Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 7-8/2007, s. 315-321
*Jolanta Woźniak1, Agnieszka Krzywdzińska1, Anna Ejduk2, Grażyna Pałynyczko3
Wykrywanie choroby resztkowej w ostrej białaczce limfoblastycznej dorosłych metodą cytometrii przepływowej tzw. „pustych pól”*
Detection of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukemia by flow cytometry method so-called ´empty spaces´
1Zakład Cytobiologii Hematologicznej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Joanna Kopeć-Szlęzak
2Klinika Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Krzysztof Warzocha
3Klinika Chorób Wewnętrznych i Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Lech Konopka
Streszczenie
Wstęp i cel pracy. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki zastosowania cytometrycznej metody tzw. „pustych pól” (empty spaces-ES) w rozpoznawaniu oraz monitorowaniu choroby resztkowej u dorosłych pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną B.
Materiał i metody. Materiał do badań stanowiły aspiraty szpików 5 zdrowych dawców oraz 20 pacjentów z OBL-B. Komórki identyfikowano poprzez barwienie trójkolorowymi zestawami przeciwciał: CD10/CD20/CD19, CD34/CD22/CD19, CD34/CD38/CD19, CD45/CD34/CD19, TdT/CD10/CD19. W wykrywaniu choroby resztkowej wykorzystywano różnice w intensywności ekspresji powyższych antygenów pomiędzy komórkami prawidłowymi i białaczkowymi, które powodowały lokowanie się blastów w „pustych polach” na wykresach cytometrycznych dot plot. Dodatkowo blasty CD19+ charakteryzowano poprzez określenie na nich poziomu ekspresji antygenów mieloidalnych: CD13, CD15, CD33, CD65, CD66 oraz nadekspresji CD58.
Wyniki. Zastosowana metoda pozwoliła na określenie nietypowych immunofenotypów blastów u 90% chorych z OBL-B. Przy użyciu poszczególnych złożeń przeciwciał aberrantne fenotypy wykrywano z następującą częstością: TdT/CD10/CD19 – 61%, CD10/CD20/CD19 – 60%, CD45/CD34/CD19 – 40%, CD34/CD38/CD19 – 35%, CD34/CD22/CD19 – 25%. Antygeny mieloidalne pojawiły się na blastach 55% badanych chorych, były to głównie CD66, CD13 i CD33. Z podobną częstością wykryto nadekspresję CD58 (47%). U 6 z 17 badanych pacjentów wykryto chorobę resztkową, która u czterech poprzedziła wznowę choroby.
Wnioski. Wyniki naszych badań wskazują, iż cytometryczna metoda „pustych pól” może być z powodzeniem zastosowana do większości przypadków OBL-B i jest wiarygodnym narzędziem w ocenie choroby resztkowej u pacjentów z OBL-B.
Summary
Introduction. This study presents the effects of using the so-called ´empty spaces´ for the detection of tumor cells at diagnosis and in monitoring minimal residual disease (MRD) in adult patients with acute B-cell lymphoblastic leukemia.
Material and methods. Bone marrow samples from 5 healthy donors and 20 patients with B-ALL were investigated. Populations of B-cell precursors and leukemic blasts were identified by triple-staining panel of antibodies: CD10/CD20/CD19, CD34/CD22/CD19, CD34/CD38/CD19, CD45/CD34/CD19 and TdT/CD10/CD19. In the detection of MRD we took advantage of the differences in intensity of antigen expression on blasts and on normal B-cell precursors, responsible for localization in ´empty spaces´ on cytometric dot plots. Additional stainings were performed to investigate the expression myeloid markers: CD13, CD15, CD33, CD65, CD66. Overexpression of CD58 on CD19+ blasts was also investigated.
Results. This method allowed to identify aberrant phenotypes in 90% of tested cases. Frequencies of phenotypic aberration detected with antibody combinations were: 61% for TdT/CD10/CD19, 60% for CD10/CD20/CD19, 40% for CD45/CD34/CD19, 35% for CD34/CD38/CD19 and 25% for CD34/CD22/CD19. The myeloid antigen expression on blasts was detected in 55% of cases; mainly the coexpression of CD66, CD13 and CD33. The CD58 marker was overexpressed in 47% patients. MRD was detected in 6 out of 17 patients. Relapses occurred in 4.
Conclusion. Our study shows that flow cytometric method is applicable to most of ALL cases and is a reliable tool in monitoring MRD in B-ALL patients.
WSTĘP
Wykrywanie choroby resztkowej (MRD), z klinicznego punktu widzenia, jest jednym z najważniejszych wskaźników prognostycznych w ocenie przebiegu leczenia i ryzyka nawrotu choroby w ostrych białaczkach. Monitorowanie choroby resztkowej u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (OBL), zwłaszcza w początkowym etapie terapii indukującym remisję, jest szczególnie użyteczne w ocenie odpowiedzi na leczenie. Utrzymywanie się populacji komórek białaczkowych w szpiku, może decydować o ewentualnym zmodyfikowaniu terapii, a regularne kontrole szpiku pacjentów, pozwalają na wcześniejsze wykrycie wznowy choroby (1, 2). Udowodniono również istotne znaczenie nasilenia choroby resztkowej, zarówno u pacjentów przygotowywanych do, jak i po allogenicznym przeszczepie szpiku, jako istotnego czynnika wpływającego na wynik transplantacji (3, 4). Obecnie najbardziej swoistymi i najczulszymi metodami w ocenie MRD są techniki molekularne – ilościowa analiza real-time PCR (RQ-PCR) transkryptów genów fuzyjnych i rearanżacji genów immunoglobulin i/lub receptorów komórek T, oraz wykrywanie specyficznego immunofenotypu komórek rozrostowych metodą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. Użyteczność tych technik, zwłaszcza w odniesieniu do badania choroby resztkowej u dzieci z OBL, była wielokrotnie opisywana w literaturze (5-7).
Cytometria przepływowa w związku z intensywnym rozwojem w ostatnich latach, stała się doskonałym narzędziem w diagnostyce i monitorowaniu przebiegu terapii w schorzeniach układu krwiotwórczego. Technika ta umożliwia opis populacji komórek na podstawie ich wielkości, ziarnistości, odsetka komórek wykazujących ekspresję powierzchniowych lub cytoplazmatycznych determinant oraz określenie poziomu ich ekspresji, na podstawie intensywności fluorescencji (8). Metodą cytometrii przepływowej można wykryć resztkowe komórki blastyczne u pacjentów, którzy pod względem morfologicznych kryteriów (<5% blastów w szpiku), wydają się być w remisji całkowitej. Na podstawie immunofenotypu ustalonego podczas rozpoznania metodą tą można rozróżnić 1 komórkę blastyczną wśród 103-104 komórkach jądrzastych szpiku (9).
Ostre białaczki limfoblastyczne B charakteryzują się występowaniem w szpiku i krwi chorego komórek z linii B, których rozwój zatrzymany został na wczesnym etapie dojrzewania. Jest to ekspansja klonu komórek i nagromadzenie się prekursorów limfocytów, które utraciły zdolność dalszego różnicowania, o fenotypie charakterystycznym dla komórek młodych, z możliwością ekspresji antygenów z innych linii różnicowania. Jednak w części przypadków OBL, zwłaszcza z prekursorowych komórek B, komórki blastyczne nie wykazują ekspresji dodatkowych antygenów nieliniowych takich jak np. markery mieloidalne, a ich immunofenotyp, pod względem jakościowym, często jest bardzo zbliżony do prawidłowych hematopoetycznych komórek progenitorowych. Limfoblasty białaczkowe, pod względem immunofenotypowym, zwłaszcza w ekspresji CD34, CD10 i TdT, przypominają prawidłowe prekursory komórek B (10, 11). Stanowi to poważną przeszkodę w oszacowaniu MRD po chemioterapii, czy we wczesnej fazie regeneracji szpiku po przeszczepie, kiedy to następuje często ekspansja prawidłowych prekursorów (odnowa szpiku). Co więcej, jak donoszą van Lochem i wsp. (12), odsetek poszczególnych subpopulacji prekursorowych komórek B, w zależności od zastosowanej terapii, może być różny. W takich przypadkach, przy użyciu standardowych metod analizy, poszukiwanie choroby resztkowej i monitorowanie leczenia jest utrudnione i niewiarygodne.
W detekcji MRD metodą immunofenotypowania, stosuje się dwie strategie: poszukiwanie na blastach białaczkowych markerów właściwych dla innych linii komórkowych – różnicowanie jakościowe (13) oraz wykorzystanie ilościowej różnicy w intensywności ekspresji antygenów liniowych, w tym poszukiwanie komórek o fenotypach asynchronicznych (równoczesne występowanie na blastach białaczkowych antygenów o sile ekspresji właściwej dla różnych stadiów dojrzewania komórki). Ilościowe różnice w ekspresji antygenów na komórkach nowotworowych w detekcji MRD, wykorzystuje cytometryczna metoda tzw. „pustych pól” (empty spaces – ES). Charakterystyczne aberrantne immunofenotypy limfoblastów, wykrywa się w niej za pomocą znakowania odpowiednimi, trój- lub czterokolorowymi, zestawami przeciwciał monoklonalnych. Podstawą wprowadzenia metody „pustych pól”, była identyfikacja immunofenotypu wszystkich subpopulacji limfoblastów B, występujących w szpiku zdrowych dawców. Poprzez barwienie trójkolorowymi zestawami przeciwciał, można wyodrębnić trzy główne populacje prawidłowych limfoblastów, różniących się ekspresją poszczególnych antygenów (14). Fenotyp aberrantny jest definiowany poprzez bezpośrednie porównanie intensywności ekspresji poszczególnych antygenów na komórkach pacjenta, z komórkami prawidłowymi. Na wykresie cytometrycznym typu dot plot, otrzymujemy obraz populacji blastów, o zmienionej intensywności świecenia. Lokuje się ona wówczas w tzw. „pustym polu”, czyli poza bramką referencyjną, w miejscu, w którym w prawidłowym szpiku komórki nie występują (14, 15). Taka porównawcza analiza, pozwala w momencie rozpoznania na stworzenie dla każdego pacjenta odpowiedniego protokołu, który następnie służy do monitorowania choroby resztkowej.
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły aspiraty szpiku kostnego 20 dorosłych pacjentów (11 kobiet i 9 mężczyzn), w przedziale wiekowym 18-67 lat (średni 41 lat) z ostrą białaczką limfoblastyczną z linii B. Badania wykonywano podczas rozpoznania choroby (u 20 chorych) oraz w kolejnych etapach leczenia: indukcji, konsolidacji i kontroli po przeszczepie szpiku (u 17 chorych). Do zdefiniowania subpopulacji limfocytów występujących w prawidłowym szpiku, posłużyły próbki szpiku 5 zdrowych dawców. Immunofenotypowanie komórek przeprowadzano metodą trójkolorowej cytometrii przepływowej (Aparat Canto – Becton Dickinson) z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromami: FITC, PE oraz PE-Cy5. Poddawano je standardowej procedurze bezpośredniego barwienia opisanej wcześniej m.in. przez Lucio i wsp. (16). Stosowano następujące zestawy przeciwciał: CD10/CD20/CD19, CD34/CD22/CD19, CD34/CD38/CD19, CD45/CD34/CD19, TdT/CD10/CD19. W poszukiwaniu fenotypów aberrantnych posługiwano się również przeciwciałami przeciwko antygenom mieloidalnym: CD13, CD15, CD33, CD65, CD66. Sprawdzano także znaczenie obecności nadekspresji antygenu CD58 na limfoblastach B, jako czynnika różnicującego je z prawidłowymi komórkami szpiku.
Akwizycję i analizę uzyskanych danych przeprowadzono przy pomocy programu FacsDiva. Każdorazowo analizowano co najmniej 10 000 komórek, przy określaniu nasilenia choroby resztkowej – 50 000 komórek. Ekspresję zastosowanych antygenów analizowano z bramki ustawionej na komórkach CD19+. Otrzymane dane o gęstości poszczególnych antygenów oraz o profilach antygenowych prawidłowych komórek CD19+, uwidocznione zostały na cytometrycznych wykresach typu dot plot. Miejsca, zajmowane przez występujące w prawidłowym szpiku komórki, wykorzystano jako bramki referencyjne. Populacje blastów pacjentów były charakteryzowane w każdym z zastosowanych zestawów przeciwciał, poprzez porównanie ich poziomu fluorescencji z obrazem otrzymanym dla komórek prawidłowych. Do monitorowania choroby resztkowej wybierano fenotypy aberrantne, występujące podczas rozpoznania, na ponad 50% komórek blastycznych CD19+. MRD przyjmowano za dodatnie, gdy w badanym materiale wykryte zostały komórki nieprawidłowe na poziomie ponad 0,1% komórek jądrzastych szpiku.
WYNIKI
Zastosowanie metody „pustych pól” w charakterystyce populacji komórek rozrostowych podczas rozpoznania choroby, pozwoliło na identyfikację aberrantnych fenotypów u 18 pacjentów z OBL-B (90%), z czego przynajmniej dwa fenotypy aberrantne wykryto u 15 pacjentów (75%).
U dwóch chorych komórki blastyczne były najbardziej zbliżone immunofenotypowo do komórek prawidłowych. Nie lokowały się one poza referencyjnymi bramkami, stąd do poszukiwania choroby resztkowej wykorzystywano głównie, wykrytą podczas diagnozy, obecność antygenów mieloidalnych. Częstości wykrywania nietypowych fenotypów blastów, w momencie rozpoznania choroby, w poszczególnych złożeniach przeciwciał, przedstawia tabela 1.
Tabela 1. Częstość występowania blastów o nietypowych fenotypach, stwierdzona w rozpoznaniu OBL-B, przy zastosowaniu poszczególnych zestawów przeciwciał.
Zestaw przeciwciał monoklonalnychIlość wykrytych fenotypów aberrantnych
CD10/CD20/CD1912/20 (60%)
CD34/CD22/CD195/20 (25%)
CD34/CD38/CD197/20 (35%)
CD45/CD34/CD198/20 (40%)
TdT/CD10/CD1911/18 (61%)

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 30 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Ciudad J., et al.: Prognostic value of immunophenotypic detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. J. Clin. Oncol., 1998; 16: 3774-81.
2. Cortes J., et al.: Persistence of periferal blood and bone marrow blasts during remission induction in adult acute lymphoblastic leukemia confers poor prognosis depending on treatment intensity. Clin. Cancer. Res., 1999; 5: 2491-7.
3. Knechtli C.J., et al.: Minimal residual disease status before allogeneic bone marrow transplatation is an important determinant of successful outcome for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia. Blood 1998; 92: 4072-9.
4. Sanchez J., et al.: Clinical value of immunological monitoring of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia after allogeneic transplantation. Br. J. Haematol .,2002; 116: 686-94.
5. Pawłowska A.B.: Detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia: technology and applications. Współczesna Onkologia 2006; 9: 178-82.
6. van Dongen J.J., et al.: Detection of minimal residual disease in acute leukemia patients. Cytokines Mol. Ther., 1996; 2: 121-33.
7. Kerst G., et al.: Concurrent detection of minimal residual disease (MRD) in childhood acute lymphoblastic leukaemia by flow cytometry and real-time PCR. Br. J. Haematol., 2005; 128: 774-82.
8. Kaczmarek A., et al.: Rola i miejsce cytometrii przepływowej w diagnostyce klinicznej. Współczesna Onkologia 2002; 6: 366-73.
9. Jennings C.D., Foon K.A.: Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood 1997; 90: 2863-85.
10. Dworzak M.N., et al.: Multiparameter phenotype mapping of normal and post-chemotherapy B lymphopoiesis in pediatric bone marrow. Leukemia 1997; 11: 1266-73.
11. van Wering E.R., et al.: Regenetrating normal B-cell precursors during and after treatment of acute lymphoblastic leukaemia: implications for monitoring of minimal residual disease. Br. J. Haematol., 2000; 110: 139-46.
12. van Lochem E.G., et al.: Regeneration pattern of precursor-B-cells in bone marrow of acute lymphoblastic leukemia patients depends on the type of preceding chemotherapy. Leukemia 2000; 14: 688-95.
13. Campana D., Coustan-Smith E.: Detection of minimal residual disease in acute leukemia by flow cytometry. Cytometry 1999; 38: 139-52.
14. Lucio P., et al.: Flow cytometric analysis of normal B cell differentiation: a frame of reference for the detection of minimal residual disease in precursor-B-ALL. Leukemia 1999; 13: 419-27.
15. Weir E.G., et al.: A limited antibody panel can distinquish B-precursor acute lymphoblastic leukemia from normal B precursors with four color flow cytometry: implications for residual disease detection. Leukemia 1999; 13: 558-67.
16. Lucio P., et al.: BIOMED-I concerted action report: flow cytometric immunophenotyping of precursor B-ALL with standarized triple-stanings. Leukemia 2001; 15: 1185-92.
17. Krampera M., et al.: Methodological approach to minimal residual disease detection by flow cytometry in adult B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2006; 91: 1109-12.
18. Cousan-Smith E., et al.: Prognostic importance of measuring early clearance of leukemic cells by flow cytometry in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: 52-8.
19. Vidriales M.B., et al.: Minimal residual disease in adolescent (older than 14 years) and adult lymphoblastic leukemias: early immunophenotypic evaluation has high clinical value. Blood 2003; 101: 4695-4700.
20. Guglielmi C., et al.: Immunophenotype of adult and childhood acute lymphoblastic leukemia: changes at first relapse and clinico-prognostic implications. Leukemia 1997; 11: 1501-07.
21. Boldt D.H., et al.: Expression of myeloid antigen by blast cell in acute lymphoblastic leukemia of adults. The South West Oncology Group experience. Leukemia 1994; 8: 2118-26.
22. Preti H.A., et al.: Myeloid markers in adult acute lymphocytic leukemia. Correlations with patient and disease characteristic and with prognosis. Cancer 1995; 76: 1564-70.
23. Carrasco M., et al.: CD66 expression in acute leukemia. Ann Hematol. 2000;79:299-303.
24. Chen J.S., et al.: Identification of novel markers for monitoring minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Blood 2001; 97: 2115-20.
25. Veltroni M., et al.: Expression of CD58 in normal, regenerating and leukemic bone marrow B cells: implications for the detection of minima residua disease in acute lymphocytic leukemia. Haematologica 2003; 88: 1245-52.
26. Lee R.V., et al.: CD58 expression decreases as nonmalignant B cells mature in bone marrow and is frequently overexpressed in adult and pediatric precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia. Am. J. Clin. Pathol., 2005; 123: 119-24.
otrzymano: 2007-01-29
zaakceptowano do druku: 2007-05-07

Adres do korespondencji:
*Jolanta Woźniak
Zakład Cytobiologii Hematologicznej
Instytut Hematologii i Transfuzjologii
ul. Indiry Gandhi 14, 02-776 Warszawa
tel. (0-22) 349-61-66, fax: (0-22) 349-64-55
e-mail: facsiht@ihit.waw.pl

Postępy Nauk Medycznych 7-8/2007
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych

Pozostałe artykuły z numeru 7-8/2007: