Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Stomatologia 2/2001, s. 11-14
Izabella Strużycka, Katarzyna Rucińska, Marta Radziejewska
Wybrane metody oceny występowania bakterii z gatunku Streptococcus mutans w środowisku jamy ustnej
Methods of evaluation of Streptococcus mutans in the oral cavity
z Zakładu Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Maria Wierzbicka
Bakterie z gatunku Streptococcus mutans (SM) są uznawane za jeden z głównych czynników etiologicznych próchnicy (1, 2, 3, 4). Opublikowano wiele prac naukowych na temat występowania i rozpowszechniania tego drobnoustroju w różnych krajach świata (1, 5, 6).
W wielu populacjach liczba bakterii z rodzaju SM w ślinie stymulowanej jest jednym z kryteriów stosowanych w prognozowaniu próchnicy oraz selekcji grup i indywidualnych osób z ryzykiem próchnicy (1, 3, 7, 8, 9, 10, 11). W związku z powyższym stosowane są różne metody identyfikacji i oceny ilościowej SM, dla potrzeb szerokich badań epidemiologicznych jak i dla potrzeb gabinetu stomatologicznego.
Wśród metod służących ocenie poziomu bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie, płytce nazębnej lub na powierzchni zębów można wyróżnić dwie podstawowe grupy metod. Pierwszą stanowią metody laboratoryjne, drugą zaś takie, które można stosować w warunkach gabinetu stomatologicznego. W przypadku metod laboratoryjnych ślina lub płytka nazębna pobierane od pacjenta są mieszane z podłożem transportowym i przesyłane do laboratorium bakteriologicznego. Po inkubacji na podłożu selektywnym, kolonie Streptococcus mutans na płytkach agarowych są liczone, a ich poziom wyraża się liczbą jednostek tworzących kolonie CFU/ml śliny (CFU – ang. Colony forming units). Istnieje wiele podłoży selektywnych, które używa się do hodowli Streptococcus mutans (6). Niektóre z nich wymieniono w tabeli 1 (5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Podłoża te różnią się między sobą składem i właściwościami (1, 6, 12).
Główny typ podłoży agarowych selektywnych dla bakterii z gatunku Streptococcus mutans to mitis-salivarius-bacitracin (MSB) – agar. Stosując to podłoże można uzyskać wzrost wszystkich serotypów SM z wyjątkiem rzadkiego serotypu a. Bacytracyna spełnia tutaj główną rolę selekcyjną. W przypadku stosowania metody tradycyjnej z użyciem płytek agarowych powszechnie używa się metody rozcieńczeń próbek śliny (zwykle 10, 100, 1000 razy), które następnie w określonej ilości (0,1 ml) umieszcza się na płytkach odpowiednio dla każdego z rozcieńczeń. Po inkubacji liczy się liczbę kolonii i wyraża je liczbą CFU. Procedura jest wielostopniowa, wymaga specjalnie przeszkolonego personelu i oprzyrządowania w postaci płytek, pipet i probówek (6). Z tego też powodu wprowadzono do użycia prostsze metody, które mogą mieć zastosowanie w gabinecie stomatologicznym.
W mikrometodzie wg Westergrena i Krassa (22) wprowadzono modyfikację polegającą na zastosowaniu półautomatycznej mikropipety nakraplającej po 25 ml z każdego rozcieńczenia próbki śliny na 1/3 płytki agarowej. W ten sposób zmniejsza się znacznie liczba potrzebnych płytek agarowych.
Inna metoda oceny poziomu SM w ślinie stymulowanej, znacznie prostsza, tzw. spatula method może być stosowana w badaniach screeningowych a została opisana przez Köhler i Bratthalla (23). Polego ona na zastosowaniu płaskiej szpatułki drewnianej, którą po kontakcie ze śliną odciska się na płytce agarowej. Pacjentowi poleca się żuć kostkę parafiny przez około 3 minuty, a następnie używa się drewnianej szpatułki (151 x 18 mm), aby zebrać ślinę obracając ją około 10 razy w ślinie na języku i usuwając jej nadmiar poprzez lekko zwarte wargi pacjenta. Następnie odciska się natychmiast obie strony szpatułki na płytce agarowej. Inkubacje przeprowadza się przez 48 godzin w temp. 37°C w warunkach beztlenowych (95% N2 + 5% CO2). Liczba jednostek tworzących kolonie dwóch odcisków jest liczbą odpowiadającą liczbie bakterii u danego pacjenta. Przygotowane płytki agarowe mogą być przechowywane w lodówce, ale powinny zostać wykorzystane w ciągu jednego tygodnia (ze względu na niestabilność bacytracyny) co jest słabą stroną tej metody badania.
Inna praktyczna metoda określana mianem "Loop method” została opisana przez Beightona (24). Polega ona na inkubacji na płytkach z agarem MSB rozcieńczonego roztworu izotonicznego buforu fosforanowego, z dodatkiem próbki pobranej z powierzchni języka. Inkubacja w środowisku 10% CO2 odbywa się przez 3-4 dni w temp. 37°C.
Wśród stosowanych do oceny poziomu bakterii z rodzaju Streptococcus mutans testów wymienić należy również testy kolorymetryczne wg. Waltera i Shklaira (25) a także Loesche i Bhat (26). Autorzy ci stosowali podłoża zawierające wskaźnik na bazie kwasu do oceny poziomu SM w płytce lub ślinie. Zmiany koloru w podłożu mannitol – arginina były związane z poziomem bakterii z rodzaju Straptococcus mutans w płytce nazębnej (12).
Alaluusua i wsp. (20) wprowadzili do użycia test Dentocult SM, Orion Diagnostica, Finland do oceny poziomu Streptococcus mutans w ślinie. Na specjalnie przygotowane płytki pokryte agarem MSB posiewa się ślinę wcześniej stymulowaną żuciem kostki parafiny. Jednocześnie krążek z bacytracyną (5 mg) jest umieszczany na płytce z posiewem. Test jest oceniany na podstawie gęstości wzrostu kolonii Streptococcus mutans wewnątrz strefy otaczającej krążek.
Matsukubo opracował półilościową metodę oceny krytycznych poziomów bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie, opierając się na zdolności mikroorganizmów do wzrostu adhezyjnego na częściach szklanych naczyń (18). Szklane probówki zawierające selektywną pożywkę MSB są zwilżane śliną, inkubowane w warunkach tlenowych przez 24 godziny i oceniane pod kątem gęstości wzrostu adhezyjnego. Metoda ta została porównana z „spatula method” Köhler i Bratthalla (23). Potwierdzono przydatność obu testów do badań skreeningowych i do praktyki klinicznej.
Metoda „strip mutans” jest modyfikacją metody z zastosowaniem szpatułki „spatula method” i wykorzystuje zdolności bakterii z rodzaju Streptococcus mutans do wzrostu na twardych powierzchniach w pożywce selektywnej (23, 27). Znajduje obecnie bardzo szerokie zastosowanie. Pozwala na długoterminowe, w odróżnieniu od poprzedniej metody, wykorzystanie podłoża i długie przechowywanie pasków z wyhodowanymi koloniami SM.
Tabela 1. Podłoża używane do identyfikacji i oceny ilościowej bakterii z rodzaju Streptococcus mutans.
Rodzaj podłożaWłaściwości
MS-agar (Difco, Detroit, USA) (12)Identyfikacja na podstawie morfologii kolonii
MC-agar (Carlsson) (13)Agar selektywny dla Streptococcus mutans na bazie MS-agaru. Niektóre szczepy - serotyp d/g nie wskazują wzrostu
MSB (Gold, Jordan, van Houte) (14)Agar selektywny dla Streptococcus mutans na bazie MS-agaru. Streptococcus mutans - serotyp a nie wskazuje wzrostu
BCY (Ikeda i Sandham) (15)Podłoże nieselektywne - identyfikacja na podstawie morfologii kolonii
MM10-sucrose (Syed i Loesche) (16)Podłoże nieselektywne - identyfikacja na podstawie morfologii kolonii
TYCSB (Palestein Helderman, Ijsseldijk i Huis in´t Veld) (17)Identyfikacja na podstawie morfologii kolonii. Możliwe różnicowanie pomiędzy serotypami c/e/f i d/g ale nie pomiędzy b i c/f/f. Serotyp a nie wskazuje wzrostu
Podłoże selektywne wg. Matsukubo (18)Na bazie podłoża MSB. Serotyp a nie wskazuje wzrostu
Podłoże selektywne wg Kalfasa, Edwardssona i Birkheda (19)Modyfikacja MC - agaru i metody Matsukubo
Dentocult SM (Orion Diagnostica, Helsinki, Finland) (20)Metoda z zastosowaniem plastikowych nośników agaru oraz krążka z bacytracyną. Serotyp a nie wykazuje wzrostu
TSY20B (Schaeken, van der Hoeven i Franken) (21)Modyfikacja podłoża TYCSB (łatwiejsze w użyciu)
Strip mutans (Jansen i Bratthall) (5)Modyfikacja MS - agaru z wysoką koncentracją sacharozy (osobno krążek z bacytracyną)
W skład testu „strip mutans”wchodzi probówka z podłożem selektywnym (bulion z wysoką koncentracją sacharozy) i plastikowy pasek. Podłoże jest aktywowane poprzez dodanie krążka bacytracyny na 15 min. przed planowanym wykonaniem testu. Oznaczanie ilościowe bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie polega na wzroście paciorkowców w podłożu wybiórczym płynnym i na ich adherencji na pasku testowym. Wydzielanie śliny stymuluje się żuciem kostki parafiny przez ok. 1 min. Pasek testowy „strip mutans” wprowadza się do jamy ustnej badanego i obraca dziesięciokrotnie w ślinie na języku. Następnie poleca się pacjentowi lekkie zaciśnięcie warg w celu usunięcia nadmiaru śliny. Pasek umieszcza się w firmowej probówce z płynnym podłożem hodowlanym i inkubuje się materiał w temp. 37°C (310 K) przez 48 godzin. Liczbę kolonii bakterii ocenia się przez porównanie zagęszczenia jednostek tworzących kolonie z wzornikiem firmowym po uprzednim osuszeniu paska.
Poziom SM w ślinie stymulowanej wyraża się w czterostopniowej skali:
0 – nie stwierdza się kolonii o cechach morfologicznych Streptococcus mutans;
1 – liczba bakterii mniejsza niż 105/ml śliny;
2 – liczba bakterii od 105 do 106/ml śliny;
3 – liczba bakterii powyżej 106/ml śliny.
Metoda „strip mutans” jest przydatna zarówno w badaniach dotyczących pojedynczych przypadków jak i w badaniach na poziomie populacji. Może ona służyć między innymi do: identyfikacji osób z wysokim ryzykiem próchnicy, oceny czynników ryzyka próchnicy, monitorowania pacjentów poddanych programom profilaktycznym (7, 9).
Zalety tej metody to:
– łatwość wykonania – może być przeprowadzona przez osoby przyuczone, bez doświadczenia w pracy laboratoryjnej;
– trwałość – podłoże przechowywane w 4°C zachowuje przydatność do użycia przez 6 miesięcy;
– łatwość odczytu – łatwość zliczania kolonii i oceny ich morfologii;
– możliwość izolacji pojedynczych kolonii do dalszej identyfikacji;
– możliwość zachowania żywych kolonii przez ok. 12 miesięcy podczas przechowywania uzyskanego materiału w stanie zamrożenia.
Jak wynika ze spostrzeżeń Wojcieszek i wsp. (10) w przypadku braku doświadczenia w pracy wymienioną metodą, może mieć miejsce zawyżenie wartości liczbowych. W celu wykluczenia ewentualnego przyjęcia złogów barwnika za kolonie bakterii lub w przypadku jakichkolwiek wątpliwości należy posłużyć się lupą lub mikroskopem o powiększeniu 10x.
Tabela 2. Przyczyny różnic przy ocenie wyników w poziomie bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w próbkach śliny.
 Przyczyny
Różnice w metodologii - próbki śliny stałe- zmienność w składzie w podłożach wzrostowych
- przechowywanie płytek
- przechowywanie śliny przed procedurą
- zmienność w technikach rozcieńczeń
- obecność innych szczepów  bakteryjnych na podłożu selektywnym
- zmienność w ocenie płytek
Różnice w próbkach śliny - metodologia stała- zastosowanie śliny stymulowanej lub niestymulowanej
- typ stymulacji
- czas żucia dla śliny stymulowanej
- różne liczby bakterii w zależności od: diety, zabiegów higienicznych, stosowania antybiotyków, szybkości wydzielania śliny, liczby miejsc retencyjnych itp.
Mając do wyboru wiele podłoży i metod badania poziomu bakterii SM w ślinie lekarz staje przed problemem, które podłoże i jaką metodę zastosować.
Decyzja powinna zależeć przede wszystkim od celu badań. Jeśli celem naszych badań jest wykrycie pojedynczych kolonii bakterii SM w jamie ustnej, żadna ze wspomnianych powyżej metod nie jest godna polecenia. W tym przypadku należy wybrać czułą metodę np.: immunofluorescencyjną z zastosowaniem specyficznych przeciwciał. W przypadku jeśli naszym celem jest ocena poziomu Streptococcus mutans w ślinie może być zastosowana każda z powyższych metod.
Typ prowadzonych badań jest również ważnym czynnikiem wpływającym na wybór metody oceny. Do badań niewielkiej liczby przypadków, prowadzonych przez dłuższy okres, powinno się wykorzystywać podłoża z dłuższą przydatnością do użycia, które aktywowane są tuż przed zastosowaniem. W badaniach epidemiologicznych, obejmujących kilkuset pacjentów, badanych w krótkim czasie, sugeruje się stosowanie selektywnych podłoży agarowych. W niektórych przypadkach planowane są dalsze badania uzyskanych izolatorów Streptococcuc mutans (np.: biochemiczne, genetyczne). Wówczas najbardziej godne polecenia są selektywne podłoża agarowe oraz metoda „Strip mutans”.
Planując przeprowadzenie badań należy przestrzegać również jeszcze kilka zasad, które można by ująć w kilku punktach:
1. W badaniach epidemiologicznych oceniających poziom SM w populacjach, wyniki powinny być analizowane w stosunku do grup wiekowych. Ma to znaczenie w okresie przed całkowitym wyrżnięciem się zębów stałych. Wiadomo, że u bezzębnych niemowląt SM nie występuje w jamie ustnej. Dopiero wyrżnięcie pierwszego zęba stwarza warunki dla kolonizacji SM. Poziom SM w ślinie zwykle stabilizuje się ok. 10-12 roku życia. Pacjenci używający ruchomych uzupełnień powinni stanowić osobną grupę, ze względu na stwierdzony wysoki poziom SM w ślinie.
2. Porównywanie danych z różnych badań epidemiologicznych jest możliwe tylko w przypadku stosowania tej samej metodyki.
3. W badaniach epidemiologicznych występujące w badanej grupie pojedyncze przypadki np. poddane ostatnio procedurom stomatologicznym, antybiotykoterapii, itp. powinny być włączone do grupy badanej ponieważ nadal odzwierciedlają poziom SM w „normalnej” populacji.
4. W ocenie SM u pojedynczego pacjenta w zależności od leczenia próchnicy należy kontrolować, czy pacjent nie był poddawany zabiegom profilaktycznym oraz czy nie przyjmował antybiotyków w ciągu ostatniego miesiąca itp.
5. Należy wziąć pod uwagę stosowanie wzmożonych zabiegów higienicznych przed wizytą u stomatologa, co może obniżać poziom SM w ślinie. Natomiast brak należnego oczyszczenia zębów przed badaniem nie będzie w sposób znaczący wpływać na liczbę SM.
6. Zabiegi profilaktyczne takie jak: leczenie ubytków, profesjonalne oczyszczanie zębów, stosowanie preparatów fluorowych lub chlorheksydynowych są stosowane w badaniach w celu obniżenia liczby bakterii. Powinny być oceniane w krótkim czasie po ich zakończeniu (np. po jednym tygodniu). Pozwala to na ocenę efektu natychmiastowego. Następne badanie przeprowadzone po 3 do 6 miesiącach pozwala na uzyskanie informacji o ewentualnym przedłużającym się efekcie zabiegu.
7. Poleca się również by pobierane w kolejnych badaniach próbki uzyskiwano w podobnych warunkach, jak próbkę wyjściową oraz by stosowano te same procedury bakteriologiczne (6).
W ocenie wyników bakteriologicznych śliny należy uwzględnić również zmienność poziomów SM, która może wynikać z różnych przyczyn. Ważniejsze z nich wymieniono w tabeli 2 (6, 11, 28).
Togelius i wsp. (8) oceniali krótkoterminową zmienność liczby SM w próbkach śliny. Porównywano zmienność liczby bakterii o różnych porach dnia i w ciągu dwóch kolejnych dni. Różnice w uzyskanych wynikach badań wskazują, że przy ocenie SM w ślinie powinno się brać pod uwagę przedziały a nie liczbę SM. Z badań wynika także, że próbki pobrane od tego samego pacjenta w odstępach kilku dni zwiększają możliwość otrzymania pewnego wyniku (1, 6).
Zastosowanie w badaniach środków antybakteryjnych, profesjonalnego oczyszczania zębów, zmian w diecie, leczenia ubytków próchnicowych z intencją zmian mikroflory jamy ustnej powoduje spadek liczby SM (1, 4, 28). Jednakże po zaprzestaniu stosowania powyższych środków ryzyko nawrotu kolonizacji powierzchni zębów znacznie wzrasta, powodując wzrost liczby bakterii w ślinie.
W odniesieniu do diety, u osób spożywających duże ilości cukrów i ze stwierdzoną wysoką liczbą SM zaobserwowano po zastosowaniu diety niskocukrowej spadek liczby bakterii. Jakkolwiek są przypadki, w których mimo niskiego spożycia cukrów stwierdza się wysokie liczby SM. Restrykcje w spożyciu cukrów u wymienionej grupy pacjentów nie będą dawały efektu spadku liczby SM w ślinie (1).
Opisano metody oceny występowania bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie, jednakże wybór jednej z nich musi być podyktowany określonymi wskazaniami klinicznymi i epidemiologicznymi. Metodologia, wiek i reprezentatywność próby to główne punkty, które należy wziąć pod uwagę dla uzyskania wiarygodnych wyników badań.
Piśmiennictwo
1. Bratthall D., Carlsson J.: Texbook of cariology. Munksgaard, 1986. 2. Emilson C.G., Krasse B.: Support for and implications of the specific plaque hypothesis. Scand. J. Dent. Res. 1985, 93:96-99. 3. Kreulen C.M.et al.: Streptococcus mutans in children using nursing bottles. J. of Dent. for Childr. 1997, 64(2):107-111. 4. Mudorff-Screstha S.A. et al.: Cariogenic potential of foods. Caries Res., 1994, 28:106-115. 5. Bratthall D.: Demonstration of Streptococcus mutans strains in some selected areas of the world. Odontol. Revy. 1972, 23:401-405. 6. Tenovuo J.O.: Human saliva: clinical chemistry and microbiology. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1989, 2. 7. Bratthall D. et al.: Evaluation of a simplified method for site-specific determination of mutans streptococci levels. Swed. Dent. J. 1996, 20:215-220. 8. Togelius J. et al.: Streptococcus mutans in seliva, intraindividual variations and relation to the number of colonoized sites. Acta Odont. Scand. 1984, 42:157-163. 9. Wierzbicka M. i wsp.: Intensywność próchnicy a występowanie w ślinie stymulowanej bakterii z grupy streptococcus mutans u 6-letnich dzieci. Czas. Stomat., 1997, L, 1:8-11. 10. Wojcieszek D. i wsp.: Metoda oznaczeń bakterii Streptococcus mutans w ślinie z użyciem fabrycznego podłoża Dentocult SM – Strip Mutans. Czas. Stom., 1992, XLV, 9:446-449. 11. Vehkalahti M. Et al.: Evaluation of salivary tests and dental status in the prediction of caries increment in caries susceptible teenagers. Caries Res., 1996, 30:22-28. 12. Jordan H.V.: Cultural methods for the identification and quantitation of Streptococcus mutans and lactobacilli in oral samples. Oral Microbiol, Immunol. 1986, 1:23-27. 13. Carlsson J.: Presence of various types of non-haemolytic streptococci in dental plaque and in other sites of the oral cavity in man. Odontol. Revy. 1967, 18:55-58. 14. Gold O.G. et al.: A selective medium for Streptococcus mutans. Arch. Oral Biol. 1973, 17:601-605. 15. Ikeda T., Sandham H.J.: A Medium for recognition and enumeration of Streptococcus mutans. Arch. Oral Biol. 1972, 17:601-604. 16. Syed S.A., Loesche W.J.: Survival of human dental plaque flora in various transport media. Appl. Microbiol. 1972, 24:638. 17. van Palenstein Helderman W.H. et al.: A selective medium for the two major subgroups of the bacterium Streptococcus mutans isolated from human dental plaque and saliva. Arch. Oral Biol. 1983, 28:599. 18. Matsukubo T. et al.: A semi-quantitative determination of Streptococcus mutans, using its adherent ability in a selective medium. Caries Res. 1981, 15:40-45. 19. Kalfas S. Et al..: Determination of salivary Streptococcus mutans level in a stable sucrose – sulphasomidine containing broth. Caries Res. 1985, 19:320. 20. Alaluusua S. et al.: Slide scoring method for estimation of Streptococcus mutans levels in saliva. Scand. J. Dent. Res. 1984, 92:127-133. 21. Schaeken M.J.M. et al.: Comparative recovery of Streptococcus mutans of five isolation media including a new simple selective medium J. Dent. Res. 1986, 65:906. 22. Wertergren G., Krasse B.: Evaluation of a micromethod for determination of Streptococcus mutans and Lactobacillus infection. J. Cli. Microbiol. 1978, 7:82-86. 23. Köhler B., Bratthall D.: Practical method to facilitate estimation of Streptococcus mutans levels in saliva. J. Clin. Microbiol. 1979, 9:584-587. 24. Beighton D.: A simplified procedure for estimating the level of Streptococcus mutans in the mouth. Br. Dent. J. 1986, 160:329-333. 25. Walter R.G., Shklair I.L.: Streptococcus mutans in caries free and caries active naval recruits. J. Dent. Res. 1982, 61:1229-1232. 26. Loesche W.J., Bhat M.: Evaluation of diagnostic broths for Streptococcus mutans. Sp. Supp. Microbiology Abstracts 1976, 1:291-301. 27. Jensen B., Bratthall D.: A new method for estimation of mutans streptococci in human saliva. J. Dent. Res. 1989, 68 (3):468-471. 28. Netuschil L. et al.: Plaque bacteria counts and vitality during chlorhexidine meridol and listerine mouthrinses. Eur. J. Oral. Sci., 1995, 103:355-361.
Nowa Stomatologia 2/2001
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia