Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2004, s. 62-66
Józef Kaczor1, Izabela Maria Klecha1, Wojciech Rzeski1, Roman Paduch1, Barbara Zdzisińska1, Piotr Pożarowski2, Martyna Kandefer-Szerszeń1
Ekstrakt z porka brzozowego (Piptoporus betulinus Bull. Fr.) jako inhibitor wzrostu ludzkich komórek nowotworowych*
Extract from Piptoporus Betulinus Bull. Fr. supress human tumor cell growth
1Zakład Wirusologii i Immunologii Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Martyna Kandefer-Szerszeń
2Zakład Immunologii Klinicznej Akademii Medycznej w Lublinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Jacek Roliński
Summary
The cytotoxic activity of ether extract from fruiting bodies of P. betulinus was studied. The tested substance at concentration of mg/ml significantly decreased viability of various human tumor cell lines (thyroid carcinoma, neuroblastoma, breast carcinoma, larynx carcinoma and cervix carcinoma) in time- and dose-dependent fashion. Cell cycle anałysis revealed that antitumor activity was a result of blockade of cell cycle S-phase.
Choroby nowotworowe są po chorobach układu krążenia drugą przyczyną zgonów ludzi w krajach rozwiniętych. Mimo znaczących postępów w terapii, obejmujących zabiegi chirurgiczne, chemioterapię, radioterapię, przeszczepy szpiku kostnego i immunoterapię, wiele chorób nowotworowych ma złe rokowania, stanowiąc wyzwanie dla współczesnej medycyny (31, 37, 38). Jedną z dróg rozwiązania tego problemu jest poszukiwanie nowych substancji o działaniu przeciwnowotworowym. Bogatym źródłem takich substancji jest środowisko naturalne, którego produkty są już wykorzystywane w onkologiii jako oryginalne związki lub ich chemicznie modyfikowane pochodne. W tej grupie zastosowanie praktyczne znalazły takie substancje pochodzenia roślinnego, jak paklitaksel, winblastyna, winkrystyna, etopozyd, tenipozyd (3, 6, 10, 23).
Porek brzozowy (Piptoporus betulinus Bull. Fr.) to jednoroczny grzyb z rodziny żagwiowatych, pospolicie występujący w Polsce. Pojawia się na jesieni, szczególnie na martwych pniach i gałęziach brzóz (7, 8). Huba ta, znana w medycynie ludowej do leczenia nowotworów, zwróciła uwagę lekarzy i badaczy (1, 13, 21, 24-26, 29). Badania wykazały, że wyciągi z tej huby, jak i niektóre substancje w nich występujące, mają szereg właściwości biologicznych, obejmujących aktywność przeciwbakteryjną (9, 22, 30,35), przeciwwirusową (16, 17, 19), hamowanie mitozy komórek roślinnych (39), stymulowanie wzrostu drożdży i pleśni (9) oraz indukcję interferonu (14, 15, 18). W latach pięćdziesiątych we Wrocławiu wykazano hamujący wpływ wyciągów z P. betulinus na nowotwory złośliwe u psów (36, 40-42).
Celem niniejszych badań była wstępna ocena cytotoksycznej aktywności eterowego ekstraktu z P. betulinus w hodowlach ludzkich komórek nowotworowych.
MATERIAŁ I METODY
Wyciąg eterowy z owocników Piptoporus betulinus
Owocniki huby Piptoporus betulinus, zebrane jesienią w okolicach Załucza (Poleski Park Narodowy), wysuszono w temperaturze pokojowej i rozdrobniono mechanicznie. Suchą masę (71,9 g) poddano kilkudziesięciogodzinnej ekstrakcji eterem w aparacie Soxhleta. Otrzymany żółtobrązowy ekstrakt PBII98 (10,31 g) poddano chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na standardowych płytkach z żelem krzemionkowym firmy Merck (Kieselgel 60) o wymiarach 10 x 20 cm. Chromatografię prowadzono w komorach szklanych pionowych. Jako eluentu używano mieszaniny benzen-metanol (9:1). Chromatogramy wywoływano parami jodu lub przez spryskiwanie płytek roztworem aldehydu anyżowego według Stahla (33). Za pomocą dostępnych wzorców wśród kilkunastu substancji występujących na chromatogramie zidentyfikowano między innymi kwasy poliporenowe A i B (13, 17, 19). Do badań ekstrakt rozpuszczano w DMSO w stężeniu 10 mg/ml i przechowywano w temperaturze 4°C.
Hodowle komórkowe
W badaniach użyto następujące ludzkie komórki nowotworowe:
FTC238 – raka tarczycy, linia ciągła uzyskana z ECACC – European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, England,
SK-N-AS – neuroblastomy, linia ciągła uzyskana z ECACC,
T47D – raka piersi, linia ciągła uzyskana z Zakładu Genetyki Człowieka Akademii Medycznej w Lublinie,
Hep-2 – raka krtani, linia ciągła uzyskana z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu,
HeLa – raka szyjki macicy, linia ciągła uzyskana z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu.
Do hodowli komórek FTC238, T47D, SK-NA-S zastosowano podłoże DMEM: Ham F-12 (Sigma) oraz RPM1 1640 (Sigma) (Hep-2, HeLa) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Life Techologies), penicyliny (100 j/ml) i streptomycyny (100 mg/ml) (Sigma). Komórki hodowano w inkubatorze z przepływem 5% CO2 w temperaturze 37°C.
Badanie aktywności cytotoksycznej
Do płytki 96-dołkowej z płaskim dnem (Nunc) rozlewano po 100 ml przygotowanej wcześniej zawiesiny hodowli o gęstości: 3x105 komórek/ml dla linii FTC238 i T47D, 4 x 105 dla linii SK-N-AS oraz 2 x 105 komórek/ml dla linii Hep-2 i HeLa. Po przyklejeniu się komórek do dna płytki (24 godz.) delikatnie ściągano płyn i dodawano roztwór badanej substancji w płynie hodowlanym z dodatkiem 2% FBS (100 ml na dołek). Stosowano następujące stężenia ekstraktu z P. betulinus: l, 5, 10, 25 i 50 mg/ml.
Oznaczanie żywotności komórek metodą MTT
Metoda ta została opracowana w celu oznaczania proliferacji i żywotności komórek w badaniach substancji o aktywności cytotoksycznej i antyproliferacyjnej. W komórkach metabolicznie czynnych żółta sól tatrazolowa MTT redukowana jest do niebieskiego formazanu przy udziale dehydrogenaz mitochondrialnych. Nierozpuszczalne w wodzie kryształki formazanu gromadzą się w komórkach i do ich rozpuszczenia konieczne jest użycie organicznego detergentu rozbijającego błony i jednocześnie rozpuszczającego barwnik. W tym celu używany jest bufor SDS-HCl o pH 7,4. Stężenie uwolnionego barwnika mierzy się ilościowo w czytniku do płytek 96-dołkowych przy długości fali 570 nm. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek.
Roztwór MTT (5 mg/ml) (Sigma) dodawano w ilości 10 ml do każdego dołka na mikropłytce. Płytki inkubowano przez 3 godz. w temp. 37°C, następnie do każdego dołka dodawano l00 ml buforu SDS-HCl i pozostawiano na noc w temp. 37°C. Następnie odczytywano gęstość optyczną przy użyciu czytnika do mikropłytek (Molecular Devices Corporation).
Analiza cyklu komórkowego
Komórki linii FTC238 poddano działaniu ekstraktu z P. betulinus w stężeniu 5 mg/ml przez 96 godz. Komórki utrwalano w zimnym 70% etanolu, poddano działaniu RNA-zy (Sigma), następnie barwiono DNA jodkiem propidyny (Sigma). Tak przygotowany preparat poddano analizie w cytometrze przepływowym (Ortho Diagnostic Systems) przy długości fali lasera 488 nm. Do obsługi cytometru wykorzystano program ImmunoCount 2; do analizy wyników zastosowano program ModFit LT.S
WYNIKI
Badany ekstrakt charakteryzował się silną aktywnością cytotoksyczną w stosunku do wszystkich badanych rodzajów ludzkich komórek nowotworowych. Efekt przeciwnowotworowy pojawiał się już po 24 godz. inkubacji i ulegał pogłębieniu w ciągu następnych 24 godzin (tab. l). Już najmniejsza z zastosowanych dawek (1 mg/ml) powodowała istotny statystycznie, w stosunku do kontroli, spadek żywotności komórek. Wraz ze wzrostem dawki rosła aktywność cytotoksyczna ekstraktu (tab. l). Największą wrażliwością na działanie ekstraktu z P. betulinus charakteryzowały się komórki raka tarczycy (FTC238) oraz neuroblastoma (SK-N-AS). W obu przypadkach dawka 25 mg/ml powodowała całkowite zahamowanie oddychania mitochondrialnego komórek po 24 godz. Komórki raka piersi (T47D) były bardziej oporne na działanie ekstraktu PBII98 i dopiero dawka 50 mg/ml po 48 godz. inkubacji powodowała zahamowanie rozwoju komórek. Natomiast komórki raka krtani (Hep-2) oraz komórki raka szyjki macicy (HeLa) charakteryzowały się pośrednią wrażliwością na cytotoksyczne działanie ekstraktu z P. betulinus.
Tabela 1. Wpływ ekstraktu P. betulinus (PBII98) na żywotność ludzkich komórek nowotworowych. Wyniki przedstawiono jako procent żywotności komórek w stosunku do hodoli kontrolnej.
KomórkiCzas inkubacji (godz.)PBII98 (mg/ml)
15102550
FTC2382470,556,358,91,31,3
4867,848,237,21,41,6
SK-N-AS2481,362,252,21,61,1
4883,541,728,14,71,0
T47D2473,654,247,746,09,8
4875,160,948,140,41,5
Hep-22465,870,759,640,40
4861,652,344,07,00
HeLa2473,065,348,628,50
4858,737,323,02,00
Analiza cyklu komórkowego w cytometrze przepływowym wykazała, że wśród komórek FTC238 inkubowanych z ekstraktem P. betulinus jest o 30% więcej, w stosunku do kontroli, komórek będących w fazie S cyklu komórkowego, natomiast mniejsza jest w tej grupie ilość komórek w fazie Go-G1 i G2, (tab. 2).
Tabela 2. Wpływ ekstraktu P. betulinus na cykl komórkowy raka tarczycy FTC238.
Faza cyklu komórkowegoLiczba komórek (%)
KontrolaPBII98 5mg/ml
G0-G178,5474,65
G23,801,01
S17,6624,34
DYSKUSJA
Piptoporus betulinus i inne huby rosnące na brzozach były od dawna znane w medycynie ludowej jako środki używane w leczeniu chorób nowotworowych. Skład chemiczny ekstraktów P. betulinus jest w niewielkim stopniu poznany. Piśmiennictwo wykazuje obecność między innymi substancji o charakterze triterpenów. Są to głównie kwasy poliporenowe A, B i C, neosterol, fitosterol i kwasy tłuszczowe (4, 5, 20). Trojterpeny znane są ze swoich właściwości przeciwnowotworowych, np. b-sitosterol z Solanum indicum jest cytotoksyczny dla kilku rodzajów komórek rakowych (2), a kwas porikoinowy zawarty w ekstrakcie z Poria cocos dla komórek białaczki ludzkiej HL-60 (34). Natomiast kwas betulinowy z kory brzóz jest selektywnie aktywny w stosunku do komórek czerniaka i indukuje ich apoptozę (27). Badania nad aktywnością substancji zawartych w P. betulinus wykazały ich działanie przeciwbakteryjne (9, 22, 30, 35) i przeciwwirusowe (16, 17, 19), a także aktywność przeciw nowotworom zwierząt (36, 40-42).
W naszych badaniach poszczególne rodzaje ludzkich komórek nowotworowych wykazywały różną wrażliwość na ekstrakt PBII98. Znany jest fakt, że wiele chemioterapeutyków wykazuje aktywność wobec komórek będących w określonej fazie cyklu komórkowego. Znane i stosowane w praktyce lekarskiej leki przeciwnowotworowe, które działają na fazę S, są analogami kwasu foliowego, puryn i pirymidyn oraz inhibitorami topoizomerazy DNA I i II. Obecne na rynku leki przeciwnowotworowe pochodzenia naturalnego, zawierające takie substancje jak paklitaksel, winblastynę, winkrystynę działają głównie na komórki w fazie M – poprzez hamowanie tworzenia się wrzeciona kariokinetycznego (3, 10, 12, 23, 32) lub w fazie S – przez blokowanie topoizomerazy I (pochodne epipodofilotoksyny: etopozyd i tenipozyd oraz kamptotecyna i jej pochodne topotecan i irinotecan) (3, 6, 10, 28). Badany przez nas ekstrakt wyraźnie zwiększał liczbę komórek będących w fazie S cyklu komórkowego.
Aby stwierdzić, czy mechanizm działania ekstraktu z P. betulinus jest podobny do działania antymetabolitów, czy inhibitora topoizomerazy, konieczne jest przeprowadzenie dodatkowych badań cyklu komórkowego, w tym aktywności białek z rodziny cyklicznozależnych kinaz (11, 28, 43).
Dla dalszych badań aktywności przeciwnowotworowej, a także dla określenia mechanizmu działania preparatu, konieczne jest wyizolowanie z ekstraktu związku odpowiedzialnego za jego aktywność oraz opracowanie metod jego stabilizacji i przechowywania. Mimo faktu, że badany preparat pod względem aktywności przeciwnowotworowej ustępuje znanym lekom stosowanym klinicznie, wykrycie nowej, aktywnej przeciwnowotworowo substancji interesujące jest ze względów poznawczych. Przy małej ilości skutecznych chemioterapeutyków i niezwykle szerokich możliwościach przekształceń chemicznych, każdy naturalnie występujący związek stwarza nadzieję na otrzymanie nowego leku przeciwnowotworowego.
WNIOSKI
1. Badany ekstrakt eterowy z Piptoporus betulinus wykazuje in vitro antyproliferacyjne działanie na ludzkie komórki nowotworowe. Natężenie efektu zależy od dawki i czasu działania.
2. Spośród testowanych komórek bardziej podatne na działanie ekstraktu były komórki raka tarczycy FTC238 i neuroblastoma SK-N-AS.
3. Antyproliferacyjny efekt ekstraktu z Piptoporus betulinus związany jest z blokowaniem cyklu komórkowego w fazie S.

* I wersja pracy została opublikowana w czasopiśmie „Lek w Polsce” nr 8/2003.
Piśmiennictwo
l. Anioł-Kwiatkowska J.: Brzoza w weterynarii. Wiad. Ziel. 1994, Nr 4, 1-3. 2. Chiang H.C. et al.: Experimental antitumor agents from Solanum indicum L. Anticancer Res. 1991, 11, 1911-1917. 3. Cragg G.M., et al.: Coral reefs, forests, and thermal vents: the worldwide exploration of nature for novel antitumor agents. Sem. Oncol. 1997, 24, 156-163. 4. Cross L.C., et al.: Constituents of the higher fungi. Part I. The triterpene acids of Polyporus betulinus Fr. J. Chem. Soc. 1940, 632. 5. Curtis R.G. et al.: The further characterisation of polyporenic acid A. J. Chem. Soc. 1953, 457-464. 6. Damayanthi Y., Lown J.W.: Podophyllotoxins: current status and recent developments. Curr. Med. Chem. 1998, 5, 205-252. 7. Dermek A., Pilat A.: Poznajemy grzyby. Ossolineum 1998, 58. tabl. 8f. 8. Domański S., et al.: Grzyby (Mycota).T. III. PWN, Warszawa 1967, 162-163, tabl. XIV-XV. 9. Efimienko O.M.: A contribution to the physiologically active compounds of Polyporus betulinus (Bull.) Karst. Mikrobiologija 1960, 29, 548-550. 10. Furmanowa M.: Znaczenie biotechnologii roślinnej w wytwarzaniu cytostatyków. Biotechnologia 1992, 4, 26. 11. Grzelakowska-Sztabert B.: Cyclins in the G1 phase of the cell cycle, their function and participation in oncogenesis. Post. Biochem. 1966, 42, 99-197. 12. Horowitz S.B.: Taxol (paclitaxel): mechanisms of action. Ann. Oncol. 1994, 5, 3. 13. Kaczor J.: Izolacja i określenie przeciwwirusowego działania substancji z Piptoporus betulinus. Praca doktorska. Uniwersytet Marii Curie-Skołodowskiej, Lublin 1983. 14. Kendefer-Szerszeń M., Kawecki Z.: Ether extracts from the fruiting body of Piptoporus betulinus as interference inducers. Acta Microbiol. Polon. 1974, 23, 197-200. 15. Kandafer-Szerszeń M., i wsp.: Fungal nucicie acids as interferon inducers. Acta Microbiol. Polon. 1979, 28, 277-299. 16. Kandafer-Szerszeń M., Kawecki Z.: Wodne ekstrakty z grzybów jako źródło substancji o aktywności przeciwwirusowej. Ann. Univ. M. Curie-Skłodowska 1979, 34, 163-174. 17. Kandafer-Szerszeń M., i wsp.: Ekstrakty z grzybów jako źródło substancji o aktywności przeciwwirusowej. II. Zastosowanie metod chromatograficznych do izolacji substancji przeciwwirusowych z Piptoporus betulinus (Bull. ex Fr.) Ann. Univ. M. Curie-Skłodowska 1981, 36, 1-20. 18. Kawecki Z. i wsp.: Studies of RNA isolated from Piptoporus betulinus as interferon inducer. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1978, 26, 517-522. 19. Kawecki Z. i wsp.: Ekstrakty z grzybów jako źródło substancji o aktywności przeciwwirusowej. I. Zastosowanie rozpuszczalników organicznych do ekstrakcji substancji przeciwwirusowych. Ann. Univ. M. Curie-Skłodowska 1980, 35, 1-12. 20. Kocór M., i wsp.: Chemical composition of petrol extract of Polyporus betulinus. Bull. Acad. Polon. Sci. Ser. Sci. Chim. 1960. 8, 337-343. 21. Kozłowski J., Gorecki P.: Brzozy źródłem surowców zielarskich o ustalonym działaniu terapeutycznym. Wiad. Ziel. 1995, Nr 4, 1-3. 22. Marcus S.: Antibacterial activity of the triterpenoid acid (polyporenic acid C) and ungulic acid, metabolic products of Polyporus benzoinus (Wahl.) Fr. Biochem. J. 1952, 50, 516. 23. Noble R.L.: The discovery of the vinca alkaloids - Chemotherapeutic agents against cancer. Biochem. Cell Biol. 1990, 68, 1344-1351. 24. Ożarowski A.: Rośliny lecznicze w zapobieganiu i wspomaganiu leczenia nowotworów. Wiad. Ziel. 1997, Nr l, 1-3. 25. Ożarowski A.: Huba zwalcza raka. Świat to Apteka 2000, Nr 4, 49. 26. Piela S.: Brzoza i jej bioaktywne substancje. Wiad. Ziel. 1998, Nr 5, 11-12. 27. Pisha E. i wsp.: Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis. Natur. Medicine 1995, l, 1046-1051. 28. Rothenberg M.L.: Topoisomerase I inhibitors: review and update. Ann. Oncol. 1997, 8, 837-855. 29. Rymkiewicz A.: Huby brzozowe. Wiad. Ziel. 1998, Nr 5, 8. 30. Schlegel B. i wsp.: Piptamine, new antibiotic produced by Piptoporus betulinus. Antibiotics 2000, 53, 973-974. 31. Scott A.M., Cebon J.: Clinical promise of tumour immunology. Lancet 1997, 349, S19-S22. 32. Slichenmeyer W.J., Van Hoff D.D.: New natural products in cancer chemotherapy. J. Clin. Pharmacol. 1990, 30, 770-788. 33. Stahl E.: Chromatographische und mikroskopische Analyse von Drogen. Gustav Fischer Verlag 1970, 182. 34. Ukiya M. i wsp.: Inhibition of tumor-promoting effects by poricoic acids G and H and other lanostane-type triterpenes and cytotoxic activity of poricoic acids A and G from Poria cocos. J. Nat. Prod. 2002, 65, 462-465. 35. Utzig J., Fertig S.: Wpływ kwasów polyporenowych na wzrost pałeczki Brucella. Med. Wet. 1957, 5, 268. 36. Utzig J., Samborski Z.: Wpływ trójterpenów zawartych w żagwi brzozowej - Polyporus betulinus na guzy Stickera. Med. Wet. 1957, 8, 481-484. 37. Vijayakumar S., Hellman S.: Advances in radiation oncology. Lancet 1997, 349, S1-S3. 38. Vokes E.E.: Combined modality therapy of solid tumors. Lancet 1997, 349, S4-S6. 39. Wandokanty F., i wsp.: Ciała hamujące mitozę zawarte w żagwi brzozowej Polyporus betulinus. Med. Wet. 1954, 5, 289. 40. Wandokanty F. i wsp.: Wpływ hydrolizatów z żagwi brzozowej - Polyporus betulinus i guza brzozowego - Poria obliqua na komórki nowotworów złośliwych. Med. Wet. 1954, 10, 603-605. 41. Wandokanty F., Utzig J.: Wpływ żagwi brzozowej i guza brzozowego na nowotwory samorzutne psa z uwzględnieniem raka sutka u psów. Med. Wet. 1955, 3, 148. 42. Wandokanty F., Utzig J.: Wpływ trójterpenów pięciocyklicznych wyosobnionych z żagwi brzozowej (Polyporus betulinus) na nowotwory złośliwe. Med. Wet. 1958, 3, 148-151. 43. Widłak P.: The influence of DNA damage on cell cycle regulation. Post. Bioch. 1997, 43, 85.
Postępy Fitoterapii 2/2004
Strona internetowa czasopisma Postępy Fitoterapii