Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 12/2008, s. 828-833
*Anna Budzyńska, Agnieszka Kaczmarek, Eugenia Gospodarek
Diagnostyka molekularna bakteryjnych zakażeń krwi
Molecular diagnostics of bacterial blood infections
Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik Katedry: prof. UMK dr hab. med. Eugenia Gospodarek
Streszczenie
Metody biologii molekularnej uważa się za szybkie narzędzie do wykrywania i identyfikacji czynnika etiologicznego zakażenia, wyizolowanego w hodowli lub bezpośrednio w materiale klinicznym. Rozpoznanie bakteriemii i rozróżnienie gatunków bakterii za nią odpowiedzialnych jest możliwe dzięki zastosowaniu w reakcji amplifikacji uniwersalnych starterów komplementarnych do odcinka 16S rRNA lub starterów gatunkowo-swoistych. Chociaż techniki biologii molekularnej nie zastąpią konwencjonalnych metod, koniecznych do oznaczania lekowrażliwości, w niektórych przypadkach zaleca się je do identyfikacji patogenu.
Summary
Molecular methods are considered to be rapid tool for the detection and accurate identification of the etiological agent from cultures or directly from clinical material. Amplification with universal primers usually complementary to highly conserved region 16S rRNA or amplification species-specific sequence allows detection of bacteriemia and discrimination among different bacterial species. Conventional methods provide antibiotic susceptibility data so will not be replaced by molecular techniques but detection of bacterial DNA in some cases may be recommended to identify the pathogen.
Słowa kluczowe: bakteriemia, izolacja DNA, PCR, 16S rRNA.
Wstęp
Posocznica jako wynik zakażenia uogólnionego jest jedną z przyczyn zgonów wśród pacjentów hospitalizowanych. Wskaźnik śmiertelności wynosi 30-70% i zależy od wielu czynników związanych zarówno z patogenezą, stanem zdrowia pacjenta, jak i jakością procedur medycznych. Ponad 90% przypadków bakteriemii jest spowodowanych przez: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Candida spp. Obecność drobnoustrojów we krwi jest zazwyczaj wynikiem inwazyjnego zakażenia organizmu, które wymaga wprowadzenia antybiotykoterapii. Sukces w leczeniu zależy od właściwego rozpoznania patogenu oraz prawidłowego doboru antybiotyków, na które drobnoustrój wykazuje wrażliwość (1).
Ze względu na niewielką liczbę patogenów w pobieranej objętości krwi, istnieje konieczność prowadzenia wstępnej hodowli w podłożu namnażającym, a ich wykrywanie opiera się na wyniku skomputeryzowanego systemu, monitorującego poziom wytwarzania metabolitów specyficznych dla drobnoustrojów. Obecnie dostępne są trzy automatyczne systemy wykrywające mikroorganizmy we krwi: BacT/Alert (BioMérieux), BACTEC (Becton Dickinson) i Extra Sensing Power (Difco Laboratories). Od momentu wykrycia aktywności metabolicznej drobnoustrojów i w związku z tym odczytania przez system dodatniego wyniku posiewu krwi, w ciągu 1-3 dni identyfikowany jest czynnik etiologiczny zakażenia na podstawie badania mikroskopowego, hodowli na podłożach stałych oraz reakcji biochemicznych i immunologicznych. Jednak zarówno obecność więcej niż jednego czynnika etiologicznego zakażenia, jak i występowanie nietypowych biochemicznie lub antygenowo szczepów może prowadzić do niewłaściwej interpretacji wyniku, braku możliwości określenia gatunku patogenu rzadko spotykanego lub otrzymania wyniku fałszywie ujemnego (2, 3). Na uzyskanie fałszywie ujemnych wyników ma również wpływ obecność w surowicy chorego stosowanych antybiotyków, obecność drobnoustrojów niehodowlanych oraz pobranie niewystarczającej objętości i liczby próbek krwi. Pomimo, iż we krwi niektórych niemowląt z bakteriemią stwierdza się większą liczbę drobnoustrojów niż u dorosłych (odpowiednio, 10-300 i 1-30 CFU/ml), liczba pobieranych od nich próbek krwi jest znacznie niższa niż u dorosłego pacjenta, a im mniejsza objętość krwi, tym mniejsze szanse wykrycia patogenów (4). Częstość dodatnich posiewów krwi u dzieci przyjmowanych na oddział intensywnej terapii z objawami sepsy wynosi 25-26% (5, 6).
Wpływ na wynik hodowli mają substancje dodawane do podłoży namnażających. Przykładem jest polianetosulfonian sodowy (ang. sodium polyanetholesulfonate, SPS) stosowany jako czynnik hamujący krzepnięcie krwi i fagocytozę oraz aktywność przeciwbakteryjną surowicy poprzez wytrącanie frakcji dopełniacza. Może hamować wzrost takich drobnoustrojów, jak: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Francisella tularensis, Moraxella catarrhalis. Pomimo poczynań mających na celu ominięcie problemów związanych z wykryciem i identyfikacją czynnika etiologicznego zakażeń krwi, oczekiwanie na wynik hodowli jest zbyt długie, szczególnie w przypadku drobnoustrojów o wysokich wymaganiach odżywczych (7, 8).
Skrócenie czasu badania umożliwiłoby ograniczenie stosowania antybiotyków o szerokim zakresie działania, co z kolei zmniejszyłoby ryzyko pojawiania się szczepów wielolekoopornych. Jednocześnie obniżeniu uległyby koszty leczenia poprzez zastąpienie leczenia empirycznego antybiotykami o węższym i ukierunkowanym zakresie działania (3).
Uzyskanie w krótkim czasie wyniku badania mikrobiologicznego umożliwiają techniki biologii molekularnej, oparte na wykrywaniu DNA drobnoustrojów. Cechuje je większa czułość niż standardowe metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej. Wykorzystywane są najczęściej w celu potwierdzenia rozpoznania zakażenia Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serowar Typhi, Burkholderia pseudomallei, Borrelia burgdorferi, Coxiella burnetti, Mycobacterium tuberculosis, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma pneumoniae. Techniki molekularne mogą być wykorzystywane w diagnostyce zakażeń krwi w przypadku tych pacjentów, u których podejrzewa się posocznicę, ale jednocześnie objawy kliniczne nie są typowe lub metody hodowlane wskazują wynik ujemny. Najczęściej stosowane techniki opierają się na reakcji amplifikacji (polymerase chain reaction, PCR) oraz hybrydyzacji.
Łańcuchowa reakcja polimerazy
Reakcja PCR polega na amplifikacji wybranego fragmentu DNA przy użyciu specyficznych starterów, które inicjują przyłączanie nukleotydów i powielanie łańcucha DNA, dzięki czemu możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale nawet minimalnych ilości poszukiwanego odcinka DNA. Detekcja opiera się na elektroforezie produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określeniu jego wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu. Właściwa identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia możliwa jest dzięki reakcji multipleks-PCR, w skład której wchodzi mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów drobnoustrojów. Metoda ta jest efektywna dla ograniczonej liczby mikroorganizmów, gdyż zwiększenie liczby par starterów może prowadzić do obniżenia czułości reakcji lub wystąpienia wyników fałszywie ujemnych.
Przeprowadzenie równolegle lub kolejno po sobie serii indywidualnych reakcji PCR zwiększa z kolei koszt i złożoność badania. Problemy te można ominąć stosując pojedynczą parę uniwersalnych starterów zaprojektowanych do konserwatywnego regionu DNA bakterii. Badania prowadzone są zwykle z użyciem starterów komplementarnych do odcinka 16S rybosomowego DNA (rDNA) kodującego podjednostkę 16S rybosomu, obecną wyłącznie w komórkach bakteryjnych. W obrębie genów kodujących 16S rRNA występują fragmenty cechujące się wysoką konserwatywnością, poprzedzielane regionami o dużym z reguły polimorfizmie. Analiza produktu PCR, zawierającego fragment sekwencji unikalnej dla rodzaju lub gatunku patogenu, umożliwia jego identyfikację. W diagnostyce molekularnej zakażeń wykorzystuje się również amplifikację regionu 16S-23S rDNA, którego sekwencja wykazuje większą zmienność międzygatunkową niż odcinek 16S rDNA (1, 9, 10). W większości przypadków reakcję amplifikacji przeprowadza się na próbkach z wynikiem dodatnim posiewu krwi na bulionie namnażającym, ale bezpośrednie wykrycie materiału genetycznego drobnoustrojów w próbce pobranej od pacjenta również przynosi pożądane wyniki i pozwala na szybkie włączenie leczenia (1).
Siondalski i wsp. (11) porównali skuteczność metody PCR i systemu BACTEC w wykrywaniu bakterii we krwi pacjentów przed i po operacji na otwartym sercu. Izolację materiału genetycznego drobnoustrojów wykonywano bezpośrednio z materiału pobranego od chorych. W celu stwierdzenia obecności bakterii zastosowano uniwersalne startery do amplifikacji konserwatywnego regionu 16S rDNA. Następnie próbki z dodatnim wynikiem PCR analizowano w kierunku określenia gatunku bakterii, używając w reakcji amplifikacji starterów specyficznych dla S. epidermidis, S. aureus i P. aeruginosa. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono większą czułość techniki PCR, w porównaniu z hodowlą krwi w systemie BACTEC. Odsetek próbek dodatnich wyniósł odpowiednio 11,3% i 3,8%. Wykluczono fałszywie dodatnie wyniki amplifikacji, ponieważ wydłużenie czasu inkubacji w systemie BACTEC pozwoliło potwierdzić bakteriemię. Stwierdzono również 100% specyficzność zastosowanej metody molekularnej, ponieważ wszystkie wymienione wyżej gatunki zostały prawidłowo zidentyfikowane (11). Z kolei Zhang i wsp. (12) zastosowali reakcję amplifikacji konserwatywnego regionu 16S rDNA do potwierdzenia posocznicy będącej komplikacją ostrego martwiczego zapalenia trzustki, w przebiegu której w ponad 50% przypadków stwierdza się brak udokumentowanego mikrobiologicznie zakażenia (13). Interpretacja wyników wykazała, że odsetek wyników dodatnich otrzymanych z hodowli krwi wynosił 4,6%, natomiast z reakcji PCR – 36,4%, co potwierdza większą czułość metody molekularnej.
Podobnie jak każda inna metoda diagnostyczna, również technika PCR ma wady. Przy jej użyciu, oprócz żywych patogenów, zdolnych do namnażania, wykrywa się również zabite lub pochłonięte przez fagocyty patogeny, co nie pozwala rozróżnić czynnego zakażenia od przebytego. Stąd konieczne staje się odniesienie wyniku reakcji amplifikacji do obserwacji klinicznych, aby móc ustalić obecność lub ustąpienie posocznicy (12). Objętość pobranej próbki materiału ma wpływ nie tylko na wyniki otrzymywane przy użyciu klasycznych metod mikrobiologicznego badania krwi, ale również na czułość reakcji PCR. Minimalna objętość krwi wymagana do amplifikacji na wykrywalnym poziomie fragmentu genu kodującego 16S rRNA wynosi 200 μl (7). Rozważając wady metody, należy wziąć też pod uwagę fakt, że zanieczyszczenie odczynników reakcji bakteryjnym DNA obecnym w środowisku prowadzi do otrzymania wyniku fałszywie dodatniego. W związku z tym, istnieje konieczność włączania w każdej reakcji amplifikacji kontroli ujemnej PCR. Przyczyną wyników fałszywie ujemnych mogą być również pojedyncze mutacje punktowe w genomie drobnoustrojów na odcinku stanowiącym sekwencję docelową dla starterów, co uniemożliwia inicjację reakcji amplifikacji.
Wpływ na wydajność metody amplifikacji ma obecność w próbce krwi inhibitorów reakcji PCR, które można podzielić na naturalne składniki krwi (związki hemu i DNA leukocytów) (14, 15) oraz dodawane do niej koagulanty (heparyna, EDTA) (16, 17). Powinny być one wcześniej zinaktywowane, rozpuszczone lub usunięte z pobranego materiału, np. przez dodanie do mieszaniny PCR 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,01% białka gp32, betainę (N, N, N-trimetyloglicyna) lub zwiększenie stężenia jonów Mg2+ (18, 19, 20). Standardowa technika ekstrakcji mieszaniną fenol-chloroform nie pozwala odpowiednio oczyścić bakteryjnego DNA i pozbyć się SPS, inhibitora PCR obecnego w podłożach BACTEC i BacT/Alert, co znacznie utrudnia szerokie stosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce zakażeń krwi (21).
Kolejnym problemem, który wiąże się z zastosowaniem techniki PCR w diagnostyce zakażeń krwi jest możliwość występowania w wysterylizowanych wcześniej podłożach namnażających bakteryjnego DNA, które przy zastosowaniu konserwatywnych starterów również ulega amplifikacji. W podłożu BACTEC wykryto silnie pofragmentowane DNA Bacillus spp., natomiast w podłożu BacT/Alert – Streptococcus spp. (21). W celu uniknięcia zafałszowania wyników, należy włączyć do reakcji PCR kontrolę prowadzoną na jałowym podłożu namnażającym.
Sekwencjonowanie
Analiza produktów amplifikacji fragmentu 16S rDNA o zmiennej sekwencji poprzez sekwencjonowanie i porównanie ich z danymi pochodzącymi z banku genów umożliwia identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia. Sekwencjonowanie polega na analizie sekwencji nukleotydów w namnożonym odcinku DNA. Wybór amplifikowanego regionu i jego długość mają wpływ na zdolność różnicowania blisko spokrewnionych mikroorganizmów. Badania wykazały, że metoda PCR w połączeniu z sekwencjonowaniem jest dwukrotnie czulsza od hodowli (22). Sleigh i wsp. (23) wykorzystali ją do wykrywania bakteriemii u pacjentów oddziału intensywnej terapii. Analiza wyników wykazała, że 2/3 dodatnich reakcji PCR zostało prawidłowo zinterpretowanych. Pozostałe stanowiły prawdopodobnie wyniki fałszywie dodatnie, które mogły być spowodowane zanieczyszczeniem krwi podczas jej pobierania.
Sekwencjonowanie fragmentów genów 16S rDNA w celu ich identyfikacji wiąże się z dużymi nadziejami szybkiego wykrywania drobnoustrojów ze względu na precyzję metody. Aktualnie nie jest rekomendowane w diagnostyce mikrobiologicznej z powodu kosztów. Ponadto, jest niewiarygodne w przypadkach zakażeń mieszanych, ponieważ nie uzyskuje się jednoznacznego odczytu sekwencji zamplifikowanych produktów (23).
Badanie polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA
Polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (single strand conformation polymorphism, SSCP) stanowi technikę wprowadzoną do badań mikrobiologicznych stosunkowo niedawno, a obecnie szeroko wykorzystywaną do określania mutacji wielu genów, zamplifikowanych przy użyciu reakcji PCR. Zdenaturowane, jednołańcuchowe fragmenty DNA w warunkach natywnej elektroforezy przyjmują określoną konformację przestrzenną zależną od sekwencji nukleotydów. Prowadzi to do odmiennej migracji produktów reakcji PCR o podobnych wielkościach, ale odmiennych sekwencjach, dzięki czemu podczas detekcji mogą być one rozróżnialne i identyfikowane bez konieczności ich sekwencjonowania (24).
W konwencjonalnej metodzie SSCP analizę otrzymanego wzoru migracji konformerów dokonuje się w sposób wizualny, określając charakterystyczne położenie produktów PCR rozdzielanych elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym nie zawierającym czynnika denaturującego (25, 26). Nie jest jednak możliwa dokładna analiza różnic w odległości pomiędzy niciami DNA. Rozdzielczość metody można zwiększyć, stosując PCR-SSCP ze starterami znakowanymi fluorescencyjnie, dzięki czemu różnice w migracji odcinków DNA, poddane analizie komputerowej, są odczytywane jako różnice w czasie retencji (27, 28). Widjojoatmodjo i wsp. (29) udowodnili, że w ten sposób zmodyfikowana metoda SSCP może być wykorzystywana w identyfikacji czynników etiologicznych zakażeń. Wykonali oni SSCP na zamplifikowanych fragmentach 16S rDNA, uzyskując różny czas retencji dla 47 gatunków Gram-dodatnich i Gram-ujemnych bakterii (29). Turenne i wsp. (8) porównywali skuteczność techniki PCR-SSCP opracowanej przez Widjojoatmodjo i wsp. (29) oraz konwencjonalnych metod laboratoryjnych, stosując jako punkt wyjścia hodowle krwi z dodatnim wynikiem w podłożu namnażającym. Odsetek wyników dodatnich, wykrytych przy użyciu metody molekularnej wyniósł 92%, z czego prawie 98% zostało poprawnie zidentyfikowanych do poziomu gatunku. Na podstawie nieprawidłowo rozpoznanych gatunków, sformułowano wniosek, iż opisana technika nie pozwala odróżnić blisko spokrewnionych drobnoustrojów.
Metoda SSCP pozwala wykrywać zakażenia mieszane, ponieważ analiza komputerowa umożliwia odczyt i właściwą interpretację większej liczby konformerów. Niskie inokulum bakterii w badanym materiale, zróżnicowana wydajność izolacji lub różna liczba kopii genu 16S rRNA u poszczególnych gatunków może prowadzić do nie wykrycia sygnału fluorescencji i wyniku fałszywie ujemnego.
Zaletą metody SSCP, podobnie jak innych technik molekularnych, jest krótki czas identyfikacji drobnoustroju – około 6,5 godzin. Wysoce zautomatyzowany system detekcji umożliwia ograniczenie pracy manualnej i prowadzenie badań dla 1-48 próbek jednocześnie. Kolejnym celem jest opracowanie tej metody w kierunku wykrywania patogenów bezpośrednio w materiale pobranym od pacjenta (8).
PCR w czasie rzeczywistym
Ze względu na dużą wiarygodność wyników, daleko posuniętą automatyzację i niewielką pracochłonność, badania ilościowe techniką Real-Time PCR (RT-PCR) stanowią istotne uzupełnienie jakościowych metod identyfikacji czynników etiologicznych zakażeń krwi. Reakcja PCR z analizą przyrostu produktu w czasie rzeczywistym stosowana jest do pomiaru ilości kopii badanego fragmentu DNA, co stanowi odzwierciedlenie liczby drobnoustrojów we krwi.
Planując oznaczenie ilościowe przy wykorzystaniu metody RT-PCR, należy dokonać wyboru metody detekcji DNA. W aparacie Light Cycler (Roche) wykorzystywany jest mechanizm zwany FRET (ang. fluorescencje resonance energy transfer), w którym stosuje się dwie sondy komplementarne do amplifikowanej sekwencji, specyficznej dla rodziny, rodzaju, czy gatunku bakterii. Sondę donorową na końcu 3´ znakuje się FAM (6-karboksyfluoresceina) lub HEX (heksachloro-6-karboksyfluoresceina), a receptorową na końcu 5´- czerwienią LC (Light Cycler Red 640) lub Cy5 (pochodna cyjaniny). Podczas reakcji PCR obie sondy hybrydyzują do produktu. Zewnętrzne źródło światła pobudza barwnik donorowy, który przekazuje energię na barwnik receptorowy, wzbudzając jego fluorescencję. Pomiarowi poddaje się natężenie fluorescencji, które jest proporcjonalne do ilości badanej sekwencji DNA. Sytuacja taka zachodzi tylko wtedy, gdy obie sondy hybrydyzują blisko siebie, co umożliwia transfer energii z donora na akceptor i fluorescencję. Na etapie wydłużania w reakcji PCR obie sondy są usuwane i fluorescencja zanika.
Do wykrywania amplikonów zbyt krótkich, aby zaprojektować dla nich dwie sondy, stosuje się pojedynczą sondę TaqMan wyznakowaną na końcu 5´ znacznikiem fluorescencyjnym (ang. reporter) (np. FAM, HEX, TET (tetrachloro-6-karboksyfluoresceina), JOE (2,7-dimetylo-4,5-dichloro-6-6-karboksyfluorosceina)), a na końcu 3´ cząsteczką wygaszającą fluorescencję (ang. quencher) (TAMRA (6-karboksy-tetrametylorodamina) lub DABCYL (kwas 4-(4´-dimetyloaminfenylazo)-benzoesowy)). Na etapie przyłączania starterów, sonda TaqMan hybrydyzuje do amplifikowanego fragmentu DNA, a następnie na etapie wydłużania jest degradowana przez polimerazę Taq posiadającą aktywność 5´→3´ egzonukleazową. Fluorochrom ulega oddzieleniu od wygaszacza, co umożliwia emisję fluorescencji mierzonej przez urządzenie.
Do analizy przyrostu ilości amplikonów w reakcji RT-PCR stosuje się również znakowanie DNA barwnikiem SYBR Green, emitującym światło tylko w przypadku związania z dwuniciowym DNA. Opracowano także wiele nowych, bardziej złożonych metod detekcji, takich jak sonda typu Molecular Beacons, czy startery typu skorpion.
Wellinghausen i wsp. (30) przy wykorzystaniu aparatu Light Cycler przeprowadzili badanie liczby kopii genów następujących drobnoustrojów we krwi: Staphylococcus spp., S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp., Streptococcus spp., S. agalactiae i N. meningitidis. Z kolei metodę TaqMan wykorzystano do oznaczenia ilościowego bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, a także P. aeruginosa, Acinetobacter spp., Bacteroides spp., S. maltophilia i H. influenzae (30).
Większość drobnoustrojów zidentyfikowano stosując startery komplementarne do konserwatywnego regionu 16S rRNA, co umożliwiło powielenie rejonów zmiennych charakterystycznych dla poszczególnych gatunków bakterii. Technika RT-PCR pozwoliła na prawidłową identyfikację wszystkich drobnoustrojów obecnych w hodowli krwi. Obserwowano jedynie reakcje krzyżowe pomiędzy E. coli a Chryseomonas luteola i E. faecium a E. durans. W przypadku monokultury czułość tej techniki wyniosła 98,3%. Nie jest ona zalecana do identyfikacji drobnoustrojów w hodowli mieszanej ze względu na niższą czułość, która może być spowodowana różną wydajnością amplifikacji badanych matryc DNA (30).
Zaletą badania ilościowego techniką Real-time PCR jest jej wysoka swoistość, czułość, a także krótki czas identyfikacji wynoszący kilka godzin. Jednak konieczność posiadania specjalnie przystosowanego do tej metody aparatu, wysoka cena sond i innych odczynników ograniczają zastosowanie tej metody w pracy rutynowej.
Hybrydyzacja
Identyfikację patogenu na podstawie zamplifikowanej sekwencji można przeprowadzić wykonując hybrydyzację znakowanego produktu PCR do sond oligonukleotydowych obecnych w roztworze lub unieruchomionych na podłożu stałym (nitrocelulozowej/nylonowej błonie lub płytce szklanej) (31). Detekcja sygnału oznacza rozpoznanie przez sondę szukanej, komplementarnej do niej sekwencji, a co za tym idzie, wykrycie i identyfikację drobnoustroju obecnego we krwi chorego. Skuteczność metody zależy od zastosowania odpowiedniej sondy, specyficznej do sekwencji docelowej oraz czułości detekcji sygnału, na którą ma wpływ, między innymi, rodzaj użytego znacznika. Idealnie opracowana metoda powinna umożliwić hybrydyzację danej sondy tylko z jednym gatunkiem/rodzajem drobnoustroju i jednocześnie ze wszystkimi szczepami tego gatunku/rodzaju. W praktyce, zwykle konieczne jest zastosowanie dwóch lub większej liczby sond, co ułatwia identyfikację szczepów, wykazujących mniejsze zróżnicowanie międzygatunkowe sekwencji w obrębie regionu docelowego. Ważną zaletą tego systemu detekcji jest możliwość ciągłego uzupełniania zestawu oligonukleotydów o dodatkowe sekwencje nowych patogenów (32).
Skuteczność opisanej metody potwierdziły badania prowadzone przez Anthony i wsp. (1), którzy zaprojektowali startery do amplifikacji 23S rDNA oraz sondy oligonukleotydowe unieruchomione na nylonowej membranie, do określenia przynależności do gatunku drobnoustroju odpowiedzialnego za bakteriemię. Prawidłowo zidentyfikowany został rodzaj Proteus oraz gatunki: Stenotrophomonas maltophilia, P. aeruginosa, H. influenzae i E. faecalis. Identyfikacja bakterii okazała się niemożliwa w przypadku E. coli i Salmonella spp., dla których uzyskiwano jednakowy profil hybrydyzacji. Podobne wyniki dotyczyły K. pneumoniae i Enterobacter spp. oraz K. oxytoca i Citrobacter freundii. Opracowana metoda okazała się mało skuteczna w przypadku próbek zawierających paciorkowce, dla których otrzymywano wyniki fałszywie ujemne wynikające z obecności inhibitorów reakcji PCR (1).
Bezpośrednia identyfikacja drobnoustrojów we krwi przy użyciu techniki PCR i hybrydyzacji cechuje się wysoką czułością (detekcja 10-100 CFU/0,3 ml krwi), ale wiąże się jednocześnie z niższą specyficznością (33). Zaletą tej techniki jest szybka identyfikacja gatunku bakterii w większości dodatnich posiewów krwi, możliwa w ciągu 4 godzin (1).
Odmianą hybrydyzacji jest metoda hybrydyzacji in situ z wykorzystaniem znakowanych fluorochromem oligonukleotydów (fluorescent in situ hybridization, FISH) komplementarnych do rodzajowo- lub gatunkowo-specyficznych sekwencji 16S rRNA danego drobnoustroju. Znakowana sonda DNA „rozpoznaje” i łączy się z poszukiwanym fragmentem DNA bakteryjnym in situ, czyli bezpośrednio w tkance gospodarza, najczęściej – w limfocytach krwi obwodowej. W przypadku obecności w badanym materiale DNA poszukiwanego drobnoustroju, miejsce połączenia sondy widoczne jest w mikroskopie fluorescencyjnym (34, 35).
Jansen i wsp. (3) zastosowali tę technikę do identyfikacji Streptococcus spp., E. faecalis, S. aureus, gronkowców koagulazo-ujemnych, P. aeruginosa, E. coli, i pałeczek rodziny Enterobacteriaceae. Badacze zaobserwowali 100% zgodność pomiędzy wynikami otrzymanymi przy użyciu hodowli i techniki FISH. Czas potrzebny do identyfikacji wymienionych drobnoustrojów nie przekraczał jednej godziny. Czułość metody nie przekraczała jednak 95%, ponieważ zbyt mała liczba bakterii nie wystarcza do uzyskania odpowiedniego do zanalizowania obrazu mikroskopowego. Nie stwierdzono natomiast wyników fałszywie dodatnich. Fałszywie ujemne wyniki otrzymano wyłącznie w przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych (3).
Ponieważ w metodzie FISH nie wykorzystuje się oligonukleotydów komplementarnych do konserwatywnych fragmentów 16S rDNA, identyfikacja patogenów ogranicza się tylko do określonych drobnoustrojów, dla których zaprojektowano sondy. W związku z tym technika ta wykorzystywana jest głównie do analizy dodatnich wyników posiewu krwi w kierunku bakterii najczęściej odpowiedzialnych za posocznicę, z rodzaju Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus i Gram-ujemnych pałeczek. Zaletą metody jest jej prostota, wysoka czułość badania i krótki czas analizy wyniku. Ponieważ nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu takiego, jak termocykler czy spektrofotometr, może być w niedalekiej przyszłości wykorzystywana w diagnostyce mikrobiologicznej. Trwają też badania nad zastosowaniem techniki FISH do określania lekowrażliwości drobnoustrojów (3).
Podsumowanie
Metody biologii molekularnej takie jak PCR są pomyślnie stosowane w identyfikacji szerokiego zakresu drobnoustrojów, włączając: wirusy, bakterie, grzyby i pierwotniaki. W przeciwieństwie do metod hodowlanych, nie wymagają do detekcji wzrostu drobnoustroju. Szczególne zastosowanie znajdują techniki molekularne w diagnostyce zakażeń patogenami, których hodowla in vitro jest trudna, długotrwała lub niemożliwa. Umożliwiają one znaczne skrócenie czasu oczekiwania na wynik i cechują się wysoką czułością i swoistością.
Chociaż konwencjonalne metody diagnostyczne opierające się na wykrywaniu drobnoustrojów za pomocą hodowli nie zostaną w najbliższym czasie całkowicie wyparte przez techniki biologii molekularnej ze względu na ich wykorzystanie do określania lekowrażliwości organizmu, reakcja PCR pozostaje znakomitym testem diagnostycznym służącym wykluczaniu zakażenia krwi w wybranych populacjach chorych.
Piśmiennictwo
1. Anthony RM, Brown TJ, French GL: Rapid diagnosis of bacteriemia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an oligonucleotide array. J Clin Microbiol 2000; 38: 781-8.
2. Christensen JE, Stencil JA, Reed KD: Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by terminal restriction fragment length polymorphism profile analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol 2003; 41: 3790-800.
3. Jansen GJ: Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes. J Clin Microbiol 2000; 38: 814-7.
4. Kellogg JA, Manzella JP, Bankert DA: Frequency of low-level bacteriemia in children from birth to fifteen years of age. J Clin Microbiol 2000; 38: 2181-5.
5. Jacobs RF et al.: Septic chock in children: bacterial etiologies and temporal relationships. Pediatr Infect Dis J 1990; 9: 196-200.
6. Saez-Llorens X et al.:Applications of new sepsis definitions to evaluate outcome of pediatric patients with severe systemic infections. Paediatr Infect Dis J 1995: 14: 557-61.
7. Jordan JA, Burso MB: Comparison of 16S rRNA gene PCR and BACTEC 9240 for detection of neonatal bacteriemia. J Clin Microbiol 2000; 38: 2574-8.
8. Turenne CY et al.: Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by fluorescence-based PCR-single strand conformation polymorphism analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol 2000; 38: 513-20.
9. Hryniewiecki T i wsp.: Reakcja amplifikacji bakteryjnego DNA w diagnostyce infekcyjnego zapalenia wsierdzia. Med Dośw Mikrobiol 2002; 54: 265-72.
10. Roller C, Ludwig W, Schleifer KH: Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23S rRNA genes. J Gen Microbiol 1992; 138: 1167-75.
11. Siondalski P et al.: Usefulness of the PCR techique for bacterial DNA detection in blood of the patients after "opened heart” operations. Pol J Microbiol 2004; 53: 145-9.
12. Zhang WZ et al.: Rapid detection of sepsis complicating acute necrotizing pancreatitis using polymerase chain reaction. World J Gastroenterol 2001; 7: 289-92.
13. Kane TD, Alexander JW, Johannigman JA: The detection of microbial DNA in the blood. Ann Surg 1998; 227: 1-9
14. Akane A et al.: Identification of the heme compoun copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. Forensic Sci 1994; 39: 362-72.
15. Morata P, Queipo-Ortuno MI, de Dios Colmenero J: Strategy for optimizing DNA amplification in a peripheral blood PCR assay used for diagnosis of human brucellosis. J Clin Microbiol 1998; 36: 2443-6.
16. Satsangi J et al.: Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 1994; 343: 1509-10.
17. Wang JT et al.: Effects of anticoagulants and storage of blood samples on efficacy of the polymerase chain reaction assay for hepatitis C virus. J Clin Microbiol 1992; 30: 750-3.
18. Abu Al-Soud W et al.: A sample preparation method which facilitates detection of bacteria in blood cultures by the polymerase chain reaction. J Microbiol Methods 1998; 32: 217-24.
19. Cattaneo C et al.: Comparison of three DNA extraxtion methods on bone and blood stains up to 43 years old and amplification of three different gene sequences. J Forensic Sci 1997; 42: 1126-35.
20. Walsh PS, Metzeger DA, Higuchi R: Chelex(r)100 as medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechiques 1991; 10: 506-13.
21. Fredricks DN, Relman DA: Improved amplification of microbial DNA from blood cultures by removal of the PCR inhibitor sodium polyanetholesulfonate. J Clin Microbiol 2003; 36: 2810-6.
22. Ng W et al.: Buffy coat PCR for the diagnosis of experimental pneumococcal pneumonia. APMIS 2000; 108: 729-33.
23. Sleigh J, Cursons R, La Pine M: Detection of bacteraemia in critically ill patients using 16S rDNA polymerase chain reaction and DNA sequencing. Intensive Care Med 2001; 27: 1269-73.
24. Orita M et al.:. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphism using the polymerase chain reaction. Genomics 1989; 5: 874-9.
25. Ainsworth PL, Surh LC, Coulter-Mackie MB: Diagnostic single strand conformational polymorphism (SSCP): a simplified non-radioisotopic method as applied to a Tay-Sachs B1 variant. Nucleic Acids Res 1991; 19: 405-6.
26. Widjojoatmodjo MN, Fluit AC, Verhoef J: Rapid identification of bacteria by PCR-single-strand conformation polymorphism. J Clin Microbiol 1994; 32: 3002-7.
27. Ellison J, Dean M, Goldman D: Efficacy of fluorescence-based PCR-SSCP for detection of point mutations. BioTechniques 1993; 15: 684-91.
28. Makino R et al.: F-SSCP: fluorescence-based polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis. PCR Methods Appl 1992; 2: 10-3.
29. Widjojoatmodjo MN, Fluit AC, Verhoef J: Molecular identification of bacteria by fluorescence-based PCR-single-strand conformation polymorphism analysis of the 16S rRNA gene. J Clin Microbiol 1995; 33: 2601-6.
30. Wellinghausen N et al.: Algorithm for the identification of bacterial pathogens in positive blood cultures by real-time LightCycler polymerase chain reaction (PCR) with sequence-specific probes. Diagn Microbiol Inf Dis 2004; 48: 229-41.
31. Pease AC et al.: Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91: 5022-6
32. Harvey S, Hill CW, Squires CL: Loss of the spacer loop sequence from rrnB operon in the Escherichia coli K-12 subline that bears the relA1 mutation. J Bacteriol 1998; 170: 1235-8.
33. Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ: Rapid identification of Candida species in blood cultures by a clinically useful PCR method. J Clin Microbiol 1997; 35: 1454-9.
34. Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 1995; 59: 143-69.
35. Matsuhisa A et al.: Detection of bacteria in phagocyte-smears from septicemia-suspected blood by in situ hybridization using biotinylated probes. Microbiol Immunol 1994; 38: 511-7.
otrzymano: 2008-05-09
zaakceptowano do druku: 2008-09-26

Adres do korespondencji:
*Anna Budzyńska
ul. M. Skłodowskiej-Curie 9, 85-094 Bydgoszcz
tel.: (0-52) 585-44-80
e-mail: kizmikrob@cm.umk.pl

Postępy Nauk Medycznych 12/2008
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych