Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Stomatologia 1/2008, s. 7-11
*Agnieszka Mielczarek1, Mirosław Kwaśny2, Sylwia Burdyńska2
Zmiany erozyjne szkliwa – ocena nanowłasności1)
Dental enamel erosion – assessment of nanoproperties
1Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Elżbieta Jodkowska
2Instytut Optoelektroniki Wojskowej Akademii Technicznej w Warszawie
Kierownik Instytutu: dr n. tech. Marek Zygmunt
W ostatnich latach szeroko dyskutowany jest w literaturze problem występowania ubytków erozyjnych twardych tkanek zęba. Ubytki te powstają w wyniku chemicznego rozpuszczenia pryzmatów szkliwa bez udziału bakterii. Erozje występują zwykle na powierzchniach nie predysponowanych do występowania płytki nazębnej, której obecność niezbędna jest dla zainicjowania procesu próchnicowego. Koncentracja kwasów organicznych produkowanych przez bakterie próchnicotwórcze jest znacznie niższa w porównaniu z kwasami odpowiedzialnymi za powstawanie zmian erozyjnych. Źródło kwasów inicjujących erozje ma pochodzenie endogenne lub egzogenne (1). Jako najważniejszy czynnik egzogenny uznaje się kwaśne pokarmy i napoje, których spożycie znacznie wzrosło w ostatnich latach zwłaszcza w młodej populacji. Cechą niedojrzałego szkliwa jest znaczna porowatość i mniejsza kwasoodporność – tym samym większa podatność na demineralizację. Obecność śliny w środowisku jamy ustnej w istotny sposób modyfikuje proces erozyjny (2). Opłukuje ona powierzchnie zębów, skracając czas ekspozycji na kwasy. Jednocześnie jest rezerwuarem systemów buforujących i jonów mineralnych niezbędnych w inicjowaniu remineralizacji. W dostępnych publikacjach dyskutuje się zdolność do pełnej odbudowy szkliwa uszkodzonego we wstępnej fazie procesu erozyjnego (3,4). Autorzy biorą pod uwagę możliwość sterowania czynnikami środowiska jamy ustnej przez zmianę składu biofilmu czy śliny w celu zintensyfikowania procesów naprawczych. Powyższa dyskusja skłoniła autorów do podjęcia wstępnych badań dotyczących oceny nanowłasności szkliwa poddanego procesom erozji.
Materiał i metodyka
Jako materiał do badań in vitro wykorzystano ludzkie zęby usunięte z różnych wskazań stomatologicznych. Zęby po ekstrakcji płukano pod bieżącą wodą, oczyszczano mechanicznie i przechowywano w roztworze wody destylowanej z dodatkiem kryształków tymolu. Oczyszczone i utrwalone zęby wykorzystywano do dalszych badań w postaci próbek szkliwa.
Przygotowano 20 próbek szkliwa (3 mm x 4 mm) zatopionych w sześciennych bloczkach akrylowych (Durabase), które następnie płukano w myjce ultradźwiękowej i szlifowano oraz polerowano ostatecznie pastą polerską z nasypem ziarna 0,3 ?m. Próbki oceniono wstępnie w mikroskopie sił atomowych. Do oceny nanostruktury i nanotwardości (NH) szkliwa użyto Mikroskopu Sił Atomowych AFM Digital Instruments (USA) NanoScope IV, pracując w trybie Taping mode. Schemat budowy igły przedstawiono na rycinie 1. Zmiany erozyjne wywoływano aplikując na powierzchnie próbek 100 ml odgazowanego napoju Coca-Cola (Coca-Cola HBC, Polska) o pH 2,69. Płyn pozostawiono na powierzchni próbek przez 5 minut, po czym płukano solą fizjologiczną i osuszano miękkimi, bezpyłowymi bibułami absorpcyjnymi. Następnie dokonano ponownej oceny profilu powierzchni i nanotwardości. W kolejnym etapie eksperymentu powierzchnie szkliwa płukano roztworem nasyconego hydroksyapatytu (HA)- (Chema Rzeszów, Polska) w ilości 400 ?l, osuszano i umieszczano w cieplarce w mieszaninie ludzkiej śliny. Inkubację prowadzono, w temperaturze 37°C przez okres 24 godzin. Zbiórka śliny pochodzącej od 8 wolontariuszy prowadzona była wśród pracowników Zakładu Stomatologii Zachowawczej ISAM w Warszawie. Powierzchnie szkliwa poddano ponownemu badaniu w AFM. Procedura pomiaru polegała na wciskaniu w badaną powierzchnię ostrza igły-wgłębnika w postaci diamentowego ostrosłupa o podstawie kwadratu i kącie wierzchołkowym 60°. Wgłębnik umieszczony był na końcu dźwigni o stałej sprężystości 195 N/m. Analizowano odciski powstałe na powierzchni szkliwa po wgnieceniu igły z siłą – 16x10-6 N, przez 1-2 sekundy. Uzyskiwane odciski posiadały zwykle regularne zarysy, a ich geometria pozwalała wyznaczyć wielkość NH szkliwa. Nanotwardość wyznaczano ze stosunku siły obciążającej wgłębnik do powierzchni odcisku, obliczonej ze średniej arytmetycznej długości przekątnych.
Ryc. 1. Schemat budowy igły skanującej w mikroskopie AFM.
Wyniki
Wybrane obrazy powierzchni szkliwa prawidłowego uzyskane techniką AFM ukazuje rycina 2. Zarejestrowany profil powierzchni próbek charakteryzuje się uporządkowaną strukturą krystaliczną, złożoną ze ściśle upakowanych kryształów, otoczonych przestrzeniami między-pryzmatycznymi o niewielkim świetle. Niewielkie zagłębienia obserwowane w strukturze szkliwa są powierzchowne i mają regularny, ukierunkowany charakter. Dodatkowo, uwidaczniają się wyraźne, różnokierunkowe linie powstałe w procesie polerowania próbek.
Ryc. 2. Obrazy szkliwa prawidłowego uzyskane techniką AFM.
Fotogramy szkliwa poddanego działaniu kwasu, zaprezentowane na rycinie 3, ukazują istotne zmiany w strukturze powierzchni szkliwa. Obserwujemy całkowite zatarcie uporządkowanej struktury krystalicznej szkliwa. Już po 5-minutowej aplikacji kwasu dochodzi do znacznego rozwinięcia powierzchni. Pojawiają się na niej liczne zagłębienia o zróżnicowanej głębokości, sięgającej od 20 do 40 nm. Zmiany te mają charakter kraterowatych i nieregularnych uszkodzeń.
Ryc. 3. Obrazy szkliwa poddanego działaniu coca-coli (5 min.) uzyskane techniką AFM.
Rycina 4 obrazuje próbki szkliwa, które po działaniu coca-coli traktowano roztworem HA i inkubowano w ludzkiej ślinie. Fotogramy sugerują wygładzenie powierzchni szkliwa i spłycenie kraterów erozyjnych. Równocześnie na powierzchni szkliwa widoczne są ziarniste, nieregularnie rozmieszczone, pojedyncze złogi, które cechuje budowa wielkocząsteczkowa. Obserwowane struktury są charakterystycznymi makroglobulinami ślinowymi zaadsorbowanymi na powierzchni szkliwa we wstępnym procesie tworzenia biofilmu bakteryjnego.
Ryc. 4. Obrazy szkliwa poddanego działaniu coca-coli (5 min.), po płukaniu roztworem HA i 24-godzinnej inkubacji w ślinie, uzyskane techniką AFM.
Przykładowe odciski uzyskane w próbkach szkliwa pozwalające oszacować poziom NH przedstawia rycina 5.
Ryc. 5. Obrazy odcisków szkliwa uzyskane w badaniu nanoindentacji metodą AFM.
Wyniki pomiarów nanotwardości próbek szkliwa, uzyskane w trzech kolejnych fazach eksperymentu zestawiono w tabeli 1. W badaniu wstępnym średnia wartość NH szkliwa prawidłowego wynosiła 3,78 (±0,27) GPa. Po działaniu Coca-coli na powierzchnie szkliwa odnotowano istotny spadek średniej wartości NH do 2,58 (±0,30) GPa. Następnie zaobserwowano tendencje wzrostu średniej wartości NH do 3,02 (±0,24) GPa po działaniu HA i inkubacji w ślinie.
Tabela 1. Zmiany poziomu średniej wartości NH w poszczególnych fazach badania.
FAZY EKSPERYMENTUNANOTWARDOŚĆ (GPa)
szkliwo prawidłowe3,78 (?0,27)
szkliwo + Coca-Cola2,58 (?0,30)
szkliwo+ Coca-Cola + HA + ślina3,02 (?0,24)
Dyskusja
Przydatność techniki AFM do oceny nanowłasności twardych tkanek zęba opisywana była we wcześniejszych publikacjach. Badania te dotyczyły zarówno monitorowania procesu próchnicowego jak i zmian erozyjnych (5, 6). Prezentowane wyniki badań wstępnych potwierdzają możliwość wykorzystania techniki AFM do oceny wczesnych zmian powstałych w szkliwie po krótkotrwałej aplikacji napoju typu soft-drink. W warunkach in vivo, bezpośredni czas działania coca-coli na szkliwo jest stosunkowo krótki. Przed połknięciem porcji napoju, roztwór rozcieńczony jest śliną i wzbogacony o minerały i systemy buforowe w niej zawarte. W prezentowanych badaniach in vitro stosowano roztwór HA i mieszaninę ludzkiej śliny aby zbliżyć warunki eksperymentu do panujących w jamie ustnej. Pięciominutowy czas aplikacji kwasu został również dostosowany do warunków fizjologicznych i odpowiada analogicznej wartości klirensu kwasu cytrynowego w jamie ustnej (7). Wielu autorów sugeruje, że istotne zmiany w strukturze szkliwa zachodzą bezpośrednio po aplikacji kwaśnych napojów na powierzchnię szkliwa (8). W opisywanych badaniach zarejestrowane obrazy AFM ukazują istotne zmiany szkliwa już po 5 minutach działania coca-coli. Zmiany te mają postać różnokształtnych zagłębień i kraterów o nieregularnych brzegach oraz zróżnicowanej głębokości. Badania wstępnych faz procesu erozji prowadzone przez Finke wsp. z wykorzystaniem techniki AFM wykazały maksymalne uszkodzenie struktury szkliwa w strefie międzypryzmatycznej, w rejonie perykimatów (9).
Godnym omówienia jest fakt, iż w prezentowanych badaniach, w procesie polerowania próbek usunięta została zewnętrzna warstwa szkliwa. Tym samym utracono powierzchowną powłokę, która uznawana jest za lepiej zmineralizowaną i bardziej odporną na działanie czynników uszkadzających (10). Stąd, na fotogramach widoczne są ewidentne uszkodzenia powierzchni próbek. Naturalne, niepolerowane szkliwo, poddawane działaniu kwasów, wykazuje zwykle niższy poziom demineralizacji w porównaniu ze szkliwem polerowanym (10). Analizując więc tempo i obraz procesów erozji uzyskanych w poszczególnych badaniach należy uwzględnić jakość ocenianej powierzchni.
Kolejnym godnym omówienia zagadnieniem jest możliwość zwiększenia odporności szkliwa na czynniki uszkadzające oraz naprawy wczesnych uszkodzeń erozyjnych poprzez sterowanie czynnikami środowiska jamy ustnej. Niektórzy autorzy wykazali brak możliwości remineralizacji i uzyskania wzrostu parametru twardości szkliwa w badaniach in vitro (11). Większość doniesień opisuje jednak tendencje do remineralizacji zmian erozyjnych w warunkach doświadczalnych, choć bez uzyskania pełnej odbudowy struktury szkliwa (12). W piśmiennictwie szeroko dyskutowana jest rola pellikuli i biofilmu jako struktury biorącej udział w regulacji tempa procesów zachodzących na granicy szkliwa i jamy ustnej. Struktura ta laminuje warstwę zewnętrzną szkliwa chroniąc ją przed działaniem czynników uszkadzających. Jednocześnie uznawana jest jako czynnik hamujący wymianę jonów w procesie remineralizacji (13, 14).
Zakres poziomu nanotwardości próbek szkliwa prawidłowego, uzyskany w omawianych badaniach porównywalny jest z wynikami prezentowanymi przez innych autorów (15). Zaobserwowano wzrost nanotwardości odwapnionego szkliwa po aplikacji HA i mieszaniny ludzkiej śliny. Wdrożenie procedur naprawczych nie pozwoliło jednak osiągnąć wyjściowego poziomu wartości NH. Wyniki badań nad erozjami wywoływanymi w warunkach eksperymentalnych, prowadzone przez Dewlina i wsp. również potwierdziły możliwość tylko częściowego odtworzenia struktury i twardości szkliwa po zastosowaniu sztucznej śliny (16).
Kinetykę procesów de- i remineralizacji wczesnych stadiów rozwoju erozji szkliwa, własności nano-mechaniczne i tempo odkładania się minerałów na odwapnionej powierzchni badali również oraz Charig i wsp.(17). Autorzy dzięki technice AFM ocenili tempo procesów naprawy nano-uszkodzeń powierzchni szkliwa w postaci mikropęknięć, zmian erozyjnych czy naturalnych nierówności, po aplikacji różnych formuł past do zębów z zawartością dwuwęglanu wapnia.
Podsumowując, zastosowanie wysoce czułej techniki AFM umożliwia obserwację powierzchni szkliwa we wstępnej fazie procesu erozyjnego. Zarejestrowane fotogramy ukazują ewidentne uszkodzenia powierzchni szkliwa i spadek poziomu nanotwardości. Zmiany te wykazują jednak tendencje naprawcze po zastosowaniu wybranych czynników prewencyjnych – śliny i jonów mineralnych. Wstępne wyniki prezentowanych badań sugerują więc możliwość kontroli potencjału erozyjnego szkliwa i motywują do pełnego poznania czynników sterujących procesami de- i remineralizacji. Kontynuacja prowadzonych badań umożliwi bardziej szczegółowe poznanie przemian strukturalnych zachodzących w twardych tkankach zęba w przebiegu procesu erozyjnego.

1)Badania wykonano w ramach Grantu 2PO5B 067 29.
Piśmiennictwo
1. Lussi A., et al.: The influence of different Factors on in vitro enamel erosion. Caries Res., 1993; 27: 387-393. 2. Nekrashevych Y., Stösser L.: Protective influence of experimentally formed salivary pellicle on enamel erosion an in vitro study. Caries Res., 2003; 37: 225-231. 3. Attin T., et al.: Effect of mineral supplements to citric acid on enamel erosion. Arch. Oral. Biol., 2003; 48: 753-759. 4. Barbour M.E., et al.: Enamel dissolution in citric acid as a function of calcium and phosphate concentration and degree of saturation with respect to hydroxyapatite. Eur. J. Ora. Sci., 2003; 111: 428-433. 5. Mielczarek A., et al.: Wybrane przykłady wykorzystania mikroskopii sił atomowych w badaniach nanostruktury szkliwa. Nowa Stom., 2007; 2-3: 67-69. 6. Ge J., et al.: Property variations in the prism and the organic sheath within enamel by nanoindentation. Biomaterials 2005; 26, 16: 3333-3339. 7. Bashir E., et al.: Salivary clearance of citric acid after an oral rince. J. Dent., 1995; 23: 209-212. 8. Barbour M., et al.: A nanoindentation study of enamel dissolution as a function of solution degree of saturation with respect to hydrixyapatite. J. Colloid Interface Sci., 2003; 265: 9-14. 9. Finke M., et al.: The Early Stages of Native Enamel Dissolution Studied with Atomic Force Microscopy. Colloid Interface Sci., 2000; 232, 1: 156-164. 10. Ganss C., et al.: A comparative profilometric in vitro study of the susceptibility of polished and natura human enamel and dentine surfaces to erosie demineralization. Arch. Oral. Biol., 2000; 45: 897-902. 11. Lippert F., et al.: In situ remineralization of surface softened human enamel studied with AFM nanoindentation. Surf Science 2004; 553, 1-3: 105-114. 12. Collys K., et al.: Rehardening of surface softened and surface etched enamel in vitro and by intraoral exposure. Caries Res., 1993; 27, 1: 15-20. 13. Amaechi B.T., Higham S.M.: Eroded enamel lesion remineralization by saliva as a possible factor in the site-specificity of human dental erosion. Arch. Oral. Biol., 2001; 48, 8: 697-703. 14. Hannig M., et al.: Initial salivary pellicle formation on solid substrates studied by AFM. J Nanosci Nanotechnol 2004; 4, 5: 532-8. 15. Habelitz S., et al.: Mechanical properties of human dental enamel on the nanometer scale. Arch. Oral. Biol., 2001; 46: 173-183. 16. Devlin H., et al.: Hardness of enamel exposed to Coca-Cola and artificial saliva. J. Oral. Rehabil., 2006; 33, 1: 26-30. 17. Charig A., et al.: Enamel mineralization by calcium-containing-bicarbonate toothpastes: assessment by various techniques. Compend Contin Educ Dent. 2004; 25, 9 Suppl. 1: 14-24.
otrzymano: 2008-01-10
zaakceptowano do druku: 2008-02-12

Adres do korespondencji:
*Agnieszka Mielczarek
Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii WUM
ul. Miodowa 18, 00-246 Warszawa
tel.: (0-22) 502-20-32
e-mail: agam@amwaw.edu.pl

Nowa Stomatologia 1/2008
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia