Zmiany natężenia apoptozy limfocytów u chorych poddanych zabiegom pomostowania naczyń wieńcowych

Apoptoza jest złożonym, zaprogramowanym i biochemicznie kontrolowanym procesem samozniszczenia komórki. Rozwija się ona najczęściej na skutek uszkodzenia lub zaburzenia funkcji komórki, które może być efektem działania zarówno czynnika zewnętrznego jak i wewnętrznego. Charakterystyczną cechą apoptozy są zmiany biochemiczne i ultrastrukturalne. Należy do nich m.in. spadek potencjału elektrochemicznego pomiędzy błonami mitochondrialnymi, który uważany jest za jeden z pierwszych i zarazem nieodwracalnych wskaźników apoptozy [1, 2].

Mitochondria są organellami odpowiedzialnymi za procesy oddechowe. Są one zbudowane z matrycy mitochondrialnej (matrix) otoczonej wewnętrzną błoną mitochondrialną oraz przestrzeni międzybłonowej, którą od cytoplazmy oddziela zewnętrzna błona mitochondrialna. Istotnymi składnikami wewnętrznej błony mitochondrialnej są: syntetaza ATP, translokator adenozyny oraz kanały elektronowe. Składniki te w warunkach fizjologicznych utrzymują elektrochemiczny gradient napięć, którego nagłe zaburzenia mogą prowadzić do samozniszczenia komórki. Podobny gradient występuje również na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, za który są kolei odpowiedzialne liczne napięciowo zależne kanały anionowe. Ważną rolę w patomechanizmie apoptozy odgrywa również przestrzeń międzybłonowa, której zawartość stanowią: cytochrom c, prokaspaza, kinaza adenylowa 2 oraz czynnik indukujący apoptozę [1]. Zaburzenia przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej sprzyjają uwolnieniu wymienionych substancji, szczególnie cytochromu c do cytozolu mitochondrium, rozpoczynając proces apoptozy komórki [1, 2]. Proces ten nie jest do końca poznany, zwłaszcza w przypadkach, gdy jest on skutkiem złożonych procedur do jakich można zaliczyć krążenie pozaustrojowe.

Celem pracy była ocena stopnia natężenia apoptozy limfocytów, mierzonego zmianami ich przezbłonowego potencjału mitochondrialnego u chorych poddanych zabiegom pomostowania naczyń wieńcowych w krążeniu pozaustrojowym.

Po uzyskaniu zgody Komisji Bioetyki przy AM w Lublinie oraz świadomej zgody chorych, do badań zakwalifikowano osoby poddane chirurgicznej rewaskularyzacji mięśnia sercowego w krążeniu pozaustrojowym z powodu stabilnej choroby wieńcowej stopnia I lub II wg skali CCS ( Canadian Cardiovascular Society). Z badań wykluczono chorych leczonych w przeszłości z powodów endokrynologicznych, neurologicznych oraz poddanych zabiegom resuscytacyjnym z uwagi na zatrzymanie krążenia. Do badań nie zostały również włączone osoby podające w wywiadzie choroby o podłożu alergicznym.

W przeddzień operacji wieczorem badani otrzymywali doustnie 2 mg lorazepamu oraz domięśniowo 50 mg prometazyny. Jedną godzinę przed rozpoczęciem anestezji wszyscy chorzy otrzymywali doustnie 3 mg lorazepamu i domięśniowo 0,1 mg kg^-1 morfiny. U wszystkich zastosowano znieczulenie ogólne z użyciem fentanylu w dawce 0,01-0,02 mg kg^-1, midazolamu 0,05-0,1 mg kg^-1, oraz etomidatu w dawce 0,1-0,5 mg kg^-1, zaś zwiotczenie mięśniowe uzyskiwano przy pomocy pankuronium 0,08-0,1 mg kg^-1. Znieczulenie podtrzymywano ciągłym dożylnym wlewem fentanylu i midazolamu oraz frakcjonowanymi dawkami izofluranu podawanego drogą wziewną w stężeniu 0,5-1%. W trakcie znieczulenia i operacji stosowano mechaniczną wentylację płuc w trybie IPPV mieszaniną tlenu i powietrza w stosunku 1:1, pod kontrolą ustalonych parametrów wentylacyjnych: V_T – 10 ml kg^-1, f – 9 min^-1, ciśnienia szczytowego wdechu – 18 mm Hg (2,4 kPa). W trakcie wszczepiania pomostów aortalno-wieńcowych krążenie i wentylację podtrzymywano przy pomocy aparatu płuco-serce S III (firmy Stöckert, USA). Do pierwotnego wypełnienia pompy (priming) zastosowano: roztwór Ringera – 1000 ml, 6% roztwór hydroksyetylowanej skrobi – 500 ml, 20% mannitol – 250 ml, wodorowęglan sodowy – 20 ml oraz heparynę w dawce 75 mg. Kardiopleginę przygotowywano na bazie 0,9% roztworu soli kuchennej uzupełnionego 3 g chlorku potasu i 20 ml wodorowęglanu sodowego.

Badania przeprowadzano w siedmiu etapach procedury: 1) po kaniulacji tętnicy promieniowej przed rozpoczęciem znieczulenia i operacji (wartości wyjściowe), 2) w trakcie najgłębszej hipotermii, 3) po zakończonej operacji przed przewiezieniem chorego do OIOP, 4) wieczorem w zerowej dobie pooperacyjnej (12 h po rozpoczęciu operacji), 5) rano w pierwszej dobie pooperacyjnej (24 h po rozpoczęciu operacji), 6) wieczorem w pierwszej dobie pooperacyjnej (36 h po rozpoczęciu operacji) oraz 7) rano w drugiej dobie pooperacyjnej (48 h po rozpoczęciu operacji).

Krew do badań pobierano z tętnicy promieniowej, wirowano a wyizolowane komórki inkubowano z CMXRos w temperaturze 37°C przez 15 min. Analizy przezbłonowego potencjału mitochondrialnego limfocytów dokonywano przy pomocy chlorometyl-X-rosaminy CMXRos (Mito Tracker Red CMXRos, Molecuar Probes) i przeciwciała monoklonalnego przeciw glikoforynie A, sprzężonego z izotiocyjaninem fluoresceiny (FITC – Dako, Dania). Uzyskany materiał oceniano w cytometrze przepływowym.

Wyniki poddano obliczeniom statystycznym przy użyciu testu Wilcoxona przyjmując za istotne p<0,05.

Badaniami objęto 20 mężczyzn w wieku od 53 do 70 lat (61,1±6,9). Szesnastu chorych przebyło zawał mięśnia sercowego w okresie 3 lat poprzedzających zabieg zaś osiemnastu było leczonych z powodu nadciśnienia tętniczego I° lub II° według skali WHO.

Średni czas operacji wynosił 205±35 min, a znieczulenia 235±30 min. U wszystkich badanych aortę zaciskano w sposób typowy, zaś średni czas zamknięcia aorty wynosił 45,1±15,5 min. Zespolenia aortalno-wieńcowe wykonywano w łagodnej hipotermii – 34,5±0,4°C. U wszystkich chorych odłączenie od aparatu płuco-serca odbyło się bez powikłań, jak również nie zachodziła konieczność stosowania kontrapulsacji wewnątrzaortalnej.

W badanej grupie sześciu chorych nie wymagało farmakologicznego wspomagania układu krążenia, siedmiu otrzymało wlew dopaminy w dawkach zależnych od stanu klinicznego (7,3±3,8 mg kg^-1 min^-1), zaś u siedmiu stosowano dobutaminę (5,7±2,5 mg kg^-1 min^-1). U wszystkich badanych przebieg pooperacyjny był niepowikłany.

Procedura krążenia pozaustrojowego powodowała systematyczny wzrost apoptozy limfocytów, który utrzymywał się przez cały okres obserwacji. Najwyższe jej wartości notowano wieczorem po zakończonym zabiegu – w 4 etapie, po czym występował jej spadek (etap 5) a następnie ponowny wzrost w 6 i 7 etapie badań (ryc. 1).

Proces samozagłady komórek nie jest do końca jednoznacznie określony i chociaż wiadomo, że pełni on znamienną rolę w utrzymywaniu homeostazy ustroju, to jednak jego przyczyny i patomechanizm są nadal tematem wielu badań klinicznych [3, 4, 5, 6, 7]. Złożony charakter procedury krążenia pozaustrojowego, jak również stosowana nierzadko śród- i pooperacyjnie agresywna terapia zaburzeń hemodynamicznych nasilają apoptozę komórek, co może powodować rozwój niewydolności narządowej [3]. Nie bez wpływu na omawianą patologię mają też stosowane podczas znieczulenia halogenowe środki wziewne, opioidy czy też niedepolaryzujące środki zwiotczające [4, 5].

Anestezja z zastosowaniem N₂O oraz izofluranu redukuje liczbę limfocytów do 60-70% wartości wyjściowych w pierwszej i czwartej dobie pooperacyjnej, co jest wynikiem nasilonego procesu samozniszczenia tych komórek, którego szczyt przypada na 2 i 24 h pooperacyjną [4]. Porównanie działania izofluranu i sewofluranu na wspomniany proces u zdrowych ochotników wykazuje istotny wzrost apoptozy limfocytów podczas stosowania obu anestetyków, przy czym większe jego nasilenie notowane jest w grupie izofluranowej [5]. Stwierdzana różnica może wynikać z różnego współczynnika krew-gaz stosowanych środków, co może mieć wpływ na aktywność kaspazy 3 i 7 – enzymu odpowiedzialnego za limfotoksyczność omawianych anestetyków [5]. Nasilenie tych zmian występuje w 12 i 24 h po ekspozycji, co mogłoby częściowo tłumaczyć notowany w badaniach własnych dwufazowy charakter apoptozy limfocytów.

Trudno jednak jednoznacznie stwierdzić, że obserwowana w badaniach własnych patologia była wynikiem działania samego izofluranu, gdyż zdaniem niektórych autorów proces ten można wiązać też ze stosowaniem fentanylu. Badając wpływ tego opioidu na apoptozę limfocytów stwierdzono bowiem, że już w stężeniu terapeutycznym powoduje on wzrost apoptozy, której największe nasilenie występuje po 2 oraz 24 h [6, 7] ekspozycji. Godną podkreślenia wydaje się przy tym istotna zależność pomiędzy nasileniem apoptozy limfocytów a częstością uogólnionych procesów zapalnych [3]. Można zatem przyjąć, że zastosowanie w badaniach własnych zarówno dużych dawek fentanylu, jak również izofluranu predysponuje do samozagłady limfocytów, co z kolei prowadzi do spadku odporności chorych po zabiegach z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego, aczkolwiek dokładne określenie tych zależności nie jest jednoznacznie wyjaśnione.

Na proces apoptozy limfocytów we krwi chorych po zabiegach pomostowania naczyń wieńcowych mają też wpływ aminy katecholowe oraz leki o dodatnim działaniu inotropowym. Przyjmuje się, że zarówno stres operacyjny jak i nadmierny wysiłek fizyczny pobudzają układ immunologiczny prowadząc w efekcie końcowym do przemijającej limfocytopenii, której nasilenie istotnie zależy od intensywności wysiłku fizycznego [8, 9]. Potwierdzeniem tego wydają się być obserwacje natężenia apoptozy limfocytów we krwi obwodowej u 20 zdrowych ochotników po różnego stopnia wysiłku fizycznym, podczas którego zanotowano wzrost omawianego zjawiska, pomimo że żaden badany nie był narażony na inne szkodliwe czynniki zewnętrzne [10]. Istotny wpływ na stopień apoptozy ma natężenie wysiłku fizycznego, a co za tym idzie, wielkość odpowiedzi hormonalnej [11, 12]. Analizując proces apoptozy w odpowiedzi na wysiłek fizyczny stwierdzono, że 63% populacji zdrowych limfocytów ulega samozagładzie w bezpośrednim okresie powysiłkowym, zaś największe jej nasilenie występuje po 24 h, kiedy to aż 86% limfocytów wykazuje zmiany apoptotyczne [12]. Proces ten ściśle zależy od stężenia glikokortykosteroidów we krwi, aczkolwiek podkreśla się też istotny wpływ wysokich stężeń amin katecholowych na omawianą patologię [11, 13, 14]. Szczególnie istotne wydaje się przy tym nie tylko samo stężenie katecholamin we krwi, lecz również stopień pobudzenia ich receptorów na limfocytach [13, 15]. Według niektórych, właśnie przez pobudzenie receptorów katecholaminowych dochodzi do wszczęcia apoptozy, której nasilenie nie zależy od glikokortykosteroidów [15]. Potwierdzeniem tego wydaje się być także istotne ograniczenie procesu samozagłady limfocytów po podaniu leków blokujących receptory b [13, 16]. Efekt ten obserwuje się zarówno podczas substytucji amin katecholowych jak i innych środków o wpływie inotropowo dodatnim [13, 16]. Wyjątkowo niekorzystnie działa dopamina, bowiem zapoczatkowany przez nią proces samozniszczenia limfocytów nie jest hamowany, jak w przypadkach adrenaliny czy dobutaminy, przez leki b-adrenolityczne [13, 14, 16]. Można zatem uważać, że zastosowanie w badaniach własnych wlewu dopaminy lub dobutaminy nasiliło proces apoptozy limfocytów krwi, jednakże dokładna ocena wpływu obu wspomnianych środków na omawiany proces nie jest możliwa.

Nie ustalono dotąd, w jakim stopniu szybkie rozcieńczenie krwi podczas procedury krążenia pozaustrojowego wpływa na wewnątrzkomórkową równowagę elektrolitową oraz zaburza funkcję pompy sodowo-potasowej komórki. Istotne znaczenie mogą mieć nagłe zmiany stężenia wapnia, magnezu, potasu i chloru we krwi – pierwiastków mających kluczowe znaczenie w procesie apoptozy [17, 18]. Już samo rozpoczęcie krążenia pozaustrojowego może powodować spadek stężenia magnezu we krwi nawet o 17,3%, który w nieleczonych przypadkach utrzymuje się przez pierwsze 24 h [19]. Powstała w ten sposób hipomagnezemia zaburza pracę pompy sodowo-potasowej a także upośledza funkcjonowanie ATP-azy, prowadząc do spadku wewnątrzkomórkowego stężenia potasu i chloru oraz wzrostu stężenia wapnia [17, 18]. To z kolei prowadzi do normotonicznego spadku objętości komórki, co inicjuje proces jej samozniszczenia [18]. Nie ustalono dotąd, w jakim stopniu normowolemiczne rozcieńczenie krwi wpływa na homeostazę wewnątrzkomórkową rozpoczynając proces apoptozy. Stwierdzono wprawdzie, że jej natężenie istotnie koreluje ze stopniem rozcieńczenia krwi, lecz nie określono dokładnego patomechanizmu zaburzeń [20]. Można jednak przypuszczać, że rozcieńczenie krwi przyczynia się do zmiany osmolalności cytozolu, co zapoczątkowuje proces samozniszczenia komórki [17].

Niewyjaśniony jest obserwowany w badaniach własnych dwufazowy charakter apoptozy limfocytów. Zjawisko to może być wynikiem zarówno krążenia pozaustrojowego, stosowanego w znieczuleniu, jak również pooperacyjnego leczenia [4, 5, 6, 7, 13, 14, 16]. Zdaniem innych jest ono także efektem interakcji pomiędzy komórkami apoptotycznymi i zdrowymi oraz wewnątrzkomórkową odpowiedzią hydrodynamiczną na stres [21]. Trudno jest jednak, na podstawie badań własnych, określić patomechanizm dwufazowego charakteru apoptozy. Brak udokumentowania zjawiska w piśmiennictwie sprawia, że problem ten wymaga dodatkowych, wnikliwych analiz procesu samozagłady komórek podczas zabiegów z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego.

1. Zabiegi chirurgicznego pomostowania naczyń wieńcowych z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego powodują wzrost apoptozy limfocytów krwi leczonych chorych.

2. Apoptoza limfocytów krwi ma charakter dwufazowy, a najwyższe jej wartości obserwuje się po zabiegu oraz wieczorem w pierwszej dobie pooperacyjnej.