Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Nowa Pediatria 5/1999
Urszula Jędrasiak, Izabella Radomska, Małgorzata Kępińska
Parametry białokrwinkowe we krwi pępowinowej donoszonych noworodków – na podstawie badań własnych
Leukocytic parameters in the umbilical blood of full-term neonates – on the basis of authors experience
z Kliniki Neonatologii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie
Kierownik Kliniki: dr med. Izabella Radomska
Ochrona organizmu przed różnymi czynnikami patogenetycznymi to podstawowa funkcja układu immunologicznego. Podobnie jak inne układy, jest on u noworodka zarówno morfologicznie jak i czynnościowo niedojrzały. Używa się nawet określenia „fizjologiczne, wrodzone niedobory odporności”. Mimo, że większość komponentów układu jest obecna po urodzeniu, dokładniejsze badania wykazują nieprawidłowości pra wie każdej jego składowej. Układ odpornościowy kształtuje się od wczesnych tygodni życia płodowego (ok. 6 hbd), jednak intensywny jego rozwój ma miejsce dopiero po urodzeniu. Sterylność środowiska wewnątrzmacicznego, napływ matczynych immunoglobulin, wyższa aktywność komórek T supresorowych wygaszają zjawiska obrony immunologicznej.
Obrona immunologiczna składa się z dwóch podstawowych mechanizmów: nieswoistych, do których należy układ fagocytozy i układ dopełniacza oraz swoistych, które współtworzą limfocyty T i B. Mechanizmy nieswoiste stanowią pierwszą linię obrony gospodarza. Komórki fagocytujące szybko odpowiadają na zakażenie. Migrują bezpośrednio do źródła zakażenia, pochłaniają i niszczą obce organizmy, uwalniają substancje bakteriobójcze. W następstwie pochłonięcia dochodzi do uwolnienia wewnątrzkomórkowych produktów, w tym toksycznych metabolitów tlenowych, proteaz, fosfolipaz, defensyn, które zabijają zarówno organizmy Gram (+) jak i Gram (-) oraz wiele gatunków grzybów. Funkcja granulocytów, sam proces fagocytozy jak i wspomagające ją czynniki humoralne: swoiste przeciwciała oraz układ dopełniacza są nawet u dojrzałego noworodka niedostatecznie wykształcone. Defekty zarówno ilościowe jak i jakościowe procesu fagocytozy, przyczyniają się znacznie do stanu względnego niedoboru odporności noworodka i powodują, że pierwsza linia obrony może zawieść. Noworodek rodzi się z dużą liczbą fagocytów: granulocytów obojętnochłonnych, monocytów oraz komórek NK. Liczba limfocytów, komórek T-supresorowych i pomocniczych jest prawidłowa. Ta selektywna leukocytoza jest wynikiem wzrostu we krwi poziomu katecholamin i kortyzonu w odpowiedzi na stres porodowy. Znany jest fakt niższych wartości leukocytozy we krwi pępowinowej noworodków urodzonych w czasie planowanego cięcia cesarskiego. Poród siłami natury wydaje się być zjawiskiem immunologicznie dobroczynnym (3, 20).
Do 14 hbd granulocyty nie są wytwarzane przez płód (1, 4). Ich liczba rośnie w II trymestrze osiągając wartość średnią 2,5 tys/mm3 w 22 hbd. W miarę rozwoju płodu czynność leukopoetyczną przejmuje szpik kostny. Wcześniej proces hematopoezy ma miejsce w woreczku żółciowym. Według ostatnich badań wykorzystujących płody poronione w II trymestrze wątroba i śledziona nie są miejscami produkcji i magazynowania neutrofili (1). Głównym narządem leukopoezy jest szpik kostny. Cykl żółciowy neutrofila obejmuje trzy fazy: szpik-krew-tkanki. Proces leukopoezy zachodzący w szpiku jest regulowany przez szereg reakcji między komórkami krwiotwórczymi a komórkami zrębowymi (12). Te ostatnie poprzez substancje pozakomórkowe regulują kontakty między komórkami mikrośrodowiska szpiku. Komórki progenitorowe, tak zwane komórki pnia, mają zdolność samoodnowy i różnicowania, dając początek wielu klonom komórek. Relatywnie mała ilość pluripotentnych komórek pnia daje początek dużej liczbie funkcjonalnie różnych, dojrzałych komórek efektorowych (8, 12). Zmienność jest charakterystyczną cechą komórek progenitorowych. Niektóre komórki pnia dają początek pojedynczym koloniom neutrofilów, niektóre koloniom mieszanym, złożonym z wielu typów komórek. I tak CFU-GEMM (Colony Forming Unit – Granulocytes, Erythrocytes, Megakariocytes, Macrophages) może różnicować się w kierunku zarówno granulocytów jak i erytrocytów i megakariocytów. CFU-GM (granulocyte-macrophage progenitor) pod wpływem GM-CS (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) wytwarza skupiska neutrofili i monocytów a także czasem eozynofile i komórki tuczne. CFU-G (granulocyte progenitor) różnicuje się tylko w kierunku neutrofili pod wpływem czynnika G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) oraz niektórych interleukin. M-CSF (macrophage colony stimulating factor) stymuluje tylko kolonie monocytów czyli makrofagów. Komórki fagocytujące pochodzą więc z tej samej wspólnej komórki macierzystej szpiku, która różnicuje się w określone linie. Chociaż CFU-GM, CFU-G, CFU-M są względnie nieaktywne u osobników dorosłych, u noworodków wykazują wysoki podstawowy rytm namnażania, co może ograniczyć możliwość przyspieszenia produkcji fagocytów nie tylko w czasie infekcji (1, 4, 5).
Na rycinie 1 przedstawiono schematyczne powstawanie komórek fagocytujących krwi.
Ryc. 1. Wskaźniki neutrofilowe krwi pępowinowej w badanej grupie noworodków.
Krew pępowinowa, podobnie jak krew płodu zawiera 10-50 razy większe stężenie CFU-GM i CFU-MIX (Colony Forming Unit mający zdolność różnicowania się w kierunku wielu różnych linii komórkowych, często utożsamianych z GEMM) niż krew dorosłych (1). Dojrzewanie macierzystych komórek krwiotwórczych w kierunku neutrofili podlega regulacji przez glikoproteinę G-CSF oraz niektóre interleukiny np. IL-3, IL-6, IL-11 (3, 7, 11). Proces rozwoju od komórki macierzystej do dojrzałego granulocyta wynosi średnio 10 dni (4-14). G-CSF wzmaga dojrzewanie progenitorów neutrofili, przyspiesza uwalnianie neutrofili ze szpiku do krwi a także wzmaga funkcję makrofagów (chemotaksję, fagocytozę). W szpiku możemy wyróżnić dwa przedziały neutrofili: przedział komórek dzielących się (mieloblasty, promielocyty, mielocyty) oraz pulę komórek, które utraciły zdolność dzielenia się (metamielocyty, granulocyty o jądrze pałeczkowatym, granulocyty o jądrze wielopłatowym). Jest to pula zmagazynowanych neutrofili stanowiących tzw. rezerwę szpikową, w miarę potrzeby uwalnianą do krwi. Stosunek liczby granulocytów pałeczkowatych do całkowitej liczby neutrofili jest wyższy w szpiku niż we krwi, co świadczy o tym, że do krwi uwalniają się głównie dojrzałe granulocyty. Rezerwa szpikowa noworodka jest 7 razy mniejsza w przeliczeniu na kg masy ciała niż u osoby dorosłej. Jest to istotny niedobór w przypadku infekcji (2, 3, 5).
Neutrofile przechodzące do krwi dzielą się na dwie pule: krążącą i marginalną. Obie pule komórek są w równowadze. Zawierają mniej więcej taką samą liczbę komórek na kg masy ciała i takie same ich proporcje. Pula marginalna czyli rezerwa dyspozycyjna to granulocyty obojętnochłonne przylegające do postkapilarnych naczyń żylnych, przygotowane do diapedezy, zatrzymane w zatokach naczyniowych i rozgałęzieniach naczyń włosowatych w śledzionie, wątrobie i szpiku. To właśnie ta pula uruchamiana jest jako pierwsza w przypadku infekcji. Ruch granulocytów na drodze szpik – krew – tkanki jest zawsze jednokierunkowy. Nie ma powrotu granulocytów z puli tkankowej do puli krążącej.
Adrenalina, związany z jej wyrzutem do krwi stres, wysiłek fizyczny, powodują wzmożone przechodzenie neutrofili z puli marginalnej do krążącej, powodując przejściową neutrofilię. Długi, np. 3-minutowy głośny płacz noworodka może podwoić liczbę granulocytów we krwi (1). Odwrotny ruch neutrofili z puli krążącej do marginalnej występuje 1-2 godz. po eksperymentalnym podaniu endotoksyny bakteryjnej do krwiobiegu. Stres okołoporodowy, wyrzut do krwi amin katecholowych i sterydów są odpowiedzialne za neutrofilię występującą w pierwszych dobach życia. O ile katecholaminy mają wpływ na pulę marginalną to hydrokortyzon indukuje uwalnianie rezerwy szpikowej i zmniejsza migrację granulocytów do tkanek. Okres życia granulocytów we krwi jest krótki. T1/2 wynosi 6-8 godz. Krwinki opuszczają krwiobieg raczej przypadkowo niż według ich wieku, jak ma to miejsce w przypadku erytrocytów i płytek krwi (1, 6). W ciągu kilku minut po rozwoju lokalnej infekcji neutrofile gromadzą się przy nabłonku naczyń i dzięki zdolności do odkształcania się poprzez wsuwanie pseudopodiów przechodzą między komórkami śródbłonka do tkanki. Czas życia neutrofila w tkankach jest krótki. Trwa 1-2 dni. Neutrofile nie zaangażowane w procesy zapalne usuwane są poprzez układ moczowy, oddechowy, pokarmowy a także przez wątrobę i śledzionę. Istnieją pewne różnice w rozmieszczeniu neutrofili w krążeniu tętniczym i żylnym (1). Próbka krwi tętniczej może zawierać nawet o 1/3 mniej granulocytów niż próbka krwi żylnej, pobranej jednocześnie. Nie obserwuje się różnic w proporcji komórek. Stosunek I/T (immature-to-total ratio) jest identyczny. Szybki, pulsacyjny przepływ krwi tętniczej spycha relatywnie większe komórki krwi na obrzeża naczyń, podczas gdy do próbki krwi kierowany jest centralny strumień zawierający mniejsze komórki. Średnica dojrzałego granulocyta wynosi 12-15 µm a średnica erytrocyta 7,5 µm.
Prawidłowa liczba neutrofili zależy od wieku i rasy. Wartości te wahają się od 1,8 do 7,0 x 109 G/l, średnio 4,0 x 109 G/l (9). Wydaje się, że wartości między 2 tygodniem a pierwszym rokiem życia mogą być nieznacznie niższe. Zakażone noworodki mogą szybko rozwinąć neutropenię. Jest to spowodowane zmniejszoną rezerwą szpikową oraz dużym zużyciem krwinek w puli krążącej. Zdolność szpiku do odpowiedzi na stres jest zmniejszona, wtórnie do niewystarczającego wytwarzania CSF (colony stimulating factor).
Istnieją stany chorobowe okresu perinatalnego dotyczące zarówno matki jak i płodu, mogące wpływać na liczbę granulocytów we krwi płodu i noworodka. Należy do nich nadciśnienie indukowane ciążą. Noworodki urodzone z ciąż powikłanych nadciśnieniem, szczególnie te ze znacznym wewnątrzmacicznym zahamowaniem rozwoju, mają niskie wartości granulocytów we krwi pępowinowej (1, 3). Nie stwierdza się u tych dzieci nieprawidłowości w obrębie puli marginalnej czy rezerwy szpikowej. Prawidłowy jest również wskaźnik neutrofilowy I/T. Dokładna przyczyna zjawiska jest nieznana. Badania potwierdzają, że pewne substancje wytwarzane przez łożysko matki z H-gestozą hamują namnażanie komórek – prekursorów w szpiku. Krew pępowinowa tych noworodków również zawiera te inhibitory (1). Być może mogą one działać jeszcze jakiś czas po porodzie. Niektóre leki podawane matce mogą wywołać neutropenię u płodu. Należą do nich propyltiouracyl, sulfonamidy, niektóre leki przeciwdrgawkowe, leki przeciwzapalne np. indometacyna, leki przeciwbólowe, penicyliny, leki cytotoksyczne. Odnotowano również przypadki neutropenii towarzyszącej chorobie hemolitycznej z zakresu układu Rh. Zmniejszenie liczby neutrofili, podobnie jak trombocytopenia, jest następstwem znacznie zwiększonej erytropoezy, kosztem redukcji granulo- i trombocytopoezy w szpiku. Neutropenia trwa 3-5 dni i towarzyszy raczej ciężkim przypadkom choroby hemolitycznej. Podobne zjawisko przejściowej hyporegeneracyjnej neutropenii obserwowane jest w przypadkach transfuzji między płodami, występującej w ciąży mnogiej. U płodu – dawcy wraz z przyspieszeniem erytropoezy wtórnie do anemii pojawia się redukcja leukopoezy. Spada stężenie CFU-GM w surowicy. Neutropenia może towarzyszyć również niektórym chorobom metabolicznym np. glikogenozom, tyrozynemii, chorobie syropu klonowego.
Infekcje są obecnie najczęstszą przyczyną zachorowalności i śmiertelności w okresie noworodkowym. Duży niepokój budzi wśród neonatologów fakt, że prawidłowa ocena chorych noworodków na podstawie badania przedmiotowego jest często niemożliwa. Objawy infekcji mogą być dyskretne i nieswoiste, brak jest charakterystycznego obrazu zakażenia. Wiele klinicznych obserwacji próbuje określić użyteczność badania poziomu neutrofili w surowicy do oceny, u których noworodków istnieją większe szanse rozwinięcia się infekcji. Wskaźniki neutrofilowe: całkowita liczba granulocytów oraz stosunek form niedojrzałych do całkowitej liczby wydają się być swoistymi wyznacznikami toczącego się procesu zapalnego, nawet gdy nie dołączyły się jeszcze objawy kliniczne.
Również nasza Klinika Neonatologii CMKP przeprowadziła badania próbujące określić, jak zachowują się te wskaźniki we krwi pępowinowej noworodków. Do badań wybrano „potencjalnie zdrowe”, donoszone noworodki, urodzone w stanie dobrym – 8 do 10 punktów wg Apgar. Ciąże, z których pochodziły wybrane noworodki przebiegały bez powikłań.
Badania przeprowadzono w wybranej grupie 130 noworodków urodzonych w Klinice Położnictwa Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w okresie od 19 lutego 1996 do 18 lutego 1998. Krew do badania pobierano z żyły pępowinowej na sali porodowej. W chwili urodzenia u żadnego z dzieci nie stwierdzono cech infekcji a wywiad okołoporodowy matki nie wskazywał na zwiększone ryzyko jej wystąpienia u dziecka. Z badań wyłączono noworodki z niską masą urodzeniową (zarówno wcześniaki jak i SGA), dzieci urodzone w zamartwicy, dzieci z rozpoznanymi perinatalnie wadami wrodzonymi, a także przypadki choroby hemolitycznej. Nie objęto badaniami dzieci matek z potwierdzoną EPH-gestozą oraz dzieci matek otrzymujących w czasie ciąży leki mogące mieć wpływ na proces leukopoezy (nadczynność tarczycy, choroby układowe leczone sterydami). Celem pracy była ocena następujących parametrów: liczby granulocytów we krwi pępowinowej oraz wskaźnika neutrofilowego czyli stosunku niedojrzałych form granulocytów do całkowitej ich liczby, (I/T immature to total ratio). Wartości powyższe wraz z liczbą płytek i białkami ostrej fazy znane są od dawna jako podstawowe hematologiczne wyznaczniki toczącego się procesu zapalnego. Parametry neutrofilowe krwi pępowinowej porównywaliśmy z późniejszym przebiegiem okresu noworodkowego, szczególnie pod kątem występowania infekcji o wczesnym początku. Termin ten używany jest w odniesieniu do infekcji występujących nie później niż w pierwszym tygodniu życia.
Dzieci podzielono na dwie grupy. Pierwszą stanowiły dzieci, których stan ogólny w trakcie pobytu w oddziale noworodkowym nie budził zastrzeżeń i nie demonstrowały objawów infekcji. Druga grupa dzieci to noworodki, u których rozpoznano infekcję w pierwszym tygodniu życia, w rozpoznaniu brano pod uwagę objawy kliniczne oraz badania: laboratoryjne, radiologiczne i bakteriologiczne. Wśród objawów klinicznych dominowały: tachypnoe, apatia, niechęć do jedzenia, wymioty oraz zaburzenia termoregulacji. Objawy te występowały najczęściej w ciągu pierwszych 48 godzin życia. Przebieg infekcji w omawianej grupie dzieci można określić jako lekki i średni. Żadne z dzieci nie wymagało wprowadzenia pomocy oddechowej. Do pierwszej grupy dzieci zdrowych włączono 118 dzieci, do drugiej 12. W żadnej z grup nie obserwowano neutropenii we krwi pępowinowej. Za wartość liczbową neutropenii przyjęto liczbę granulocytów równą lub niższą od 2,0 G/l. U 76,3% zdrowych i u 83% chorych dzieci uzyskano wartość granulocytów w przedziale liczbowym 5-15 G/l. Zwraca uwagę fakt, że wszystkie chore noworodki miały we krwi pępowinowej liczbę granulocytów przekraczającą 5 G/l. Najwyższy poziom granulocytów wśród zdrowych dzieci wynosił 23 G/l, najniższy 2,2 G/l. Jednocześnie całkowita leukocytoza mieściła się w przedziale 6-39 G/l. Badania te potwierdzają fakt fizjologicznej neutrofilii u noworodków. Wskaźnikiem zdecydowanie wyróżniającym grupę zdrowych i chorych noworodków jest wskaźnik neutrofilowy. W grupie drugiej obejmującej chore dzieci 58,3% miało we krwi pępowinowej I/T >= 0,2, podczas gdy w grupie pierwszej wskaźnik I/T był większy niż 0,2 tylko u 13,5% dzieci. Najwyższy wskaźnik I/T w grupie pierwszej wyniósł 0,42 w grupie drugiej 0,74.
Otrzymane wyniki pozwalają na wysunięcie następującego wniosku, że zwiększenie wartości wskaźnika neutrofilowego jest ważnym laboratoryjnym objawem wczesnej infekcji okresu noworodkowego. Neutrofilię krwi pępowinowej należy traktować jako zjawisko fizjologiczne.

Podziękowanie
Dziękuję Pani Profesor Barbarze Żupańskiej z Instytutu Hematologii w Warszawie za życzliwe uwagi i zachętę do pracy.
Urszula Jędrasiak
Piśmiennictwo
1. Al-Mulla Z., Christensen R.: Neutropenia in the neonate Clinics in Perinatology 1995, 22:711-739. 2. Baley J.E. et al.: Neonatal neutropenia. Am. J. Dis. Child. 1988, 142:1161-1166. 3. Ballow M. et al.: Development of the immune system in very low birth weight (less than 1500 g) premature infants: concentration of plasma immunoglobulins and patterns of infections. Pediatr. Res. 1986, 20:899-904. 4. Borkowski W.M.: Problemy hematologiczne okresu noworodkowego. Neonatologia pod red. Danuty Łozińskiej i Ireny Twarowskiej, PZWL 1993. 5. Campbell J.: Neonatal Pneumonia Seminars in respiratory Infections 1996, 11(3):155-162. 6. Carr D. et al.: Neutrophil chemotaxis an adhesion in preterm babies. Arch. Dis. Child 1992, 67:813-817. 7. Chabior M.: Cellular and humoral components of neutrophil chemotaxis in neonates wit bacterial infection Mater Med. Pol., 1994, 26 (2):49-53. 8. Haeney M.: Infection determinants at extremes of age. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1994, 34, Suppl. A, 109. 9. Hanson L.A. et al.: Breast feeding: overwiev and breast milk immunology. Acta Paediatr. Jp. 1994, Oct 36 (5):557-61. 10. Harris D.T. et al.: Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes Proc. Natl Acad Sci. USA 1992, 89:10006-10010. 11. Iwaszko-Krawczuk W.: Udział leukocytów w zjawiskach odpornościowych u noworodków. Postępy w neonatologii Tom 3 1992, Red. Irena Twarowska. Klinika Neonatologii IGiP Akademii Medycznej. 12. Jakóbisiak M.: Podstawy immunologii. Warszawska Akademia Medyczna 1992. 13. Mostov K.E.: Transepithelial transport of immunoglobulins. Annu Rev. Immunol., 1994, 12:63-84. 14. Nahmias A.J., Kourtis A.P.: The pregnant woman, placenta, fetus and infectious agents. Clinics in Perinatology 1997, Jun 24, 497-521. 15. Perez E., Weisman L.: Novel approaches to the prevention and therapy of neonatal bacterial sepsis. Clinics in Perinatology. 1997 March 24, 213-226. 16. Rosenthal J., Cairo M.S.: The role of cytokines in modulating neonatal myelopoiesis and host defense Cytokines Moi Ther 1995 Sep 1 (3) 167-176. 17. Schroten H. et al.: Inhibitor of adhesion of S-fimbriated E. coli to buccal epithelial cells by human skim milk is predominantly mediated by mucins and depends on the period of lactation. Acta Paediatr. 1993, Jan 82 (1):6-11. 18. Sievers E.L., Dale D.C.: Non-malignant neutropenia. Blood Reviews 1996, 10:95-100. 19. Smith D.J., Taubman M.A.: Emergence of immune competence in saliva. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1993, 4(3-4):335-341. 20. Thilaganathan B. et al.: Labor: an immunologically beneficial process for the neonate. Am. J. Obstet-Gynecol 1994 Nov 171 (5):1271-2. 21. Traczyk W.Z., Trzebski A.: Fizjologia człowieka z elementami fizjologii stosowanej i klinicznej. PZWL 1990. 22. Wolach B. et al.: Some aspects of the humoral immunity and fagocytic function in newborn infants. Isr. J. Med. Sci., 1994, 30 (5-6):331-5. 23. Wolfe M., Wandstrat T.L.: Hematopeietic growth factors. Neonatal Netw 1996, Sep 15 (6):7-11. 24. Yu J.: Regulation and reconstitution of human hematopoiesis. Formos Med. Assoc. 1996 Apr 95 (4):281-293.
Nowa Pediatria 5/1999
Strona internetowa czasopisma Nowa Pediatria