© Borgis - Postpy Fitoterapii 3/2007, s. 128-132
*Anna Kędzia
Wrażliwość bakterii beztlenowych na olejek geraniowy ( Oleum geranii)
The susceptibility of anaerobic bacteria to Geranium oil (Oleum geranii)
Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej, Katedra Mikrobiologii AM w Gdańsku
Kierownik Zakładu i Katedry: dr hab. prof. nadzw. Anna Kędzia
Summary
The sensitivity to geranium oil (Avicenna – Oil) 92 strains of anaerobic bacteria isolated from patients with infections of oral cavity were tested. Investigation was carried out using the plate dilution technique in Brucella agar supplemented with 5% defibrynated sheep blood, menadione and hemin. Inoculum contained 106 CFU per spot was seeded with Steers replicator upon the surface of agar with various oil concentrations as well as upon that no oil added (anaerobes growth control). Incubation the plates was performed in anaerobic conditions, in anaerobic jar, in 37°C for 48 hours. MIC was interpreted as the lowest concentration of essential oil inhibiting the growth of anaerobic bacteria.
The results of investigations indicated, the most susceptible to geranium oil from Gram-negative rods were the strains from the genus of Bacteroides ureolyticus (MIC in ranges ≤0,06-0,5 mg/ml). The strains belonging to the genus of Tannerella forsythensis and Bacteroides fragilis were the lowest sensitive (MIC within the ranges of 1-≥3 mg/ml). From among Gram-positive anaerobes the most sensitive were the strains of rods (particularly from the genus of Propionibacterium) and bacilli (Clostridium). The concentrations in ranges ≤0,06-0,5 mg/ml inhibited the growths of 69% of rods and 67% of the bacilli. The Gram-positive anaerobic bacteria were more sensitive to tested oil than the Gram-negative
Od tysięcy lat ludzie wykorzystywali właściwości lecznicze roślin. Zioła były bardzo cenione przez wszystkie starożytne cywilizacje. Na roślinach bazowała medycyna hinduska. Indyjski władca Ashoka już w III w. p.n.e. prowadził uprawy roślin leczniczych. W Egipcie od czasów faraonów używano olejków eterycznych w różnych celach, także leczniczych. W Chinach 2000 lat p.n.e. powstało dzieło p.t. „Pen ts´ao kang-mon”, które zawierało ok. 8000 receptur, głównie ziołowych. Olejki eteryczne stosowali też medycy greccy i rzymscy. Od XI wieku olejki roślinne były znane na terenie ówczesnej Europy. Słynny lekarz arabski Awicenna (980-1037) opisał metodę destylacji, która umożliwiała wyodrębnianie olejków z roślin.
Olejek geraniowy otrzymywany jest z roślin należących do rodzaju Pelargonium z rodziny Geraniaceae (bodziszkowate). Najlepszy olejek uzyskiwany jest metodą destylacji z parą wodną rośliny (liście, łodygi i kwiaty) Pelargonium graveolens.Roślina ta uprawiana jest w wielu krajach leżących w strefie podzwrotnikowej, zwrotnikowej, a także umiarkowanej. Największe plantacje znajdują się w basenie morza Śródziemnego i w delcie Nilu. Roślina osiąga ok. 60 cm wysokości. Wytwarza różowe, czerwone lub białe kwiaty i charakteryzuje się słodkawym zapachem. Znanych jest ok. 700 odmian geranium. Jednak najwięcej olejku geraniowego wytwarza gatunek Pelargonium graveolens.
Do głównych składników olejku należą geraniol i cytronellol. Zawiera on także kwas geraniowy, linalol, mirtenol, terpineol, cytral i eugenol. Ze względu na to, że olejek geraniowy wykazuje działanie przeciwdrobnoustrojowe, znalazł on zastosowanie jako antyseptyk w stomatologii, w leczeniu zapaleń błony śluzowej jamy ustnej, szczególnie związanych z użytkowaniem protez zębowych ( stomatitis) i zapaleń języka ( glossitis). Stosowany jest też w leczeniu grypy, przeziębień, zapaleń gardła i zatok oraz w egzemach, trądziku, zmianach opryszczkowych, łupieżu i cellulitis. Ponadto wykazuje działanie moczopędne, uspokajające i regulujące krążenie krwi; łagodzi zaburzenia związane z menopauzą i cukrzycą. Jednak nie powinno się stosować terapii olejkiem geraniowym u dzieci do lat 6 i u kobiet razem ze środkami antykoncepcyjnymi (ponieważ stymulują wytwarzanie estrogenów).
Z badań przeprowadzonych przez różnych autorów wynika, że olejek geraniowy działa przeciwbakteryjnie, przeciwgrzybiczo i przeciwwirusowo (1-13). Morris i wsp. (3) wykazali wpływ geraniolu wobec różnych drobnoustrojów, w tym Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dyfteroidów oraz Candida albicans.Stężenia hamujące wzrost wymienionych szczepów były następujące: 1000 ppm ( S. aureus),> 1000 ppm ( E. coli), 500 ppm (dyfteroidy) i> 1000 ppm ( C. albicans). Inouye i wsp. (2) wykazali działanie hamujące (MIC) na wzrost niektórych szczepów wzorcowych, tj. Haemophilus influenzae ATCC 3391, Streptococcus pyogenes ATCC 12344, Streptococcus pneumoniae IP-692, Streptococcus pneumoniae PRC-53, Staphylococcus aureus FDA 209P JC-1 i Escherichia coli NINJ JC-2. Crociani i wsp. (1) badali działanie olejków eterycznych otrzymanych z 20 różnych roślin, w tym także olejku geraniowego. Stwierdzili oni, że jest on aktywny wobec szczepów z rodzaju Bifidobacterium w stężeniach wynoszących od 400 do 1400 ppm.
Wyniki doświadczeń przeprowadzonych przez Lis-Balchin i wsp. (14) wskazują, że składniki olejku geraniowego, tj. cytronellol i geraniol, działały bardziej aktywnie na 25 badanych szczepów bakterii niż sam olejek. Natomiast aktywność olejku geraniowego, otrzymanego z rośliny Pelargonium graveolens, wobec bakterii powodujących trądzik, udowodnili Bensonilah i wsp. (15). Inni autorzy (16) wykazali działanie tego olejku wobec różnych drobnoustrojów wyizolowanych z dróg rodnych. Stężenia hamujące wzrost i stężenia bakteriobójcze wynosiły dla szczepów Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae i Atopobium vaginae 1 μg/ml, a dla szczepów pałeczek Lactobacillus acidophilus i Lactobacillus casei 10 μg/ml. Z badań Pauli (5) wynika, że w stężeniach wynoszących ≥250 ppm geraniol wykazuje działanie wobec bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, grzybów pleśniowych i dermatofitów.
Ferrini i wsp. (17) oceniali wpływ olejków eterycznych otrzymanych z 20 roślin na bakterie z rodzaju Bacillus, Lactobacillus, Clostridium i Bifidobacterium i wykazali największą aktywność olejku cynamonowego (200-800 ppm), goździkowego (200-1400 ppm) oraz geraniowego, tymiankowego i miętowego (400-2000 ppm). W innych badaniach olejku geraniowego otrzymanego z rośliny Pelargonium odoratissimum Ait. (liście) udowodniono jego aktywność wobec różnych drobnoustrojów (13). Olejek hamował wzrost szczepu Staphylococcus aureus FDA 209P (100 μg/ml), Staphylococcus aureus (250 μg/ml), Enterococcus faecalis (250 μg/ml), Escherichia coli (250 μg/ml), Klebsiella pneumoniae (250 μg/ml) i Pseudomonas aeruginosa (750 μg/ml).
W tych badaniach (13) grzyby drożdżopodobne okazały się także bardzo wrażliwe na Ol. Geranii.Wzrost gatunków Candida albicans, C. krusei i Geotrichum candidum był hamowany w stężeniu 250 μg/ml. Natomiast dla dermatofitów stężenia MIC wynosiły od 500 do 1000 μg/ml (13). Pattnaik i wsp. (18) wykazali aktywność wobec grzybów geraniolu, jednego ze składników olejku geraniowego. Według tych autorów (18) geraniol może hamować przez długi czas wytwarzanie zarodników grzybów. Przeciwgrzybicze działanie zostało też potwierdzone przez Garsona i wsp. (19). Inouye i wsp. (9, 12) udowodnili aktywność geraniolu wobec grzybów z gatunku Trichophyton mentagrophytes. Natomiast Maruzzella i wsp. (10) opisali działanie olejku geraniowego pochodzącego z Algierii na grzyby drożdżopodobne Candida tropicalis, C. albicans, Cryptococcus neoformans oraz grzyby pleśniowe Aspergillus niger, Alternaria solani, Penicillium digitatum i inne. Silne działanie olejku wobec Candida albicans wykazali też Villon i wsp. (20). Przeprowadzone dotychczas badania dotyczą najczęściej bakterii tlenowych lub względnie beztlenowych, a rzadko bakterii beztlenowych.
Celem pracy była ocena wrażliwości na olejek geraniowy ( Ol. Geranii)bakterii beztlenowych pochodzących z zakażeń jamy ustnej.
Materiały i metody
Bakterie beztlenowe zostały wyizolowane z materiałów pobranych od pacjentów z różnymi zakażeniami w obrębie jamy ustnej. Pobrane z zachowaniem zasad aseptyki materiały były posiewane na powierzchni podłoża wzbogaconego z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej i sześciu podłoży wybiórczych dla beztlenowców (21, 22). Inkubację posiewów prowadzono przez 10 dni w 37°C w anaerostatach wypełnionych mieszaniną gazów o składzie: 10% CO2, 10% H2 i 80% N2, zawierających katalizator palladowy i wskaźnik beztlenowości. Wyhodowane bakterie beztlenowe były identyfikowane zgodnie z obowiązującymi zasadami (21, 23), z uwzględnieniem zmian taksonomicznych (24-26). Badano cechy morfologiczne, fizjologiczne i biochemiczne, które obejmowały testy API 20A (bio Merieux), wytwarzanie z glukozy kwasów tłuszczowych od C1 do C6, kwasu mlekowego i bursztynowego oraz zdolność bakterii do wytwarzania barwników fluoryzujących w promieniach UV (21- 23).
Ocenie wrażliwości poddano 92 szczepy bakterii beztlenowych zakwalifikowanych do następujących rodzajów: Tannerella (3 szczepy), Bacteroides (4), Prevotella (24), Porphyromonas (15), Fusobacterium (9), Veillonella (2), Anaerococcus (2), Finegoldia (3), Micromonas (7), Peptoniphilus (4), Actinomyces (3), Eubacterium (2), Propionibacterium (11), Clostridium (3) oraz 5 szczepów wzorcowych z gatunków: Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroides ovatus ATCC 8483, Bacteroides vulgatus ATCC 8482, Fusobacterium nucleatum ATCC 25585, Propionibacterium acnes ATCC 11827.
Badanie wrażliwości (MIC) bakterii beztlenowych na olejek geraniowy (Avicenna-Oil, Wrocław) przeprowadzono metodą seryjnych rozcieńczeń w agarze Brucella z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej, menadionu i heminy. Bezpośrednio przed badaniem 100 mg olejku rozpuszczano w DMSO (Serva). Dalsze rozcieńczenia były wykonywane w jałowej wodzie destylowanej. Podłoża zawierały następujące stężenia olejku: 3,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,12 i 0,06 mg/ml. Inoculum zawierające 106 drobnoustrojów (CFU) na kroplę było nanoszone na powierzchnię podłoży inokulatorem Steersa. Podłoże nie zawierające olejku stanowiło kontrolę wzrostu ocenianych szczepów. Inkubację podłoży prowadzono w anaerostatach, w warunkach beztlenowych, w temp. 37°C, przez 48 godzin. Za najmniejsze stężenie hamujące (MIC) uznano takie rozcieńczenie olejku geraniowego, które powodowało całkowite zahamowanie wzrostu drobnoustrojów beztlenowych.
Wyniki badań i ich omówienie
Uzyskane wyniki wrażliwości na olejek geraniowy Gram-ujemnych bakterii beztlenowych zebrano w tabeli 1, a wyniki dotyczące drobnoustrojów Gram-dodatnich w tabeli 2. Spośród Gram-ujemnych pałeczek beztlenowych największą wrażliwością na badany olejek charakteryzowały się szczepy z gatunku Bacteroides ureolyticus (MIC w granicach 0,06-0,12 mg/ml) (tabela 1). Wysoką wrażliwość wykazały też szczepy z rodzaju Prevotella. W zakresie stężeń 0,5 - ≤0,06 mg/ml wrażliwych było 46% tych pałeczek. Na uwagę zasługuje fakt, że olejek działał bardzo aktywnie wobec szczepów z gatunku Prevotella intermedia, które często uczestniczą w ciężkich zakażeniach, nie tylko w obrębie jamy ustnej.
Tabela 1. Wrażliwość beztlenowych bakterii Gram-ujemnych na olejek geraniowy.
DrobnoustrojeLiczba szczepówNajmniejsze stężenie hamujące (MIC w mg/ml) 
≥3,02,01,00,50,250,12≤0,06
Tannerella forsythensis321     
Bacteroides fragilis22      
Bacteroides ureolyticus2     11
Prevotella bivia41 2 1  
Prevotella denticola31  1  1
Prevotella intermedia1241 322 
Prevotella oralis321     
Prevotella oris21    1 
Porphyromonas asaccharolytica21 1    
Porphyromonas gingivalis134331 2 
Fusobacterium nucleatum933 2 1 
Gram-ujemne pałeczki łącznie5521967372
Veillonella parvula21     1
Gram-ujemne bakterie ogółem5722967373
Tabela 2. Wrażliwość beztlenowych bakterii Gram-dodatnich na olejek geraniowy.
DrobnoustrojeLiczba szczepówNajmniejsze stężenie hamujące (MIC w mg/ml) 
≥3,02,01,00,50,250,12≤0,06
Anaerococcus prevotii21 1    
Finegoldia magna3    111
Micromonas micros72 11111
Peptoniphilus asaccharolyticus4 2  11 
Gram-dodatnie ziarniaki ogółem163221332
Actinomyces israelii31  1  1
Eubacterium alactolyticum2 1 1   
Propionibacterium acnes113  3 23
Gram-dodatnie pałeczki ogółem1641 5 24
Clostridium perfringens1   1   
Clostridium septicum21    1 
Gram-dodatnie laseczki ogółem31  1 1 
Gram-dodatnie bakterie ogółem358327366
Stwierdzono, że wzrost ponad połowy szczepów (58%) był hamowany w zakresie niskich stężeń (MIC wynosiło od 0,5 do ≤0,06 mg/ml). Niższą wrażliwością charakteryzowały się wrzecionowce, z których ok. 1/3 szczepów była wrażliwa na niskie stężenia, wynoszące od ≤0,06 do 0,5 mg/ml. Jeszcze niższą aktywność wykazał olejek geraniowy wobec pałeczek z rodzaju Porphyromonas, ponieważ aż 80% szczepów wymagało do zahamowania wzrostu stężeń w zakresie od 1 do 3 mg/ml lub więcej. Najniższą wrażliwość wykazały pałeczki z gatunku Tannerella forsythensis i Bacteroides fragilis (MIC w zakresie 2-3 mg/ml lub więcej). Natomiast w badaniach przeprowadzonych przez Schwiertza i wsp. (16) dla szczepu z gatunku Bacteroides vulgatus stężenie olejku, zarówno hamujące wzrost (MIC), jak i bakteriobójcze (MBC), wynosiło zaledwie 1 μg/ml.
Wśród Gram-dodatnich bakterii beztlenowych (tabela 2) najwyższą wrażliwością charakteryzowały się pałeczki oraz laseczki. W zakresie niskich stężeń wynoszących od 0,5 do ≤0,06 mg/ml wrażliwość wykazało 69% pałeczek i 67% laseczek. Spośród pałeczek wysoka wrażliwość w niskich stężeniach dotyczyła gatunku Propionibacterium acnes (73%). Crociani i wsp. (1) również wykazali, że olejek geraniowy hamował wzrost 16 szczepów z rodzaju Bifidobacterium w stężeniach wynoszących od 400 do 1400 ppm. W tych badaniach najniższą wrażliwość wykazały szczepy z gatunku Bifidobacterium denticolens (400 ppm). Wyniki innych badań (8) także to potwierdzają. Autorzy wykazali, że pałeczki z rodzaju Bifidobacterium (7 szczepów) i laseczki z rodzaju Clostridium (8 szczepów) były wrażliwe na stężenia w granicach od 200 do 1400 ppm.
Natomiast niższą aktywność wykazał olejek geraniowy wobec badanych Gram-dodatnich ziarniaków. Niskie stężenia w zakresie 0,5-0,06 mg/ml lub niższe, hamowały wzrost 56% tych bakterii. Najbardziej wrażliwe okazały się ziarniaki z gatunku Finegoldia magna (MIC w zakresie 0,25-≤0,06 mg/ml), a najbardziej oporne z gatunku Anaerococcus prevotii (MIC w zakresie 1-3 mg/ml).
Oceniany olejek geraniowy działał w niskich stężeniach (MIC w zakresie 0,5-≤0,06 mg/ml) na 46% wszystkich badanych bakterii beztlenowych. Zaledwie 5% szczepów nie było wrażliwych w zakresie testowanych stężeń olejku. Dla tych szczepów MIC było wyższe niż 3 mg/ml. Natomiast wzrost szczepów wzorcowych był hamowany w stężeniach ≥3 mg/ml, z wyjątkiem szczepu Propionibacterium acnes (MIC = 0,25 mg/ml).
Przeprowadzone badania wskazują, że bakterie Gram-dodatnie beztlenowe były bardziej wrażliwe na oceniany olejek geraniowy niż bakterie Gram-ujemne (MIC wynoszące 0,5-≤0,06 mg/ml) hamowały odpowiednio wzrost 63% i 35% bakterii.
Wnioski
1. Największą wrażliwość na olejek geraniowy, wśród bakterii Gram-ujemnych, wykazały szczepy z gatunku Bacteroides ureolyticus.
2. Najmniej wrażliwe na olejek były Gram-ujemne pałeczki z gatunku Tannerella forsythensis i Bacteroides fragilis.
3. Wśród bakterii Gram-dodatnich najbardziej wrażliwe były pałeczki, szczególnie z rodzaju Propionibacterium i laseczki z rodzaju Clostridium.
4. Beztlenowe bakterie Gram-dodatnie wykazały wyższą wrażliwość na olejek geraniowy niż bakterie Gram-ujemne.
5. Olejek geraniowy wykazał wysoką aktywność wobec badanych bakterii beztlenowych, co wskazuje na możliwość praktycznego wykorzystania w lecznictwie.
Piśmiennictwo
1. Crociani F., Biavati B., Alessandrini A.: Growth inhibition of essential oils and other antimicrobial agents towards Bifidobacteria from dental caries. 27th Int. Symp. Essential.Oils. Sept. 8-11, Vienna, 1996, 40. 2. Inouye S., Yamagouchi H., Takizawa T.: Screening of the antibacterial effects of a variety of essentials oils on respiratory tract pathogens, using a modified dilution assay method. J. Infect. Chemother. 2001, 7, 251. 3. Morris J.A., Khettry A., Seitz E.W.: Antimicrobial activity of aroma chemicals and essential oils. J. Am. Oil. Chem. Soc. 1979, 56, 595. 4. Kalemba D.: Przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe właściwości olejków eterycznych. Post. Mikrobiol., 1998, 38, 165. 5. Pauli A.: Antimicrobial properties of essentials oil constituents. Int. J. Aromather. 2001, 11, 126. 6. Gravett P.: Aromatherapy - treatment of severe oral mucositis. Int. J. Aromather. 2000, 10, 85. 7. Edwards-Johnes V., Buck R., Shawcross S.G., Dawson M.M., Dunn K.: The effect of essential oils on methicillin-resistant Staphylococcus aureus using a dressing model. Burns. 2004, 30, 772. 8. Kalemba D., Kunicka A.: Antibacterial and antifungal properties of essentials oils. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 813. 9. Inouye S., Uchida K., Abe S.: Volatile composition and vapour activity against Trichophyton mentagrophytes of 36 aromatic herbs cultivated in Chichibu district in Japan. Int. J. Aromather. 2006, 16, 159. 10. Maruzzella J.C., Ligurio L.: The in vitro antifungal activity of essentials oils. J .Am. Pharm. Assoc. 1956, 47, 250. 11. Pawar V.C., Thaker V.S.: In vitro efficacy of 75 essential oils against Aspergillus niger. Mycoses. 2006, 49, 316. 12. Inouye S., Uchida K., Abe S.: Vapor activity of 72 essential oils against a Trichophyton mentagrophytes. J. Infect. Chemother. 2006, 12, 210. 13. Kędzia B., Hołderna-Kędzia E.: Badanie wpływu olejków eterycznych na bakterie, grzyby i dermatofity chorobotwórcze dla człowieka. Post. Fitoter. 2007, 2, 71. 14. Lis-Balchin M., Deans S.G., Hart S.: Bioactivity of geranium oils from different commercial sources. J. Ess. Oils Res. 1996, 8, 281. 15. Bensouilah J.: Aethiology and management of acne vulgaris. Int. J. Aromather. 2002, 12, 99. 16. Schwiertz A., Duttke C., Hild J., Muller H.J.: In vitro activity of essentials oils on microorganisms isolated from vaginal infections. Int. J. Aromather. 2006, 16, 169. 17. Ferrini A.M., Mannoni V., Hodzic S., Salvatore G., Aureli P.: Antimicrobial activity of bergamot oil in relation to chemical composition of different origin. Riv. Ital. EPPOS. (Spec. Num.) 1998, 9, 140. 18. Pattnain S., Subramanyan V.R., Bapaji M., Kole C.R.: Antibacterial and antifungal activity of aromatic constituents of essentials oils. Microbios. 1997, 89, 39. 19. Garson C.F., Rile T.V.: Antimicrobial activity of the major components of the essentials oil of Melaleuca alternifolia. J. Appl. Bacteriol. 1995, 78, 264. 20. Villon C., Leger D., Chaumont J.P.: The antagonistic properties in vitro, of specified natural volatile compounds with respect to germs of vaginal flora. Plants Med. Phytother. 1993, 26, 17. 21. Holdeman L.V., Cato E.P., Moore W.E.C.: Anaerobe Laboratory Manual. V.P.I., Blacksburg, 4th ed., Baltimore M.D., Virginia 1977. 22. Kałowski M., Kędzia A.: Nieprzetrwalnikujące drobnoustroje beztlenowe. W: Diagnostyka mikrobiologiczna w medycynie (red. W. Kędzia). PZWL, Warszawa 1990. 23. Holt J.G.: Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. Williams and Wilkins 9th ed. Baltimore M.D. 1993. 24. Forbes B.A., Sahm D.F., Weissfeld A.S.: Bailey and Scott´s Diagnostic Microbiology. 12th ed. Mosby Elsevier. St. Louis 2007. 25. Murdoch D.A., Shah H.N.: Reclassification of Peptostreptococcus magnus (Prevot 1933) Holdeman and Moore 1972 as Finegoldia magna comb. nov. and Peptococcus micros (Prevot 1933) Smith 1957 as Micromonas micros comb. nov. Anaerobe 1999, 5, 555. 26. Olsen I., Shah H.N.: Review and outcome of the Meetings held Manchester U.K., June 2000, by the International Committee on the Systematic of Prokaryotes Subcommittee on the Taxonomy of Gram-negative Anaerobic Rods. Anaerobe, 2001, 7, 329.
otrzymano: 2007-08-15
zaakceptowano do druku: 2007-09-20

Adres do korespondencji:
*Anna Kędzia
Zakład Mikrobiologii Jamy Ustnej Akademii Medycznej w Gdańsku
ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk
tel.: (0-58) 349-21-85
e-mail: zmju@amg.gda.pl

Postpy Fitoterapii 3/2007
Strona internetowa czasopisma Postpy Fitoterapii