Czytelnia Medyczna » Nowa Stomatologia » 3/2001 » Zastosowanie metody PCR do identyfikacji paciorkowców z grupy mutans

- reklama -

Fitomed
kosmetyki ziołowe

Ski Spa - serwis narciarski Warszawa

- reklama -

Izabela Strużycka¹, Anna Skoczyńska², Katarzyna Rucińska¹

Zastosowanie metody PCR do identyfikacji paciorkowców z grupy mutans

Identification of mutans streptococci by PCR method

¹ z Zakładu Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Maria Wierzbicka
² z Centralnego Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie
Kierownik Laboratorium: prof. dr hab. med. Waleria Hryniewicz

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Stomatologia zachowawcza

Ilustrowane kompendium endodoncji

Zbiór wskaźników stomatologicznych klasyfikacji i testów

Do grupy paciorkowców próchnicotwórczych mutans należy siedem gatunków (1, 2). Sposród tych gatunków Streptococcus mutans i Streptococcus sobrinus są najczęściej izolowane z jamy ustnej u ludzi i uważane są za najważniejsze bakteryjne czynniki etiologiczne próchnicy zębów u ludzi. Wyniki badań epidemiologicznych sugerują, że obecność S. sobrinus jest w większym stopniu związana z wysoką aktywnością próchnicy niż S. mutans (3, 4). W związku z tym wydaje się, że możliwość wykrywania tych dwóch mikroorganizmów może być interesująca z punktu widzenia zapobiegania i prognozowania próchnicy.

Identyfikacja drobnoustrojów z rodzaju Streptococcus do gatunku klasycznymi metodami jest złożona i czasochłonna. Z tego powodu opracowano komercyjne zestawy do szybkiej identyfikacji tych drobnoustrojów (5, 6). Równolegle z rozwojem szybkich metod diagnostycznych, wykorzystujących fenotypowe właściwości drobnoustrojów, nastąpił dynamiczny rozwój metod biologii molekularnej i co za tym idzie próby zastosowania tych metod do identyfikacji paciorkowców próchnicotwórczych (6, 7, 8).

Celem badań było porównanie dwóch metod identyfikacji paciorkowców próchnicotwórczych: metody reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) oraz metody opartej na określaniu biochemicznych właściwości tych bakterii z zastosowaniem testów Rapid ID 32 Strep.

MATERIAŁ I METODY

Materiał do badań stanowiło 495 próbek śliny stymulowanej dzieci w wieku 12 lat, uczęszczających do różnych szkół podstawowych na terenie Polski. Do wyhodowania kolonii bakterii z grupy S. mutans wykorzystano zestaw Dentocult SM Strip mutans (Orion Diagnostica, Finlandia). Następnie, uzyskane kolonie zostały poddane identyfikacji za pomocą zestawu Rapid ID 32 Strep (bioMerieux, Francja) i metodą PCR (9).

W tym celu wyrosłe kolonie bakteryjne przesiewano z podłoża transportowo-hodowlanego Dentocult SM na podłoże Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej oraz inkubowano w atmosferze 5% CO ₂ w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Wszystkie kolonie, które na podstawie preparatu i morfologii na podłożu krwawym podejrzewano o przynależność do rodzaju Streptococcus identyfikowano za pomocą testu Rapid ID 32 Strep zgodnie z instrukcją producenta.Testy Rapid ID 32 Strep umożliwiają identyfikację paciorkowców i gatunków pokrewnych na podstawie ich cech biochemicznych, przy zastosowaniu swoistych testów enzymatycznych (ryc. 1 – str. 16). Pasek testowy Rapid ID 32 Strep składa się z 32 zagłębień zawierających suche substraty, których wyniki po 4 godzinach hodowli z zawiesiną bakterii można odczytać w automacie ATB Expression lub wizualnie.

Ryc. 1. Identyfikacja szczepów z rodzaju Streptococcus przy użyciu testu RAPID ID 32 STREPT.

Równolegle, bezpośrednio na materiale wyhodowanym przy pomocy zestawu Dentocult, przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy PCR ze starterami specyficznymi dla gatunku Streptococcus mutans i Streptococcus sobrinus. Kolonie wyhodowane na podłożu Dentocult zawieszano w sterylnej wodzie i poddawano sonikowaniu, w wyniku którego następowało otwarcie komórek bakteryjnych za pomocą ultradźwięków i uwolnienie DNA. Powstała mieszanina była podstawą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Do identyfikacji szczepów S. mutans i S. sobrinus wykorzystano startery opracowane przez Oho i wsp. (9). Po zakończeniu reakcji PCR otrzymane produkty poddawano elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie barwiono bromkiem etydyny, który łącząc się z DNA umożliwia jego obserwację w świetle ultrafioletowym (ryc. 2). W przypadku obecności w mieszaninie reakcyjnej DNA szczepów S. mutans otrzymywano na żelu produkt wielkości 517 par zasad, powstały przy zastosowaniu starterów specyficznych do genu gtf B. W obecności DNA pochodzącego od S.sobrinus powstawał produkt o wielkości 712 par zasad, komplementarny do genu gtf I.

Ryc. 2. Produkty reakcji PCR ze starterami specyficznymi dla S. mutans i S. sobrinus.

WYNIKI

Rycina 3 przedstawia wyniki identyfikacji bakterii grupy S. mutans uzyskane za pomocą metody biochemicznej Rapid ID 32 Strep i metody PCR. Zbadano łącznie 495 próbek. Za pomocą metody Rapid ID 32 Strep zidentyfikowano S. mutans i/lub S. sobrinus w 197 (39,8%) próbkach śliny. W metodzie PCR 455 (91,5%) próbek wykazywało obecność badanych gatunków. Jak wynika z tabeli 1 Streptococcus mutans zidentyfikowano w 124, natomiast Streptococcus sobrinus w 71 próbkach za pomocą testów biochemicznych. Test PCR pozwolił na stwierdzenie obecności tych bakterii odpowiednio, w 320 i 12 badanych próbkach. Oba gatunki razem wykryto w 123 próbkach metodą reakcji łańcuchowej polimerazy i w 2 próbkach po zastosowaniu komercyjnego testu Rapid ID 32 Strep.

Ryc. 3. Odsetki zidentyfikowanych szczepów paciorkowców próchnicotwórczych.

Tabela 1. Identyfikacja bakterii z grupy S. mutans.

Metoda	S. m.	S. m/S. sob.	S. sob.	Brak
Rapid ID 32 Strep	124	2	71	298
PCR	320	123	12	40

DYSKUSJA

Do różnicowania i identyfikacji bakterii z gatunku S. mutans i S. sobrinus stosuje się wiele metod, włączając analizę morfologii kolonii na podłożu mitis – salivarius agar, testy biochemiczne, metody immunologiczne czy metody genetyczne z sondą DNA (5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15). Metody te są często drogie, nadto skomplikowane lub zbyt czasochłonne do zastosowania ich w warunkach badań epidemiologicznych.

W ostatnich latach zainteresowania wielu autorów skierowały się w stronę metod wykorzystujących reakcję łańcuchową polimerazy w wykrywaniu gatunku S. mutans (8, 9, 16). W większości badań materiał poddany dalszej analizie stanowiły próbki płytki bakteryjnej. Oho i wsp. po raz pierwszy zastosowali w swoich badaniach próbki śliny, jako materiał łatwiejszy do pobrania i bardziej odpowiedni do badań epidemiologicznych (9).

W niniejszym badaniu źródłem bakterii próchnicotwórczych były próbki śliny stymulowanej, które zostały poddane dalszym procedurom laboratoryjnym. Porównano dwie metody identyfikacji S. mutans i S. sobrinus: metodę biochemiczną z zastosowaniem hodowli i testów Rapid ID 32 Strep oraz metodę biologii molekularnej tzw. reakcję polimerazy łańcuchowej, PCR.

Za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej, spośród 495 badanych próbek, w 91,5% przypadków stwierdzono obecność S. mutans i/lub S. sobrinus. Metoda biochemiczna z zastosowaniem testów Rapid ID 32 pozwoliła na identyfikację drobnoustrojów w 39,8% przypadków. Różnice w uzyskanych wynikach mogły wypływać z faktu, że metoda biochemiczna jest metodą bardziej skomplikowaną i czasochłonną. Wymaga ona przesiewania uzyskanych kolonii z podłoża transportowo-hodowlanego Dentocult na podłoże Columbia agar, oraz dodatkowego okresu inkubacji. Ponadto trudność hodowli i niespecyficzność w stosunku do Streptococcus mutans testu Dentocult utrudnia izolację szczepów przeznaczonych do dalszych badań. Także, aby można było zidentyfikować oba gatunki drobnoustrojów, należało przeprowadzić reakcję za pomocą testów Rapid ID 32 dwukrotnie. Wydłuża to czas, a więc koszty tej metody.

Czas przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy wynosi około 4 godzin. Podczas jednego badania uzyskujemy informację dotyczącą obecności obu drobnoustrojów w badanej próbce. Ponadto identyfikację obu drobnoustrojów metodą PCR można również przeprowadzić bezpośrednio w pobranej próbce śliny, bez konieczności hodowli kolonii na podłożu Dentocult, tak jak to miało miejsce w powyższych badaniach. Przewaga testu PCR nad metodami hodowlano-biochemicznymi polega również na jego wysokiej czułości. Można bowiem za jego pomocą, wykrywać obecność nawet niewielkiej liczby bakterii, gdyż do przeprowadzenia reakcji polimerazy łańcuchowej wymagana jest niewielka ilość DNA.

W powyższych badaniach, metodą PCR, zidentyfikowano drobnoustroje próchnicotwórcze w ponad dwa razy większej liczbie próbek, niż przy zastosowaniu testu Rapid ID 32 Strep.

Wyniki przeprowadzonego badania pozwalają stwierdzić, że metoda PCR jest bardziej czuła niż metoda biochemiczna Rapid ID 32 i może być przydatna w identyfikacji paciorkowców próchnicotwórczych. Jest to prosta i szybka metoda, która może być z powodzeniem zastosowana również w badaniach epidemiologicznych. (KBN Grant 4P05E07515).

Polecane książki z księgarni medycznej BORGIS:

Protetyka stomatologiczna

Protetyka stomatologiczna podręcznik dla studentów

Chirurgia stomatologiczna i szczękowo-twarzowa

Piśmiennictwo

1. Loesche W.J.: Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Revy, 1986, 50, 353-380. 2. Bratthall D., Köhler B.: Streptococcus mutans serotypes: some aspects of their identification, distribution antigenic shifts, and relation to caries. J. Dent. Res., 1976, 55, 15-21. 3. Fujiwara T. et al.: Caries prevalence and salivary mutans streptococci in 0-2 year children in Japan. Community Dent. Oral Epidemiol. 1991, 19, 151-154. 4. Hirose H. et all: Close association between Streptococcus sobrinus in saliva of young children and smooth surface caries increment. Caries Res., 1993, 27, 292-297. 5. Humble M.W. et al.: Api ZYM: a simple rapid system for the detection of bacterial enzymes. J. Clin. Path., 1977, 30, 275. 6. Fordymacki P. i wsp.: Ocena przydatności wybranych systemów komercyjnych do identyfikowania ziarenkowców z rodzaju Streptococcus. Med. Dośw. Mikrobiol., 1988, 50, 171-177. 7. Russel RR.: The application of molecular genetics to the microbiology of dental caries. Caries Res., 1994, 28, 269-282. 8. Igrashi T. et al.: Direct detection of S. m. in human dental plaque by polymerase chain reaction. Oral. Microbiol. Immunol., 1996, 11, 5, 294. 9. Oho T. et all.: Simple and rapid detection of S. m. and S. sobr. in human saliva by PCR. Oral Microbiol. Immunol., 2000, 15, 258-262. 10. Gold O.G. et al.: A selective medium for Streptococcus mutans. Arch.Oral Biol., 1973,18, 1357-1364. 11. Beighton D. at al: A simple biochemical scheme for the differentiation of S. m. and S. sobrinus. Caries Res., 1991,25, 174-178. 12. de Soet J.J.P. et al.: Enumeration of mutans streptococci in clinical samples by using monoclonal antibodies. J. Clin. Microbiol., 1990, 28, 2467-2472. 13. Hamada S., Slade HD.: Biology immunology and cariogenicity of Streptococcus mutans. Microbiol. Rev., 1980, 44, 331-384. 14. Smorawińska M., Kuramitsu HK.: DNA probes for detection of cariogenic Streptococcus mutans. Oral Microbiol. Immunol., 1992, 7, 177-181. 15. Cangelosi GA. et all.: Oligonucleotide probes for mutans streptococci. Mol. Cell Probes, 1994, 8, 73-80. 16. Igrashi T. et al.: Rapid identyfication of mutans streptococcal species. Microbiol. Immunol., 1996, 40,11, 867.

Nowa Stomatologia 3/2001
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia

Powrót na górę strony

Pozostałe artykuły z numeru 3/2001:

- reklama -

Strona główna | Reklama | Kontakt