Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 12/2008, s. 828-833
*Anna Budzyńska, Agnieszka Kaczmarek, Eugenia Gospodarek
Diagnostyka molekularna bakteryjnych zakażeń krwi
Molecular diagnostics of bacterial blood infections
Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik Katedry: prof. UMK dr hab. med. Eugenia Gospodarek
Streszczenie
Metody biologii molekularnej uważa się za szybkie narzędzie do wykrywania i identyfikacji czynnika etiologicznego zakażenia, wyizolowanego w hodowli lub bezpośrednio w materiale klinicznym. Rozpoznanie bakteriemii i rozróżnienie gatunków bakterii za nią odpowiedzialnych jest możliwe dzięki zastosowaniu w reakcji amplifikacji uniwersalnych starterów komplementarnych do odcinka 16S rRNA lub starterów gatunkowo-swoistych. Chociaż techniki biologii molekularnej nie zastąpią konwencjonalnych metod, koniecznych do oznaczania lekowrażliwości, w niektórych przypadkach zaleca się je do identyfikacji patogenu.
Summary
Molecular methods are considered to be rapid tool for the detection and accurate identification of the etiological agent from cultures or directly from clinical material. Amplification with universal primers usually complementary to highly conserved region 16S rRNA or amplification species-specific sequence allows detection of bacteriemia and discrimination among different bacterial species. Conventional methods provide antibiotic susceptibility data so will not be replaced by molecular techniques but detection of bacterial DNA in some cases may be recommended to identify the pathogen.
Słowa kluczowe: bakteriemia, izolacja DNA, PCR, 16S rRNA.
Wstęp
Posocznica jako wynik zakażenia uogólnionego jest jedną z przyczyn zgonów wśród pacjentów hospitalizowanych. Wskaźnik śmiertelności wynosi 30-70% i zależy od wielu czynników związanych zarówno z patogenezą, stanem zdrowia pacjenta, jak i jakością procedur medycznych. Ponad 90% przypadków bakteriemii jest spowodowanych przez: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Candida spp. Obecność drobnoustrojów we krwi jest zazwyczaj wynikiem inwazyjnego zakażenia organizmu, które wymaga wprowadzenia antybiotykoterapii. Sukces w leczeniu zależy od właściwego rozpoznania patogenu oraz prawidłowego doboru antybiotyków, na które drobnoustrój wykazuje wrażliwość (1).
Ze względu na niewielką liczbę patogenów w pobieranej objętości krwi, istnieje konieczność prowadzenia wstępnej hodowli w podłożu namnażającym, a ich wykrywanie opiera się na wyniku skomputeryzowanego systemu, monitorującego poziom wytwarzania metabolitów specyficznych dla drobnoustrojów. Obecnie dostępne są trzy automatyczne systemy wykrywające mikroorganizmy we krwi: BacT/Alert (BioMérieux), BACTEC (Becton Dickinson) i Extra Sensing Power (Difco Laboratories). Od momentu wykrycia aktywności metabolicznej drobnoustrojów i w związku z tym odczytania przez system dodatniego wyniku posiewu krwi, w ciągu 1-3 dni identyfikowany jest czynnik etiologiczny zakażenia na podstawie badania mikroskopowego, hodowli na podłożach stałych oraz reakcji biochemicznych i immunologicznych. Jednak zarówno obecność więcej niż jednego czynnika etiologicznego zakażenia, jak i występowanie nietypowych biochemicznie lub antygenowo szczepów może prowadzić do niewłaściwej interpretacji wyniku, braku możliwości określenia gatunku patogenu rzadko spotykanego lub otrzymania wyniku fałszywie ujemnego (2, 3). Na uzyskanie fałszywie ujemnych wyników ma również wpływ obecność w surowicy chorego stosowanych antybiotyków, obecność drobnoustrojów niehodowlanych oraz pobranie niewystarczającej objętości i liczby próbek krwi. Pomimo, iż we krwi niektórych niemowląt z bakteriemią stwierdza się większą liczbę drobnoustrojów niż u dorosłych (odpowiednio, 10-300 i 1-30 CFU/ml), liczba pobieranych od nich próbek krwi jest znacznie niższa niż u dorosłego pacjenta, a im mniejsza objętość krwi, tym mniejsze szanse wykrycia patogenów (4). Częstość dodatnich posiewów krwi u dzieci przyjmowanych na oddział intensywnej terapii z objawami sepsy wynosi 25-26% (5, 6).
Wpływ na wynik hodowli mają substancje dodawane do podłoży namnażających. Przykładem jest polianetosulfonian sodowy (ang. sodium polyanetholesulfonate, SPS) stosowany jako czynnik hamujący krzepnięcie krwi i fagocytozę oraz aktywność przeciwbakteryjną surowicy poprzez wytrącanie frakcji dopełniacza. Może hamować wzrost takich drobnoustrojów, jak: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Francisella tularensis, Moraxella catarrhalis. Pomimo poczynań mających na celu ominięcie problemów związanych z wykryciem i identyfikacją czynnika etiologicznego zakażeń krwi, oczekiwanie na wynik hodowli jest zbyt długie, szczególnie w przypadku drobnoustrojów o wysokich wymaganiach odżywczych (7, 8).
Skrócenie czasu badania umożliwiłoby ograniczenie stosowania antybiotyków o szerokim zakresie działania, co z kolei zmniejszyłoby ryzyko pojawiania się szczepów wielolekoopornych. Jednocześnie obniżeniu uległyby koszty leczenia poprzez zastąpienie leczenia empirycznego antybiotykami o węższym i ukierunkowanym zakresie działania (3).
Uzyskanie w krótkim czasie wyniku badania mikrobiologicznego umożliwiają techniki biologii molekularnej, oparte na wykrywaniu DNA drobnoustrojów. Cechuje je większa czułość niż standardowe metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej. Wykorzystywane są najczęściej w celu potwierdzenia rozpoznania zakażenia Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serowar Typhi, Burkholderia pseudomallei, Borrelia burgdorferi, Coxiella burnetti, Mycobacterium tuberculosis, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumoniae. Techniki molekularne mogą być wykorzystywane w diagnostyce zakażeń krwi w przypadku tych pacjentów, u których podejrzewa się posocznicę, ale jednocześnie objawy kliniczne nie są typowe lub metody hodowlane wskazują wynik ujemny. Najczęściej stosowane techniki opierają się na reakcji amplifikacji (polymerase chain reaction, PCR) oraz hybrydyzacji.
Łańcuchowa reakcja polimerazy
Reakcja PCR polega na amplifikacji wybranego fragmentu DNA przy użyciu specyficznych starterów, które inicjują przyłączanie nukleotydów i powielanie łańcucha DNA, dzięki czemu możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale nawet minimalnych ilości poszukiwanego odcinka DNA. Detekcja opiera się na elektroforezie produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określeniu jego wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu. Właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia możliwa jest dzięki reakcji multipleks-PCR, w skład której wchodzi mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów drobnoustrojów. Metoda ta jest efektywna dla ograniczonej liczby mikroorganizmów, gdyż zwiększenie liczby par starterów może prowadzić do obniżenia czułości reakcji lub wystąpienia wyników fałszywie ujemnych.
Przeprowadzenie równolegle lub kolejno po sobie serii indywidualnych reakcji PCR zwiększa z kolei koszt i złożoność badania. Problemy te można ominąć stosując pojedynczą parę uniwersalnych starterów zaprojektowanych do konserwatywnego regionu DNA bakterii. Badania prowadzone są zwykle z użyciem starterów komplementarnych do odcinka 16S rybosomowego DNA (rDNA) kodującego podjednostkę 16S rybosomu, obecną wyłącznie w komórkach bakteryjnych. W obrębie genów kodujących 16S rRNA występują fragmenty cechujące się wysoką konserwatywnością, poprzedzielane regionami o dużym z reguły polimorfizmie. Analiza produktu PCR, zawierającego fragment sekwencji unikalnej dla rodzaju lub gatunku patogenu, umożliwia jego identyfikację. W diagnostyce molekularnej zakażeń wykorzystuje się również amplifikację regionu 16S-23S rDNA, którego sekwencja wykazuje większą zmienność międzygatunkową niż odcinek 16S rDNA (1, 9, 10). W większości przypadków reakcję amplifikacji przeprowadza się na próbkach z wynikiem dodatnim posiewu krwi na bulionie namnażającym, ale bezpośrednie wykrycie materiału genetycznego drobnoustrojów w próbce pobranej od pacjenta również przynosi pożądane wyniki i pozwala na szybkie włączenie leczenia (1).
Siondalski i wsp. (11) porównali skuteczność metody PCR i systemu BACTEC w wykrywaniu bakterii we krwi pacjentów przed i po operacji na otwartym sercu. Izolację materiału genetycznego drobnoustrojów wykonywano bezpośrednio z materiału pobranego od chorych. W celu stwierdzenia obecności bakterii zastosowano uniwersalne startery do amplifikacji konserwatywnego regionu 16S rDNA. Następnie próbki z dodatnim wynikiem PCR analizowano w kierunku określenia gatunku bakterii, używając w reakcji amplifikacji starterów specyficznych dla S. epidermidis, S. aureus i P. aeruginosa. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono większą czułość techniki PCR, w porównaniu z hodowlą krwi w systemie BACTEC. Odsetek próbek dodatnich wyniósł odpowiednio 11,3% i 3,8%. Wykluczono fałszywie dodatnie wyniki amplifikacji, ponieważ wydłużenie czasu inkubacji w systemie BACTEC pozwoliło potwierdzić bakteriemię. Stwierdzono również 100% specyficzność zastosowanej metody molekularnej, ponieważ wszystkie wymienione wyżej gatunki zostały prawidłowo zidentyfikowane (11). Z kolei Zhang i wsp. (12) zastosowali reakcję amplifikacji konserwatywnego regionu 16S rDNA do potwierdzenia posocznicy będącej komplikacją ostrego martwiczego zapalenia trzustki, w przebiegu której w ponad 50% przypadków stwierdza się brak udokumentowanego mikrobiologicznie zakażenia (13). Interpretacja wyników wykazała, że odsetek wyników dodatnich otrzymanych z hodowli krwi wynosił 4,6%, natomiast z reakcji PCR – 36,4%, co potwierdza większą czułość metody molekularnej.
Podobnie jak każda inna metoda diagnostyczna, również technika PCR ma wady. Przy jej użyciu, oprócz żywych patogenów, zdolnych do namnażania, wykrywa się również zabite lub pochłonięte przez fagocyty patogeny, co nie pozwala rozróżnić czynnego zakażenia od przebytego. Stąd konieczne staje się odniesienie wyniku reakcji amplifikacji do obserwacji klinicznych, aby móc ustalić obecność lub ustąpienie posocznicy (12). Objętość pobranej próbki materiału ma wpływ nie tylko na wyniki otrzymywane przy użyciu klasycznych metod mikrobiologicznego badania krwi, ale również na czułość reakcji PCR. Minimalna objętość krwi wymagana do amplifikacji na wykrywalnym poziomie fragmentu genu kodującego 16S rRNA wynosi 200 μl (7). Rozważając wady metody, należy wziąć też pod uwagę fakt, że zanieczyszczenie odczynników reakcji bakteryjnym DNA obecnym w środowisku prowadzi do otrzymania wyniku fałszywie dodatniego. W związku z tym, istnieje konieczność włączania w każdej reakcji amplifikacji kontroli ujemnej PCR. Przyczyną wyników fałszywie ujemnych mogą być również pojedyncze mutacje punktowe w genomie drobnoustrojów na odcinku stanowiącym sekwencję docelową dla starterów, co uniemożliwia inicjację reakcji amplifikacji.
Wpływ na wydajność metody amplifikacji ma obecność w próbce krwi inhibitorów reakcji PCR, które można podzielić na naturalne składniki krwi (związki hemu i DNA leukocytów) (14, 15) oraz dodawane do niej koagulanty (heparyna, EDTA) (16, 17). Powinny być one wcześniej zinaktywowane, rozpuszczone lub usunięte z pobranego materiału, np. przez dodanie do mieszaniny PCR 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,01% białka gp32, betainę (N, N, N-trimetyloglicyna) lub zwiększenie stężenia jonów Mg2+ (18, 19, 20). Standardowa technika ekstrakcji mieszaniną fenol-chloroform nie pozwala odpowiednio oczyścić bakteryjnego DNA i pozbyć się SPS, inhibitora PCR obecnego w podłożach BACTEC i BacT/Alert, co znacznie utrudnia szerokie stosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce zakażeń krwi (21).
Kolejnym problemem, który wiąże się z zastosowaniem techniki PCR w diagnostyce zakażeń krwi jest możliwość występowania w wysterylizowanych wcześniej podłożach namnażających bakteryjnego DNA, które przy zastosowaniu konserwatywnych starterów również ulega amplifikacji. W podłożu BACTEC wykryto silnie pofragmentowane DNA Bacillus spp., natomiast w podłożu BacT/Alert – Streptococcus spp. (21). W celu uniknięcia zafałszowania wyników, należy włączyć do reakcji PCR kontrolę prowadzoną na jałowym podłożu namnażającym.
Sekwencjonowanie
Analiza produktów amplifikacji fragmentu 16S rDNA o zmiennej sekwencji poprzez sekwencjonowanie i porównanie ich z danymi pochodzącymi z banku genów umożliwia identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia. Sekwencjonowanie polega na analizie sekwencji nukleotydów w namnożonym odcinku DNA. Wybór amplifikowanego regionu i jego długość mają wpływ na zdolność różnicowania blisko spokrewnionych mikroorganizmów. Badania wykazały, że metoda PCR w połączeniu z sekwencjonowaniem jest dwukrotnie czulsza od hodowli (22). Sleigh i wsp. (23) wykorzystali ją do wykrywania bakteriemii u pacjentów oddziału intensywnej terapii. Analiza wyników wykazała, że 2/3 dodatnich reakcji PCR zostało prawidłowo zinterpretowanych. Pozostałe stanowiły prawdopodobnie wyniki fałszywie dodatnie, które mogły być spowodowane zanieczyszczeniem krwi podczas jej pobierania.
Sekwencjonowanie fragmentów genów 16S rDNA w celu ich identyfikacji wiąże się z dużymi nadziejami szybkiego wykrywania drobnoustrojów ze względu na precyzję metody. Aktualnie nie jest rekomendowane w diagnostyce mikrobiologicznej z powodu kosztów. Ponadto, jest niewiarygodne w przypadkach zakażeń mieszanych, ponieważ nie uzyskuje się jednoznacznego odczytu sekwencji zamplifikowanych produktów (23).
Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Anthony RM, Brown TJ, French GL: Rapid diagnosis of bacteriemia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array. J Clin Microbiol 2000; 38: 781-8.
2. Christensen JE, Stencil JA, Reed KD: Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by terminal restriction fragment length polymorphism profile analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol 2003; 41: 3790-800.
3. Jansen GJ: Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes. J Clin Microbiol 2000; 38: 814-7.
4. Kellogg JA, Manzella JP, Bankert DA: Frequency of low-level bacteriemia in children from birth to fifteen years of age. J Clin Microbiol 2000; 38: 2181-5.
5. Jacobs RF et al.: Septic chock in children: bacterial etiologies and temporal relationships. Pediatr Infect Dis J 1990; 9: 196-200.
6. Saez-Llorens X et al.:Applications of new sepsis definitions to evaluate outcome of pediatric patients with severe systemic infections. Paediatr Infect Dis J 1995: 14: 557-61.
7. Jordan JA, Burso MB: Comparison of 16S rRNA gene PCR and BACTEC 9240 for detection of neonatal bacteriemia. J Clin Microbiol 2000; 38: 2574-8.
8. Turenne CY et al.: Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by fluorescence-based PCR-single strand conformation polymorphism analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol 2000; 38: 513-20.
9. Hryniewiecki T i wsp.: Reakcja amplifikacji bakteryjnego DNA w diagnostyce infekcyjnego zapalenia wsierdzia. Med Dośw Mikrobiol 2002; 54: 265-72.
10. Roller C, Ludwig W, Schleifer KH: Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23S rRNA genes. J Gen Microbiol 1992; 138: 1167-75.
11. Siondalski P et al.: Usefulness of the PCR techique for bacterial DNA detection in blood of the patients after "opened heart” operations. Pol J Microbiol 2004; 53: 145-9.
12. Zhang WZ et al.: Rapid detection of sepsis complicating acute necrotizing pancreatitis using polymerase chain reaction. World J Gastroenterol 2001; 7: 289-92.
13. Kane TD, Alexander JW, Johannigman JA: The detection of microbial DNA in the blood. Ann Surg 1998; 227: 1-9
14. Akane A et al.: Identification of the heme compoun copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. Forensic Sci 1994; 39: 362-72.
15. Morata P, Queipo-Ortuno MI, de Dios Colmenero J: Strategy for optimizing DNA amplification in a peripheral blood PCR assay used for diagnosis of human brucellosis. J Clin Microbiol 1998; 36: 2443-6.
16. Satsangi J et al.: Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 1994; 343: 1509-10.
17. Wang JT et al.: Effects of anticoagulants and storage of blood samples on efficacy of the polymerase chain reaction assay for hepatitis C virus. J Clin Microbiol 1992; 30: 750-3.
18. Abu Al-Soud W et al.: A sample preparation method which facilitates detection of bacteria in blood cultures by the polymerase chain reaction. J Microbiol Methods 1998; 32: 217-24.
19. Cattaneo C et al.: Comparison of three DNA extraxtion methods on bone and blood stains up to 43 years old and amplification of three different gene sequences. J Forensic Sci 1997; 42: 1126-35.
20. Walsh PS, Metzeger DA, Higuchi R: Chelex(r)100 as medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechiques 1991; 10: 506-13.
21. Fredricks DN, Relman DA: Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate. J Clin Microbiol 2003; 36: 2810-6.
22. Ng W et al.: Buffy coat PCR for the diagnosis of experimental pneumococcal pneumonia. APMIS 2000; 108: 729-33.
23. Sleigh J, Cursons R, La Pine M: Detection of bacteraemia in critically ill patients using 16S rDNA polymerase chain reaction and DNA sequencing. Intensive Care Med 2001; 27: 1269-73.
24. Orita M et al.:. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphism using the polymerase chain reaction. Genomics 1989; 5: 874-9.
25. Ainsworth PL, Surh LC, Coulter-Mackie MB: Diagnostic single strand conformational polymorphism (SSCP): a simplified non-radioisotopic method as applied to a Tay-Sachs B1 variant. Nucleic Acids Res 1991; 19: 405-6.
26. Widjojoatmodjo MN, Fluit AC, Verhoef J: Rapid identification of bacteria by PCR-single-strand conformation polymorphism. J Clin Microbiol 1994; 32: 3002-7.
27. Ellison J, Dean M, Goldman D: Efficacy of fluorescence-based PCR-SSCP for detection of point mutations. BioTechniques 1993; 15: 684-91.
28. Makino R et al.: F-SSCP: fluorescence-based polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis. PCR Methods Appl 1992; 2: 10-3.
29. Widjojoatmodjo MN, Fluit AC, Verhoef J: Molecular identification of bacteria by fluorescence-based PCR-single-strand conformation polymorphism analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol 1995; 33: 2601-6.
30. Wellinghausen N et al.: Algorithm for the identification of bacterial pathogens in positive blood cultures by real-time LightCycler polymerase chain reaction (PCR) with sequence-specific probes. Diagn Microbiol Inf Dis 2004; 48: 229-41.
31. Pease AC et al.: Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 5022-6
32. Harvey S, Hill CW, Squires CL: Loss of the spacer loop sequence from rrnB operon in the Escherichia coli K-12 subline that bears the relA1 mutation. J Bacteriol 1998; 170: 1235-8.
33. Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ: Rapid identification of Candida species in blood cultures by a clinically useful PCR method. J Clin Microbiol 1997; 35: 1454-9.
34. Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 1995; 59: 143-69.
35. Matsuhisa A et al.: Detection of bacteria in phagocyte-smears from septicemia-suspected blood by in situ hybridization using biotinylated probes. Microbiol Immunol 1994; 38: 511-7.
otrzymano: 2008-05-09
zaakceptowano do druku: 2008-09-26

Adres do korespondencji:
*Anna Budzyńska
ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, 85-094 Bydgoszcz
tel.: (0-52) 585-44-80
e-mail: kizmikrob@cm.umk.pl

Postępy Nauk Medycznych 12/2008
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych