Wydawnictwo Medyczne Borgis
Czytelnia Medyczna » Postępy Nauk Medycznych » 4/2005 » Wczesne wykrywanie zajęcia ośrodkowego układu nerwowego u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną badaniem płynu mózgowo-rdzeniowego metodą PCR
- reklama -
Profesjonalny, stricte ręczny serwis narciarski Warszawa


- reklama -
Pobierz odtwarzacz Adobe Flash Player
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 4/2005, s. 3-6
Agnieszka Wypych1, Jadwiga Kulik2, Janusz Siedlecki2, Michał Matysiak1

Wczesne wykrywanie zajęcia ośrodkowego układu nerwowego u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną badaniem płynu mózgowo-rdzeniowego metodą PCR

Early detection of central nervous system involvement in children with acute lymphoblastic leukemia by cerebrospinal fluid examination using PCR technique
1 Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii AM w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Michał Matysiak
2 Zakład Biologii Molekularnej Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. biol. Janusz Siedlecki
Streszczenie
>Wstęp. Białaczki stanowią 30% chorób nowotworowych wieku dziecięcego. Najczęstszą postacią białaczki, występującą u dzieci w 80-85%, jest ostra białaczka limfoblastyczna (ALL).
W komórkach blastów dochodzi do rearanżacji genów dla łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin w B-ALL i receptora antygenowego limfocytów T w T-ALL. Jedną z technik biologii molekularnej stosowaną do badania przegrupowań w obrębie genów dla łańcuchów ciężkich (IgH) i lekkich immunoglobulin oraz receptora antygenowego limfocytów T (TCR) jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).
Materiały i metody. Badaniami objęto 50 dzieci hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii Akademii Medycznej w Warszawie w latach 1998-2002. Ocena zajęcia ośrodkowego układu nerwowego przez proces nowotworowy przeprowadzona była w oparciu o badanie płynu mózgowo-rdzeniowego metodą PCR na obecność rearanżacji genów IgH i TCRd.
Wyniki. Przed rozpoczęciem leczenia białaczki, obecność badanych przegrupowań wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym u 18 pacjentów (36% badanej grupy). W grupie tej, aż u 16 z nich utrzymywały się one przez cały okres chemioterapii, a także po jej zakończeniu.
Spośród 18 pacjentów, u których w chwili rozpoznania I rzutu białaczki wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym obecność badanej rearanżacji, wznowa z OUN wystąpiła u 4 dzieci. Dwoje z nich miało izolowaną wznowę w obrębie OUN i zmarło w trakcie leczenia. Pozostali dwaj pacjenci rozwinęli wczesną wznowę mieszaną – szpik + OUN. U nich udało się osiagnąć remisję i żyją oni nadal.
Wnioski. 1. Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego metodą PCR pozwala na wykrycie komórek nowotworowych w OUN. 2. Monitorowanie obecności rearanżacji badanych genów pozwala na wyodrębnienie grupy pacjentów narażonych na wystąpienie nawrotu białaczki zlokalizowanej w OUN. 3. Nawrót białaczki w obrębie OUN występuje jedynie wśród dzieci, u których stwierdzono obecność komórek nowotworowych badaniem PCR w pierwszym rzucie choroby.
Summary
Introduction. 30% children neoplastic dideases are leukemias. The most frequent (80-85%) type of children leukemia is acute lymphoblastic leukemia (ALL).
Gene rearrangements come into effect in blasts cells for heavy and light immunoglobulin chains in B-ALL and T lymphocytes antigenic receptor in T-ALL. One of molecular biology technology applied to analyse gene region regrouping for heavy (IgH) and light immunoglobulin chains and T lymphocytes antigenic receptor (TCR) is polymerase chain reaction (PCR).
Materials and methods. 50 children hospitalised in Pediatric Hematology/Oncology Clinic of Medical University of Warsaw were examined in years 1998-2002. Assesment of central nervous system involvement by neoplastic progress was based on cerebrospinal fluid examination using PCR, whitch detected IgH and TCRd genes rearrangements.
Results. 18 patients (i.e. 36% of examined group) had the genes rearrangements detected in cerebrospinal fluid just before start of leukemia treatment. As much as 16 people from the group had genes rearrangements existed during chemotherapy and after. Leukemia relapse in central nervous system followed in 4 children from among 18, which had primary leukemia diagnosed and presence of gene rearranged in cerebrospinal fluid detected. Two of them had isolated relapse in central nervous system and have died during treatment. Early mixed relapse (bone marrow + central nervous system) were observed in two remained. Remission were achieved and the two is still alive.
Conclusions. 1. Cerebrospinal fluid examination using PCR can detect neoplastic cells in central nervous system.
2. Gene rearrangements monitoring allow to separate groups of patients exposed to leukemia relapse in central nervous system. 3. Leukemia relapse in central nervous system appears in children when neoplastic cells are detected by PCR during primary leukemia diagnosed.
Polecane książki z księgarni medycznej udoktora.pl:
Skazy krwotoczne, Windyga Jerzy
Skazy krwotoczne
Histologia, Sawicki Wojciech
Histologia
Choroby krwi, Matysiak Michał
Choroby krwi
WSTĘP
Najczęstszą postacią białaczki u dzieci jest w 80-85% ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) (10). Istotą tego procesu nowotworowego jest klonalny rozrost limfoidalnych komórek prekursorowych linii B lub T. Dzięki rozwojowi technik biologii molekularnej możliwe było poznanie charakterystycznych zmian w genotypie komórek białaczkowych, i tak: w ALL wywodzącej się z limfocytów T w ponad 90% przypadków występuje kompletne przegrupowanie TCRg, a w około 70% przegrupowanie TCRb, rzadziej, bo tylko w 55-60% obserwuje się kompletne przegrupowanie TCRd i TCRa. W ALL z linii B przegrupowania genów TCR kształtują się następująco: dla TCRd 70%, TCRa 30-59%, TCRg 40-70%, TCRb 31-35%. W 50% przypadków białaczki pre-B-ALL i aż w 90% przypadków B-ALL występują kompletne przegrupowania IgH (3, 9, 11).
Poprzez analizę przegrupowań genów TCR i IgH można określić tzw. molekularny obraz ( fingerprint) charakterystyczny dla każdego pacjenta. Molekularny obraz pozwala w przypadku ALL na ocenę stopnia zaawansowania procesu nowotworowego przez określenie ewentualnego naciekania poszczególnych narządów np. OUN.
Odrębnym problemem badawczym, niezwykle istotnym z punktu widzenia pacjenta, jest poszukiwanie przetrwałych po leczeniu komórek nowotworowych. Dzięki badaniom przegrupowań genów IgH i TCR wiadomo, iż prawie we wszystkich przypadkach nawrotów choroby ich bezpośrednią przyczyną jest proliferacja przetrwałego, oryginalnego klonu białaczkowego. Wykrycie nawet najmniejszej liczby komórek nowotworowych ( minimal residual disease – MRD) może sugerować pojawienie się nawrotu choroby. Najczulszą metodą wykrywania MRD jest obecnie łańcuchowa reakcja polimerazy – PCR, polegająca na amplifikacji określonych sekwencji DNA. Metoda ta znalazła swoje miejsce w standardowym postępowaniu klinicznym u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną.
Wydaje się, że za sprawą czułości omawianej metody, która pozwala wykryć jedną nieprawidłową komórkę na milion prawidłowych, a także dzięki temu, iż w przypadku ALL rozrost nowotworowy jest rozrostem monoklonalnym, PCR może znaleźć zastosowanie także w wykrywaniu komórek białaczkowych w obrębie OUN (1, 4, 5, 9, 13).
MATERIAŁ I METODY
Badaniami objęto 50 dzieci hospitalizowanych w Katedrze i Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii Akademii Medycznej w Warszawie w latach 1998-2002. Grupę tę stanowiło 45 dzieci leczonych z powodu pierwszego rzutu ALL oraz pięcioro dzieci, u których w trakcie leczenia wystąpiła wznowa białaczki. Płyn mózgowo-rdzeniowy pobierano od każdego pacjenta przynajmniej czterokrotnie: przed rozpoczęciem leczenia, dwa razy w trakcie chemioterapii oraz podczas ostatniego nakłucia przewidzianego w protokole leczenia. Do izoloacji DNA stosowano zamiennie jedną z trzech metod: uwalnianie metodą gorącą (4), przy użyciu Tweenu i współwytrącanie z poliakrylamidem. Pierwsza z nich została zaczerpnięta z piśmiennictwa, pozostałe opracowano samodzielnie. W celu potwierdzenia obecności materiału genetycznego wykonywano pojedynczą reakcję PCR ze starterami GAPDH1 i GAPDH2 amplifikującymi gen markerowy.
Ocenę zajęcia OUN przez proces nowotworowy przeprowadzono w oparciu o badanie płynu mózgowo-rdzeniowego metodą dwustopniowej reakcji PCR z użyciem starterów dla genów IgH i TCRd. Mieszanina reakcyjna PCR o objętości końcowej 25 ml zawierała: 5 ml DNA, 0,3 ml każdego ze starterów o stężeniu 0,1 mg/mml, 4 ml 1,25 mM dNTP, 2,15 ml 25 mM chłorku magnezu, 2,5 ml buforu do PCR, 0,15 ml polimerazy DNA JumpStart i wodę dejonizowaną. Reakcję przeprowadzano w automatycznym aparacie do PCR firmy PerkinElmer. W każdym przeprowadzonym badaniu wykonywano również próbę ujemną, poddając reakcji PCR DNA wyizolowane z krwi obwodowej osób zdrowych i/lub łożyska. Kontrolowano również czystość samej mieszaniny reakcyjnej bez dodatku materiału genetycznego.
Obecność przegrupowań genów IgH i TCRd badano przeprowadzając dwustopniową reakcję PCR: pierwsza ze starterami FR3A i LJH dla łańcuchów ciężkich immunoglobulin oraz Vd2 i Dr3 dla łańcucha TCRd; do drugiej reakcji używano 1 ml produktu pierwszej reakcji i stosowano następujące pary starterów: Fr3A i VLJH oraz Vd2 i Dr3. Warunki obydwu amplifikacji były identyczne: wstępna denaturacja przez 7 minut w temperaturze 94°C, następnie 30 cykli: 30 sekundowa denaturacja w temperaturze 94°C, 30 sekundowe równoważenie starterów w temperaturze 55°C i 30 sekundowe wydłużanie w temperaturze 72°C. Uzyskany produkt reakcji poddawano elektroforezie w 3% żelu agarozowym, oglądano w świetle UV i wykonywano dokumentację fotograficzną badań.
WYNIKI
Celem wykrycia komórek białaczkowych w płynie mózgowo-rdzeniowym wykonywano badanie PCR z użyciem starterów dla genów IgH i TCRd. Badanie przeprowadzono w 50 przypadkach ostrej białaczki limfoblastycznej przynajmniej czterokrotnie na różnych etapach procesu chorobowego. O dodatnim wyniku badania świadczyła obecność prążka wielkości 90-120 bp będącego odzwierciedleniem zamplifikowanego przegrupowania VDJ. Przed rozpoczęciem leczenia białaczki, obecność badanych rearanżacji wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym u 18 pacjentów (36% badanej grupy).
Wśród 18 dzieci, u których stwierdzono obecność rearanżacji genów dla łańcuchów ciężkich immunoglobulin i receptora limfocytów T było 14 pacjentów z C-ALL (77,7% wyników dodatnich), 2 pacjentów z T-ALL (11,1%) i 2 pacjentów z pre-B-ALL (11,1%).
Nie u wszystkich dzieci amplifikacja fragmentu CDR-III łańcucha ciężkiego immunoglobulin pokrywała się z jednocześnie występującą amplifikacją genu TCRd. Amplifikację genu IgH stwierdzono u 17 (34%) pacjentów, genu TCRd u 15 (30%). Nie stwierdzono rearanżacji o charakterze biklonalnym czy też oligoklonalnym.
Z DNA wyizolowanego z prawidłowego szpiku kostnego lub łożyska nie uzyskano produktu amplifikacji segmentów genu IgH oraz TCRd, co wskazuje na poliklonalny charakter przegrupowań występujących u osób zdrowych.
Wykrycie rearanżacji genów dla łańcuchów ciężkich immunoglobulin i receptora limfocytów T w chwili rozpoznania białaczki, świadczące o obecności komórek białaczkowych w płynie mózgowo-rdzeniowym było zarazem bodźcem do kontynuowania badań. Postanowiono stwierdzić czy rearanżacje te będą obecne zarówno na dalszych etapach leczenia chemicznego jak i po jego zakończeniu. Tym samym podjęto się próby wykorzystania tej metody do oceny zajęcia OUN przez proces białaczkowy.
Badania PCR wykonywano na poszczególnych etapach leczenia, u pacjentów z dodatnim jak i ujemnym wyjściowo wynikiem.
W grupie 18 dzieci, u których w chwili rozpoznania ALL stwierdzono obecność badanych rearanżacji, aż u 16 z nich utrzymywały się one przez cały okres chemioterapii, a także po jej zakończeniu. Jedynie dwóm pacjentom udało się w trakcie chemioterapii wyeliminować opisane rearanżacje. Miało to miejsce w trakcie II części chemioterapii (protokół M programu BFM 90 II). Eliminacja ta była na tyle trwała, iż również po zakończeniu leczenia nie stwierdzono u nich obecności komórek nowotworowych w OUN, o czym świadczył brak oznaczanych rearanżacji.
U żadnego z 27 pacjentów z wyjściowo ujemnym wynikiem PCR, nie stwierdzono pojawienia się rearanżacji (obecności komórek białaczkowych) w trakcie leczenia chemicznego ani też po jego zakończeniu.
W celu oceny przydatności badania rearanżacji dla genów IgH i TCRd w płynie mózgowo-rdzeniowym jako czynnika obciążającego rokowanie dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną, zestawiono jego wyniki na poszczególnych etapach leczenia z dalszymi losami pacjenta. Chodziło o odpowiedź na pytanie czy wznowa białaczki w OUN występuje jedynie u dzieci, u których uprzednio stwierdzano dodatni wynik badania rearanżacji dla IgH i TCRd.
Spośród 18 pacjentów, u których w chwili rozpoznania I rzutu białaczki wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym obecność badanej rearanżacji, wznowa z OUN wystąpiła u 4 dzieci. Dwoje z nich miało izolowaną wznowę w obrębie OUN i zmarło w trakcie leczenia. Pozostali dwaj pacjenci rozwinęli wczesną wznowę mieszaną – szpik + OUN. U nich udało się osiagnąć remisję i żyją oni nadal. Rycina 1 przedstawia podział i dalsze losy dzieci objętych badaniem.
Ryc. 1. Losy pacjentów objętych badaniem.
Na wstępie podkreślono, iż badania rearanżacji wykonane zostały w 50 przypadkach grupujących 45 dzieci z I rzutem ALL i 5 dzieci ze wznową ALL. W tej 5 osobowej grupie stwierdzono 2 wznowy w OUN, 2 wznowy mieszane (szpik + OUN) oraz 1 wznowę szpikową.
Na podkreślenie zasługuje fakt, iż wznowy mieszane lub izolowane w OUN wystapiły jedynie u dzieci z dodatnim na poczatku leczenia wynikiem badania rearanżacji dla IgH i TCRd w płynie mózgowo-rdzeniowym. Dziecko z izolowaną wznową szpikową prezentowało w I rzucie ujemny wynik badania PCR.
WNIOSKI
1. Badanie płynu mózgowo-rdzeniowego metodą PCR pozwala na wykrycie komórek nowotworowych w OUN.
2. Monitorowanie obecności rearanżacji badanych genów pozwala na wyodrębnienie grupy pacjentów narażonych na wystąpienie nawrotu białaczki zlokalizowanej w OUN.
3. Nawrót białaczki w obrębie OUN występuje jedynie wśród dzieci, u których stwierdzono obecność komórek nowotworowych badaniem PCR w pierwszym rzucie choroby.
DYSKUSJA
Zajęcie OUN przez proces białaczkowy jest czynnikiem wpływajacym w istotny sposób na rokowanie pacjentów. Pomimo wdrożenia rozbudowanej diagnostyki (rezonans magnetyczny, tomografia komputerowa, EEG, ocena dna oka i stanu neurologicznego pacjenta, ocena cytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym) i szeroko stosowanej w protokołach leczniczych profilaktyki OUN polegajacej na dokanałowym podawaniu cytostatyków, a w grupach wysokiego ryzyka dodatkowo napromieniania OUN, odsetek wznów białaczki zlokalizowanych w OUN jest nadal wysoki. Wznowa w tej lokalizacji występuje u 5-10% pacjentów, u których w pierwszym rzucie białaczki nie stwierdzano zmian w OUN i aż u 25-30% dzieci z naciekami białaczkowymi w pierwszym rzucie choroby (8). W związku z tym wciąż poszukuje się nowych metod wczesnej diagnostyki zajęcia przez proces białaczkowy ośrodkowego układu nerwowego.
Rozwój technik biologii molekularnej, jaki obserwowany jest w ostatnich latach sprawił, iż wzrosły nadzieje na wykrycie rozrostu nowotworowego we wczesnych etapach – PCR pozwala na wykrycie pojedynczej komórki o poszukiwanym genotypie na 106 komórek prawidłowych. W piśmiennictwie opisywane są próby badania płynu mózgowo-rdzeniowego metodą PCR w celu wykrycia wykrycia rearanżacji dla genów łańcuchów ciężkich immunoglobulin i receptora limfocytów T, liczba tych prac jest jednak niewielka (4, 5, 12). Tłumaczy się to przede wszystkim specyfiką materiału genetycznego, jakim jest płyn mózgowo-rdzeniowy. Jest to bowiem materiał bardzo ubogokomórkowy, co oznacza duże trudności w otrzymaniu wystarczajacej ilości materiału genetycznego, nawet do tak czułego badania, jakim jest PCR.
Przedstawione w tej pracy wyniki badań wykazały obecność poszukiwanych przegrupowań na początku leczenia aż u 36% badanych pacjentów. Pozostaje to w sprzeczności z dostępnymi danymi epidemiologicznymi, z drugiej strony uzyskane wyniki znajdują pełne potwierdzenie w pracach D. Januszkiewicz (4, 5), X. Li (7) czy też B. Shiramizu (12). Na przykład D. Januszkiewicz badając 11 dzieci z pierwszym rzutem ALL stwierdziła obecność rearanżacji, rozumianych jako wstępne zajęcie OUN, aż u 42% pacjentów (4). Istnieje więc bardzo duża dysproporcja pomiędzy odsetkiem dodatnich wyników PCR, a mniejszą ilością rozpoznawanych wznów ALL zlokalizowanych w OUN. Pozostaje więc kwestią otwartą, czy otrzymane wyniki są fałszywie dodatnie, czy też standardowe metody diagnostyczne ośrodkowej lokalizacji białaczki są niewystarczające. Z drugiej strony w trakcie 36-miesięcznej obserwacji badanej grupy wznowa białaczki w obrębie OUN wystąpiła jedynie u pacjentów, u których w pierwszym rzucie choroby w płynie mózgowo-rdzeniowym wykryto badane rearanżacje. Pozostaje jednak pytanie dlaczego nawrót wystąpił jedynie u 4 spośród 16 dzieci z utrzymującym się dodatnim wynikiem PCR, jeżeli przyjmiemy, że świadczy on o obecności komórek nowotworowych w OUN. Być może okres obserwacji był zbyt krótki. Z piśmiennictwa wiadomo, iż większość nawrotów białaczki występuje do 5 lat od chwili zakończenia leczenia (2). Istnieje więc teoretyczna możliwość wystąpienia kolejnych wznów w OUN.
Najważniejszym wydaje się być fakt wystąpienia nawrotu ALL w OUN jedynie wśród dzieci z dodatnim wynikiem badania PCR płynu mózgowo-rdzeniowego. Tym samym można podejrzewać, iż ten dodatni wynik stanowi potencjalne zagrożenie wystąpienia wznowy w OUN i pacjenci z tej grupy wymagają dalszego monitorowania stanu zdrowia pod kątem możliwości wystąpienia nawrotu ALL w OUN.
Piśmiennictwo
1. Bartram C.R., et al.: „Detection of minimal residual leukemia by polymerase chain reaction: potential implications for therapy” Clin. Chim. Acta, 1993, 217, 75-83.
2. Ganick D.J., et al.: „Leukemia presenting as central nervous system disease without bone marrow involvement” Med. Ped. Oncol. 1983, 11, 229-232.
3. Ghali D.W., et al.: „Heterogeinity of the T-cell receptor d gene indicating subclone formation in acute precursor B-cell leukemia” Blood, 1995, 85, 2795-801.
4. Januszkiewicz-Lewandowska D.: „Przegrupowania genów dla immunoglobulin i receptora antygenowego limfocytów T w chorobach limfoproliferacyjnych u dzieci” Praca habilitacyjna, Poznań, 2000.
5. Januszkiewicz D.A., et al.: „Molecular evidence for central nervous sysytem involvement in children with newly diagnosed acute limphoblastic leukemia” Hematological Oncology, 1995, 13, 201-206.
6. Kostler W.J., et al.: „Detection of minimal residual disease in patient with cancer: a review of techniques, clinical implications, and emerging therapeutic consequences” Cancer Detect. Prev. 2000, 24, 376-403.
7. Li X., et al.: „Detection of minimal leukemic cells in celebral spinal fluid of children with acute lymphoblastic leukemia using the polymerase chain reaction technique” Journal of Tongji Medical University, 1998, 18(1), 49-53.
8. Pinkel D., et al.: „Prevention and treatment of meningeal leukemia in children” Blood 1994, 84, 355.
9. Raciborska A.: „Monitorowanie choroby resztkowej u dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną metodą PCR” Praca doktorska, Warszawa, 2002.
10. Radwańska U., i wsp.: „ Białaczki u dzieci” Volumed, Wrocław 1998.
11. Rezuke W.N., et al.: „Molecular diagnosis of B-and T-cell lymphomas: fundamental principles and clinical applications” Clin. Chem. 1997, 43, 1814-24.
12. Shiramizu A., et al.: „Monitoring of celebral spinal fuid by polymerase chain reaction in children with acute lymphoblastic leukemia” International Journal of Pediatric Hematology/Oncology 1998, 5(6), 475-83.
13. Trainor K.J., et al.: „Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level” Bllod, 1990, 75, 2220-22.
Postępy Nauk Medycznych 4/2005
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych

Zamów prenumeratę

Serdecznie zapraszamy do
prenumeraty naszego czasopisma.

Biuletyn Telegram*

W celu uzyskania najnowszych informacji ze świata medycyny oraz krajowych i zagranicznych konferencji warto zalogować się w naszym
Biuletynie Telegram – bezpłatnym newsletterze.*
*Biuletyn Telegram to bezpłatny newsletter, adresowany do lekarzy, farmaceutów i innych pracowników służby zdrowia oraz studentów uniwersytetów medycznych.

Pozostałe artykuły z numeru 4/2005:

Strona główna | Reklama | Kontakt
Wszelkie prawa zastrzeżone © 1990-2014 Wydawnictwo Medyczne Borgis Sp. z o.o.
Chcesz być na bieżąco? Polub nas na Facebooku: strona Wydawnictwa na Facebooku
polityka cookies