Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografię? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis – wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 4/2000, s. 51-56
Ewa Brojer, Barbara Żupańska
Aktualne zasady immunologicznego doboru komórek hemopoetycznych do przeszczepów
Current procedures and methods in the HLA typing for bone marrow transplantation
Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. med. L. Konopka
Summary
We present the role of HLA typing in bone marrow transplantation including the current nomenclature, the methods of typing and an interpretation of results. The procedure of searching for HLA compatible family and unrelated donor is also described.
Wstęp
Dobór w zakresie antygenów zgodności tkankowej, czyli antygenów HLA, jest zasadniczym warunkiem powodzenia transplantacji komórek hemopoetycznych. Należy jednak pamiętać, że nie jest to warunek jedyny, ponieważ przy podejmowaniu decyzji przeszczepiania komórek hemopoetycznych należy brać pod uwagę np. rozpoznanie choroby, wiek chorego, okres choroby (zaostrzenie, remisja, czas od momentu rozpoznania), współistniejące infekcje, zwłaszcza wirusowe (np. HCV), a także możliwość uzyskiwania dobrych efektów po stosowaniu innych sposobów leczenia, w tym autotransplantacji. Decyzja co do poszukiwania dawcy komórek hemopoetycznych powinna być podjęta możliwie szybko. Z przyczyn, o których będzie mowa dalej, należy wstępnie przeanalizować dostępność zgodnego w HLA dawcy rodzinnego, a także prawdopodobieństwo znalezienia dawcy niespokrewnionego. Posiadając takie informacje należy obierać strategię leczenia.
Zagadnienia wskazań do przeszczepu przekraczają ramy tego opracowania. Praca ma natomiast przybliżyć odpowiedź na istotne pytanie praktyczne: które z antygenów i przy pomocy jakich metod musimy zbadać u biorcy i u dawcy zarówno gdy rozważany jest przeszczep od dawcy rodzinnego jak i niespokrewnionego?
Odpowiedź na to pytanie nie jest prosta. Oceny porównywania stopnia doboru w zakresie HLA i efektów przeszczepiania są bowiem trudne. Muszą opierać się na dużej liczbie przypadków, które nie powinny się różnić między sobą pod względem rozpoznania, okresu choroby, wieku itp. Ponadto w poszczególnych okresach stopień doboru był (i nadal będzie) uwarunkowany praktycznymi możliwościami stosowania różnych metod oznaczania HLA (metody serologiczne – wykrywające antygeny HLA lub/i molekularne, o różnym stopniu rozdzielczości, wykrywające allele genów HLA). Wobec tego nie można sumować poszczególnych grup chorych, nawet względnie jednorodnych. Stąd liczebność grup, nawet analizowanych w programach międzynarodowych, jest mała (3, 16, 19). Dotyczy to szczególnie przeszczepów od dawców niespokrewnionych. Analiza zależności pomiędzy doborem HLA, a ostatecznym wynikiem przeszczepu komplikuje się ponadto w zależności od tego, co uważamy za pomyślny wynik – przyjęcie przeszczepu, brak ciężkiej postaci choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (ang. Graft versus Host Disease – GvHD) czy czas przeżycia chorego. Musimy pamiętać, że brak przyjęcia przeszczepu nie jest największym zagrożeniem, ponieważ przeszczep można ponowić. Natomiast reakcja GvH (zwłaszcza nie ciężkiej jej postaci), u chorych z różnymi rodzajami białaczki, może mieć korzystny wpływ z uwagi na wywoływanie efektu przeszczep przeciwko białaczce – Graft-versus Leukemia (GvL). Bez takiego efektu u chorego może nastąpić nawrót choroby, a tym samym ostateczny efekt przeszczepu nie będzie osiągnięty. Reasumując, dobór HLA, wykonany nawet najdokładniej w zakresie istniejących możliwości na obecnym stanie wiedzy, nie daje pełnej gwarancji na pomyślny efekt kliniczny. Z drugiej strony dobór „niedoskonały” niekoniecznie musi się wiązać z porażką.
Do racjonalnego podejmowania decyzji czy komórki hemopoetyczne do danego dawcy mogą/powinny być przeszczepione potrzebna jest podstawowa znajomość budowy układu HLA, różnorodności antygenów, sposobów ich dziedziczenia oraz częstości najpopularniejszych antygenów. Dla lekarza praktyka konieczna jest też podstawowa wiedza o metodach oznaczania HLA, sposobie przedstawiania i interpretacji wyników oraz aktualnej nomenklaturze. W pracy przedstawimy też schemat postępowania dla doboru dawcy do przeszczepu oraz aktualne poglądy na istotność badań antygenów poszczególnych loci układu HLA.
Układ HLA
Układ HLA jest najbardziej polimorficznym układem antygenowym człowieka (4, 6). Rozróżniamy dwie klasy antygenów: HLA I i HLA II. W obrębie każdej z nich występuje kilka wieloallelicznych układów antygenowych.
Wśród HLA klasy I istotne w transplantologii są: HLA-A, -B i -C. Liczbę antygenów i alleli w poszczególnych loci HLA I przedstawia tabela 1. Badania serologiczne pozwoliły na zdefiniowanie 24 swoistości antygenowych HLA-A, 49 swoistości HLA-B i 9 HLA-C. W tabeli 2 przedstawiono antygeny najczęściej spotykane wśród Słowian (6). Liczba opisanych alleli w każdym z wymienionych loci zwiększa się nieustannie z powodu ich poznawania przy pomocy coraz nowocześniejszych metod analizy DNA. Obecnie wynosi dla locus A 144, dla locus B – 286, a dla locus C – 80.
Wśród HLA klasy II antygeny kodowane przez trzy loci, HLA-DR, -DQ i -DP, mają znaczenie w transplantologii. Liczbę antygenów i alleli w obrębie każdego z nich przedstawia tabela 1. Metodami serologicznymi określono w ich obrębie 18 (DR); 9 (DQ) i 6 (DP) swoistości antygenowych. I tu liczba poznanych alleli definiowanych przy pomocy metod analizy DNA zwiększa się nieustannie. Opisano dotychczas 13 alleli genu DPA, 82 alleli DPB oraz 36 alleli DQB i 20 alleli DQA. Najczęściej występujące wśród Słowian (6) wymienione są w tabeli 2. Najbardziej polimorficzny jest locus HLA-DR. Mogą tu występować aż cztery funkcjonalne geny: DRB1, DRB3, DRB4 i DRB5. Pierwszy z tych genów, najbardziej polimorficzny występuje u wszystkich ludzi. Pozostałe mogą, lecz nie muszą mu towarzyszyć. Wyróżniono więc 5 haplotypów: DR51 (geny DRB1 i DRB5), DR52 (geny DRB1 i DRB3) i DR53 (geny DRB1 i DRB4) oraz haplotypy DR1 i DR8, w których występuje tylko gen DRB1.
Teoretycznie, antygen HLA kodowany przez każdy locus może występować na chromosomie z każdym innym z pozostałych loci, więc częstość wspólnego występowania poszczególnych swoistości mogłaby być obliczona z części wykrywania poszczególnych antygenów. I tak, jeśli antygen HLA-A1 występuje u 16% osób rasy kaukaskiej, a antygen HLA-B8 u 10% to odsetek osób posiadających haplotyp HLA-A1/B8 czyli takich, u których występują te dwa antygeny powinien wynieść 1,6%. Z niewiadomych przyczyn następuje nielosowe sprzężenie pewnych alleli różnych genów i co za tym idzie kombinacje pewnych antygenów są obserwowane w populacji częściej niż innych (zjawisko niezrównoważenia sprzężeń, ang. linkage disequlibrium). Wspomniany haplotyp A1/B8 występuje na przykład u około 8,8% ludzi rasy kaukaskiej. Podobnie, ścisłe sprzężenia istnieją pomiędzy swoistościami antygenów DR i DQ. Osoby o zgodnych antygenach HLA-A, -B i -DR mają więc dużą szansę być również zgodni w HLA-C i HLA-DQ. Najsilniejsze sprzężenia obserwuje się w obrębie antygenów HLA-DR gdzie określone swoistości antygenowe DR1-DR18 determinowane przez gen DRB1 występują łącznie z określonymi swoistościami DR51, DR52, DR53 determinowanymi przez pozostałe trzy geny. Znacznie częstsze występowanie pewnych haplotypów niż innych (tab. 3) ma duże implikacje praktyczne dla poszukiwania dawców do przeszczepów (6).
Biorąc pod uwagę tylko produkty genów loci HLA-A, -B i -DR liczba możliwych haplotypów wynosi ponad 2 x 1010. Z powodu tego, że częstość różnych antygenów jest różna, a dodatkowo istnieje zjawisko niezrównoważenia sprzężeń, prawdopodobieństwo znalezienia dwóch osób o zgodnych haplotypach zależy bardzo od tego jakie to są haplotypy. Dla tych chorych, u których antygeny będą występowały w „popularnych” sprzężeniach, znalezienie dawców zgodnych w HLA będzie łatwiejsze niż dla innych. Z kolei, dla niektórych chorych o rzadkich antygenach, występujących w unikalnych sprzężeniach, znalezienie zgodnego dawcy pod względem wszystkich antygenów HLA będzie praktycznie niemożliwe.
Metody oznaczania antygenów HLA
Metody serologiczne
Metody serologiczne oznaczania antygenów HLA oparte są na teście mikrolimfocytoksycznym. W teście tym przeciwciała rozpoznają glikoproteiny antygenów HLA na powierzchni limfocytów i w obecności komplementu niszczą komórki z danym antygenem. Badania te mają duże ograniczenia spowodowane dostępnością surowic diagnostycznych. Liczba rozpoznawanych swoistości antygenowych będzie zawsze mniejsza od liczby alleli dających się zróżnicować przy pomocy analizy DNA (tab. 1). Niektóre części glikoprotein HLA, ze względu na strukturę trzeciorzędową cząsteczki, nie są bowiem dostępne dla przeciwciał diagnostycznych. Ponadto często, szczególnie u chorych na nowotwory krwi, napotyka się na trudności techniczne wynikające ze zbyt małej liczby limfocytów do badań, z zaburzeń ekspresji antygenów na powierzchni limfocytów, czy z uszkadzającego wpływu leków powodującego obumarcie limfocytów, niezależnie od działania surowic diagnostycznych (11). Niezwykle ważne jest wykonanie badania u chorego w takim okresie, by do minimum ograniczyć wpływ wymienionych czynników na wynik badań. Bardzo pomocne w interpretacji wyników HLA u chorych są badania rodzinne – dlatego też nawet w przypadkach gdy rodzice chorego nie są brani pod uwagę jako dawcy szpiku należy wykonać u nich badania HLA. Czasami, nawet mimo wykonania badań rodzinnych, oznaczenia HLA trzeba kilkakrotnie powtarzać. W badaniach HLA metodami serologicznymi błąd metody wynosi aż 15 do 30% (5). Szczególnie dotyczy to oznaczenia HLA klasy II. Dlatego, dla ich oceny, techniki serologiczne zastąpione są obecnie przez metody biologii molekukarnej. Badanie technikami serologicznymi stosuje się natomiast rutynowo do oznaczania antygenów HLA klasy I.
Tabela 1. Liczba poznanyh alleli i antygenów (swoistości serologicznych) HLA (stan na rok 1999).
Gen HLALiczba alleliLiczba swoistości serologicznych
HLA-A14424
HLA-B28649
HLA-C809
HLA-DRA2-
HLA-DRB127215
HLA-DRB3201
HLA-DRB481
HLA-DRB5151
HLA-DQA120-
HLA-DQB1369
HLA-DPA113-
HLA-DPB1826
Tabela 2. Antygeny HLA najczęściej występujące wśród Słowian (6).
Liczba osób z danym antygenem wśród 1000 osób
HLA-AHLA-BHLA-DRB1HLA-DQB1
AntygenCzęstośćAntygenCzęstośćAntygenCzęstośćAntygenCzęstość
A*02291-386B*1584-136DRB1*15185BQB1*02150
A*03156-295B*0767-181DRB1*01130DQB1*03265
A*3132-113B*3537-136DRB1*13115DQB1*0445
A*1170B*4468-100DRB1*12110DQB1*05165
A*0145-90B*0822-80DRB1*07110DQB1*06275
A*6845-79B*1345-78DRB1*04100  
A*2640-45B*1540-136DRB1*0375  
A*3232B*2765-113DRB1*0845  
Tabela 3. Haplotypy HLA najczęściej wykrywane wśród osób rasy kaukaskiej w Europie Zachodniej (6).
HaplotypCzęstość wykrywania/1000
A*01, B*08 DRB1*0359
A*02, B*44 DRB1*0448
A*29, B*44 DRB1*0745
A*02, B*44 DRB1*0720
A*01, B*57 DRB1*0720
A*24, B*39 DRB1*0815
A*32, B*14 DRB1*0715
A*11, B*44 DRB1*1310
A*30, B*57 DRB1*0710
A*26, B*13 DRB1*075
Metody analizy DNA
W badaniach tych stosowana jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), dzięki której namnaża się przy użyciu swoistych primerów fragmenty DNA poszczególnych genów układu HLA. Generalnie możliwe są tu dwa sposoby wykorzystania PCR (tab. 4).
Tabela 4.
Sposób wykorzystania PCR w badaniu HLAMetoda identyfikacji alleli HLANazwa angielska
Amplifikacja badanego genu HLA w jednej reakcji PCR z primerami do części konserwatywnej genuHybrydyzacja z alleloswoistymi sondamiPCR SSO - sequence specific oligonucleotides
Analiza restrykcyjna produktu PCRPCR RFLP - amplification fragment lenght polymorphism
Sekwencjonowanie produktu PCRSBT - sequence based typing
Badanie konformacji DNAAnaliza heterodupleksówPCR FP - PCR fingerprinting
Analiza jednoniciowego DNASSCP - single-stranded conformation polymorphism
Analiza heterodupleksów z DNA wzorcowymRSCA - reference strand conformation analysis
Wykonanie wielu reakcji PCR dla badań każdego genu HLAAmplifikacja DNA z primerami swoistymi dla alleliSSP - sequence specific primers

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 30 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Argüello J.R. et al.: Tissue Antigens 1998, 52:57-66.
2. Argüello J.R. et al.: Nature Genetics 1998, 18:192-194.
3. Barnado M.C. et al.: Transplantation 1996, 61:1420-1423.
4. Bodmer J.G. et al.: Tissue Antigens 1997, 49:297-321.
5. Carpenter C.B.: Tissue Antigens 1997, 50:322.
6. Charron D.: HLA genetic diversity of HLA. EDK, Paris, 1997.
7. Clay T.M. et al.: Eur. J. Immunogenet. 1995, 22:467-478.
8. Cros P. et al.: Tissue Antigens 1994, 45:153-147.
9. Holmberg et al.: Tissue Antigens 1998, 51:587.
10. Knapp L.A. et al.: Tissue Antigens 1997, 50:170-177.
11. Medeiro et al.: Am. J. Pathol. 1993, 143:1086.
12. Mickelson E.M. et al.: Tissue Antigens 1996, 47:27-36.
13. Morrison A.E. et al.: Transfusion Medicine, 1998, 8:215-220.
14. Olerup O., Zetterquist H.: Tissue Antigens 1992, 39:225-235.
15. Oudshoorn et al.: Bone Marrow-Transplant 1997, 20:10011-7.
16. Petersdorf E.W. et al.: Blood, 1995,86:1606-1613.
17. Pursall M.C. et al.: Eur. J. Immunogenet. 1996, 23:192-194.
18. Rozemuller E.H., Tilanus M.G.J.: Hum. Immunol. 1996, 46:27-34.
19. Sasazuki T. et al.: N. Engl. J. Med. 1998, 339:1177-1185.
20. Tiercy J.M. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:7121-7125.
Postępy Nauk Medycznych 4/2000
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych