-45
Wojciech Kamysz1, Marcin Okrój2, Jerzy Łukasiak1, Anna Kędzia3
Histatyny – białka ślinowe bogate w histydynę
Histatins – histidine-rich salivary proteins
1 z Katedry i Zakładu Chemii Fizycznej, Wydziału Farmaceutycznego, Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik: prof. dr hab. Jerzy Łukasiak
2 z Zakładu Biologii Komórki, Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii,
Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik Zakładu: dr hab. Jacek Bigda, prof. AMG
3 z Zakładu Mikrobiologii Jamy Ustnej, Akademii Medycznej w Gdańsku
Kierownik Zakładu: dr hab. Anna Kędzia, prof. AMG
WPROWADZENIE
Ślina stanowi płynne środowisko jamy ustnej w skład którego wchodzi poza wodą (99%), szereg związków nieorganicznych i organicznych (1). Do nieorganicznych składników śliny należą kationy (sodu, potasu, wapnia, magnezu i in.) oraz aniony (fluorkowe, chlorkowe, fosforanowe, węglanowe i in.). Ślina zawiera też dużą grupę związków organicznych, z których najważniejsze to białka i peptydy oraz niebiałkowe substancje azotowe (mocznik, kreatynina, kwas moczowy, aminokwasy), węglowodany, lipidy.
Spośród związków o charakterze peptydowym występujących w ślinie wyróżnić można dużą grupę peptydów przeciwdrobnoustrojowych będących nieswoistymi czynnikami obronnymi jamy ustnej. Związki te zwane endogennymi antybiotykami peptydowymi należą do jednych z najstarszych ewolucyjnie elementów obrony nieswoistnej organizmu przed patogenami. Są one powszechne w całym taksonie Eucaryota, począwszy od pierwotniaków aż do ssaków naczelnych (2). U wyższych organizmów występują na powierzchniach eksponowanych do środowiska zewnętrznego takich jak błony śluzowe układu pokarmowego, oddechowego, moczopłciowego, w jamie ustnej oraz na skórze. Ponadto peptydy przeciwdrobnoustrojowe produkowane są przez neutrofile (3). Ich mechanizm działania polega zazwyczaj na wiązaniu się z błoną komórkową drobnoustroju i jej permeabilizacji (4). Powstanie porów w błonie prowadzi do niekontrolowanego przemieszczenia się jonów i związków organicznych, ucieczki ATP, napływu wody i ostatecznie śmierci komórki. Niektóre peptydy, takie jak attacyny, defensyny, PR-39 czy buforyny są w stanie wywołać śmierć drobnoustroju w sposób niezależny od permeabilizacji błony (5-8).
W ślinie wykazano obecność kilku grup peptydów i białek przeciwdrobnoustrojowych. Należą do nich m.in. mucyny, białka bogate w prolinę (PRPs), cystatyny, staternyn oraz niskocząsteczkowe białka z rodziny histatyn. O ile mucyny, cystatyny i stateryny mogą występować również we łzach, wydzielinie nosowej czy pocie to PRPs i histatyny są peptydami charakterystycznymi wyłącznie dla śliny (9).
HISTATYNY
Histatyny swoją nazwę zawdzięczają znacznemu udziałowi aminokwasu histydyny w swojej strukturze pierwszorzędowej. Syntetyzowane są przez komórki przewodów wyprowadzających ślinianek: przyusznej i podżuchwowej. Obecnie znanych jest 12 peptydów zaliczanych do grupy histatyn (10). Wszystkie one nie przekraczają wielkości 4 kDa, a w strukturze pierwszorzędowej obok aminokwasu histydyny obserwuje się duży udział reszt lizyny i argininy. Słaby charakter amfifilowy i brak mostków disulfidowych wyróżnia histydyny spośród innych grup peptydów przeciwdrobnoustrojowych (11). Histatyna 1, 3 oraz 5 stanowią około 80% wszystkich histatyn w ślinie (ryc. 1) (10). Stężenie tych trzech związków waha się w granicach od 50-425 mg/ml (12). Histatyna 1 i 3 są kodowane przez dwa blisko spokrewnione geny HIS1 i HIS2 (13). Uważa się, iż pozostałe histatyny nie mają własnych genów i są produktami proteolizy histatyn 1 oraz 3, tudzież alternatywnego składania transkryptu (histatyna 5).
Ryc. 1. Struktura pierwszorzędowa wybranych histatyn (10).
PRZECIWDROBNOUSTROJOWE WŁAŚCIWOŚCI HISTATYN
Przypuszcza się, że jedną z głównych funkcji histatyn w jamie ustnej jest zapobieganie powstawaniu grzybic. Hipoteza ta została poparta obserwacją, iż u pacjentów zakażonych wirusem HIV, u których dochodzi do oportunistycznych zakażeń jamy ustnej grzybami z rodzaju Candida notuje się obniżony poziom histatyn w ślinie (14). Podobnie, pacjenci cierpiący na zespół Sjogrena, gdzie dochodzi do autoimmunizacji gruczołów zewnątrzwydzielniczych, przejawiają wyższą zapadalność na grzybice jamy ustnej (15). Podobny problem występuje u pacjentów z niedoborami odporności oraz u biorców przeszczepów po immunosupresji. W badaniach in vitro udowodniono przeciwgrzybicze właściwości histatyn wobec grzybów z rodzaju Candida, Cryptococcus, Aspergillus (15-17) oraz wobec bakterii Streptococcus mutans i Porphyromonas gingivalis (18). Histatyny w przeciwieństwie do konwencjonalnych leków przeciwgrzybiczych (np. z grupy azoli) wykazują niską toksyczność. W ograniczonym też stopniu powodują powstawanie opornych szczepów grzybów.
MECHANIZM DZIAŁANIA HISTATYN
Mechanizm niszczenia komórek grzybów przez histatyny wydaje się być różny od mechanizmów opisywanych dla innych peptydów przeciwdrobnoustrojowych takich jak defensyny, cekropiny, protegryny. Zazwyczaj amfifilowe, kationowe peptydy oddziaływują z negatywnie naładowanymi fosfolipidami błon komórkowych bakterii, następnie wbudowują się w dwuwarstwę lipidową tworząc poprzeczny kanał jonowy albo powodują lokalną destabilizację struktury błony. Efektem takiego działania jest liza komórek (19). Badania strukturalne histatyn ujawniły słaby amfifilowy charakter tych peptydów oraz tendencję do tworzenia konformacji kłębka statystycznego w roztworach wodnych (20). Cechy te uniemożliwiają spontaniczną, masową agregację histatyn w obrębie błony komórkowej i formowanie porów. Wykazano natomiast, że histatyny akumulują się w mitochondriach komórek drożdży i zaburzają potencjał błony mitochondrialnej (21). Ponadto obecność histatyn powoduje szybki wpływ ATP z komórki, który wiąże się z receptorami purynoergicznymi na powierzchni błony komórkowej. Dopiero aktywacja receptorów purynoergicznych prowadzi do śmierci komórki (22). Innym efektem histatyn, który wydaje się być zaangażowany w unicestwienie komórek grzybów po wcześniejszej internalizacji jest generowanie reaktywnych form tlenu (ROS) (23).
WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNE HISTATYN
Oprócz właściwości przeciwgrzybiczych histatyny posiadają kilka innych funkcji ważnych dla stanu jamy ustnej i uzębienia. Ślina ludzka jest przesycona solami fosforanowo-wapniowymi, które tworzą szkliwo zębów. Ta właściwość śliny zapewnia zębom ochronę zarówno poprzez zapobieganie rozpuszczaniu szkliwa zębów jak również uniemożliwianie oddziaływania na szkliwo zębów kwasów wytwarzanych przez bakterie jako produkty metabolizmu. Oprócz tego przesycona ślina bierze udział w rekalcyfikacji wielu wczesnych stadiów próchnicy. Jednak mimo swej funkcji ochronnej, przesycenie śliny może nieuchronnie prowadzić do niepożądanego wytrącania soli fosforanowo-wapniowych w gruczołach ślinowych oraz na powierzchni zębów. Histatyny mogą wiązać się do kryształów hydroksyapatytu i zapobiegać ich wytrącaniu w warunkach przesycenia względem fosforanu i wapnia (24). Powyższy mechanizm sugeruje udział histatyn w utrzymywaniu integralności zębów.
Za określoną aktywność histatyn odpowiedzialne są poszczególne fragmenty peptydu. Lokalizację takich regionów w przypadku histatyny 3 prezentuje rycina 2 (25).
Ryc. 2. Biologiczne funkcje określonych fragmentów histatyny 3 (25).
W strukturze histatyn znajduje się domena wiążąca metale, m.in. cynk i miedź. Właściwość ta powoduje, że histatyny zachowują się jak inhibitory metaloproteinaz (MMP), enzymów odpowiedzialnych za degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (26). Aktywność proteolityczna MMP związana jest z patogenezą chorób przyzębia a obecność histatyn w ślinie jest w stanie przeciwdziałać postępowi choroby. Degradacja tkanki przyzębnej może następować również w efekcie działania enzymów produkowanych przez drobnoustroje zasiedlające jamę ustną. Przykładem są gingipainy, proteazy wydzielane przez Porphyromonas gingivalis degradujące kolagen, fibrynę, fibronektynę i białka układu dopełniacza. W badaniach in vitro wykazano hamowanie aktywności enzymatycznej gingipain przez histatynę 5 (26). Zdolność do wiązania miedzi może z kolei przyczyniać się do ograniczenia zasobów tego pierwiastka dla drobnoustrojów zasiedlających jamę ustną. Histatyny wykazują zdolność hamowania uwalniania histaminy przez komórki tuczne, co sugeruje udział tych peptydów w zapobieganiu miejscowym stanom zapalnym (27).
PERSPEKTYWY STOSOWANIA HISTATYN W TERAPII
Wysoka aktywność przeciwgrzybicza, w tym wobec szczepów opornych na klasyczne leki (np. pochodne azolowe) oraz brak toksyczności wobec komórek ludzkich czynią histatyny potencjalnym przedmiotem zainteresowania farmakologii (10). Przy opracowaniu odpowiednich sposobów podania można zastosować je w terapii nie tylko grzybic jamy ustnej i okolic ale również innych narządów. Względnie prosta budowa chemiczna histatyn pozwala na łatwe badanie zależności między strukturą a aktywnością biologiczną. Wyniki tych badań mogą posłużyć do konstrukcji efektywniejszych i trwalszych pochodnych tych naturalnych związków przeciwgrzybiczych. Obecnie na bazie histatyny 3, 5 oraz 8 opracowuje się nowe terapeutyki a 12-aminokwasowy analog histatyny 5 (Demegen P-113) przechodzi III fazę badań klinicznych w leczeniu grzybic u chorych na AIDS (9).
Piśmiennictwo
1. Edgar W.M.: Saliva: its secretion, composition and functions. Br. Dent. J. 1992, 172:305-312. 2. Gaby J.E.: Ubiquitous natural antibiotics. Science 1994, 264:373-4. 3. Lehrer R.I., Ganz T.: Antimicrobial peptides in mammalian and insects host defence. Curr. Opin. Immunol. 1999, 11:23-27. 4. Chmiel D.: Mode of action of antimicrobial peptides. Post. Biol. Kom., suppl. 2001, 16:261-273. 5. Carlsson A. et al.: Attacin – an insect immune protein-binds LPS and triggers the specific inhibition of bacterial outer-mambrane protein synthesis Microbiology 1998, 114:2179-2188. 6. Boman H.G. et al.: Mechanism of action on Escherichia coli of cecropin P1 and PR-39, two antimicrobial peptides from pig intestine. Infect. Immun. 1993, 61:2978-2984. 7. Bateman A. et al.: The effect of HP-1 and related neutrophil granule peptides on DNA synthesis in HL-60 cells. Regul. Pept. 1991, 13:135-143. 8. Park C.B. et al.: Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochem. Biophys. Res. Commun 1998, 244(1):253-7. 9. Schenkels L.C. et al.: Biochemical composition of human saliva in relation to other mucosal fluids. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1995, 6(2):161-75. 10. Tsain H., Bobek L.A.: Human salivary histains: promising anti-fungal therapeutic agents. 1998, 9(4): 480-497. 11. Nibbering P.H. et al.: Antimicrobial peptides: therapeutic potential for the treatment of C andida infections. Expert Opin/ Investing Drugs 2002, 11(2):309-18. 12. Lal K. et al.: Pilot study comparing the salivary carionic protein concentrations in healthy adults and AIDS patients: correlation with antifungal activity. J. Acquir Immune Defic. Syndr. 1992, 5(9):904-14. 13. Sabatini L.M., Azen E.A.: Histatins, a family of salivary histidine-rich proteins, are encoded by at least two loci (HIS1 and HIS2). Biochem Biophys Res. Commun. 1989, 160(2):495-502. 14. Mandel I.D. et al.: Longitudinal study of parotid saliva in HIV-1 infection. J. Oral Pathol. Med. 1992, 21(5):209-13. 15. Abraham C.M. et al.: Evaluation of the levels of oral Candida in patients with Sjogren´s syndrome. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 1998, 86(1):65-8. 16. Helmerhorst E.J. et al.: Amphotericin B – and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrob. Agents Chemothe. 1999, 43(3):702-4. 17. Nikawa H. et al.: Antifungal activity of histatin-5-againts non-albicans Candida species. Oral Microbiol. Immunol 2001, 16(4):250-2. 18. Mac Kay B.J. et al.: Growth-inhibitory and bactericidal effects of human parotid salivary histidine-rich polypeptides on Streptococcus mutans. Infect. Immun. 1984, 44(3):695-70. 19. Ganz T, Lehrer R.I.: Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and application. Molecular Medicine Today 1999, 5:292-297. 20. Tsai H., Bobek L.A.: Salivery histatin 5 is an inhibitor of both host and bacterial enzymes implicated in periodontal disease. Infect. Immun. 2001, 69(3):1402-8. 21. Helerhorst E.J. et al.: Salivary histatin 5 is an inhibitor of both host and bacterial enzymes implicated in periodontal disease. Infect. Immun. 2001, 69(3):1402-8. 22. Koshlukova S.E. et al.: Salivary histatin 5 induces non-lytic release of ATP from Candida albicans leading to cell death. J. Biol. Chem. 1999, 274(27):18872-9. 23. Helmerhorst E.J. et al.: The human salivary peptide histatin 5 exerts ist antifungal activity through the formation of reactive exygen species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98(25):14637-42. 24. Richardson C.F. et al.: The influence of histatin-5 fragments on the mineralization of hydroxyapatite. Arch. Oral. Biol. 1993, Nov, 38(11):997-1002. 25. Lamkin M.S., Oppenheim F.G.: Structural features of salivary function. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1993, 4(3-4):251-9. 26. Gusman H. et al.: Salivary histatin 5 is an inhibitor of both host and bacterial enzymes implicated in periodontal disease. Infect. Immun. 2001, 69(3):1402-8. 27. Sugiyama K. et al.: Rapid purification and characterization of histatins (histidine-rich polypeptides) from human whole saliva. Arch. Oral Biol. 1990, 35(6):415-9.
Adres do korespondencji:
Wojciech Kamysz
Katedra i Zakład Chemii Fizycznej
Wydziału Farmaceutycznego AM,
80-416 Gdańsk, Al. Gen. Hallera 107

Nowa Stomatologia 1/2004
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia