- reklama -

Usługi na jak najwyżym poziomie - serwis narciarski Warszawa

Wyniki badań epidemiologicznych wyraźnie wskazują, że częstość występowania chorób nowotworowych w różnych populacjach jest odmienna i ma niewątpliwy związek z zanieczyszczeniem żywności zarówno mikrobiologicznym, jak i chemicznym oraz ze składem zwyczajowo spożywanego pożywienia. Od dawna wiadomo, że zanieczyszczenia mikrobiologiczne, jak np. aflatoksyny oraz wiele związków chemicznych, np. z grupy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, obecnych w żywności w wyniku skażenia środowiska, bądź niewłaściwego przetworzenia, czy przygotowania żywności do spożycia (np. przypalenia w czasie smażenia, czy opiekania) wykazuje silne działanie mutagenne i kancerogenne.

Od dawna wiadomo również, że w produktach żywnościowych pochodzenia roślinnego występuje wiele substancji o właściwościach antymutagennych i/lub antykancerogennych. Do niedawna przypuszczano, że w żywności pochodzenia zwierzęcego związki o takich właściwościach nie występują. W 1979 roku w badaniach nad czynnikami mutagennymi i kancerogennymi występującymi w mięsie poddanym obróbce termicznej w wysokich temperaturach, Pariza i wsp. (1) zauważyli niespodziewanie, że w ekstraktach tłuszczowych zarówno surowego, jak i smażonego na patelni mielonego mięsa wołowego występują związki hamujące mutagenezę u bakterii Salmonella tiphimurium oznaczaną testem Amesa. W dalszych badaniach in vivo u myszy i szczurów z chemicznie indukowanym nowotworem stwierdzono, że u zwierząt, do diety których dodawano te związki, kancerogeneza była istotnie hamowana (2, 3, 4, 5). W kolejnych badaniach ustalono, że związki te – to sprzężone dieny kwasu linolowego (ang. conjugated linoleic acid – CLA) (6, 7).

Odkrycia Parizy i wsp. dały asumpt do dalszych szczegółowych badań dotyczących występowania sprzężonych dienów kwasu linolowego w żywności, sposobów wzbogacania żywności w CLA oraz działania związków tej grupy w organizmie zwierząt doświadczalnych i ludzi.

Łańcuch kwasu oktadekadienowego składa się z 18 atomów węgla i w cząsteczce są dwa wiązania podwójne, co przyjęto oznaczać skrótem C18:2. Kwas C18:2 występujący w naturalnych olejach roślinnych ma oba wiązania podwójne w konfiguracji przestrzennej cis i są one rozdzielone dwoma wiązaniami pojedynczymi (ryc. 1). Najczęściej występującą formę kwasu oktadekadienowego o konfiguracji cis 9, cis 12 (c9, c12) popularnie nazwano kwasem linolowym.

Analizy chromatograficzne składu puli kwasów tłuszczowych rafinowanych i częściowo uwodornionych olejów roślinnych oraz tłuszczu mleka krowiego wykazały, że w tych tłuszczach kwas oktadekadienowy występuje również w konfiguracjach: t9, t12; c9, t12 oraz t9, c12 (8, 9). Przy zastosowaniu spektroskopii masowej wykryto ponadto, że w margarynach kwas C18:2 może występować również w konfiguracjach c9, c13 oraz c9, t13 (10), a badania z zastosowaniem argentometrycznej chromatografii cienkowarstwowej (Ag-TLC) oraz chromatografii gazowej (GC) wykazały, że wśród izomerów trans kwasu C18:2 w tłuszczu mleka krowiego duży udział mają izomery t9, t13 oraz t11, c15 (11).

Termin „sprzężone dieny kwasu linolowego” (ang. conjugated linoleic acid – CLA) obejmuje izomery kwasu oktadekadienowego, w cząsteczkach których wiązania podwójne są rozdzielone tylko jednym wiązaniem pojedynczym (z chemicznego punktu widzenia są więc sprzężonymi dienami) (ryc. 1). Wiązania podwójne w cząsteczkach sprzężonych dienów kwasu linolowego obecnych w tłuszczach zwierzęcych występują najczęściej przy węglu 9 i 11 oraz 10 i 12, ale np. stosując bardzo wymyślne techniki Ag-TCL w sprzężeniu z HPLC i kapilarną GC w tłuszczu wołowym wykrywano również izomery CLA, w cząsteczkach których wiązania podwójne występują przy węglu 6 i 8; 7 i 9; 8 i 10, 11 i 13 oraz 12 i 14 (12).

Wiązania podwójne w cząsteczkach sprzężonych dienów kwasu linolowego mogą mieć konfigurację przestrzenną cis, jak i trans, tzn. mogą one występować w formach cis-cis, trans-trans, cis-trans oraz trans-cis. Różnorodność form pozycyjnych i przestrzennych sprawia, że w skład puli związków określanych terminem „sprzężone dieny kwasu linolowego” wchodzi bardzo dużo izomerów, zarówno pozycyjnych, jak i przestrzennych.

Sprzężone dieny kwasu linolowego są heterogenną grupą izomerów, których właściwości i działanie w organizmie mogą być odmienne. Z uwagi jednak na duże trudności i koszty uzyskania preparatów zawierających tylko jeden izomer CLA dotychczas niewiele jest wyników badań dotyczących działania poszczególnych izomerów CLA u zwierząt doświadczalnych.

Różnorodność kwasów tłuszczowych, oraz ich izomerów przestrzennych i pozycyjnych w tłuszczach jadalnych narzucają wysokie wymagania w zakresie metod analitycznych stosowanych w oznaczeniach tych związków.

W przypadku mieszaniny izomerów kwasów tłuszczowych o konfiguracji cis i trans do wstępnego ich rozdzielania stosowana jest powszechnie chromatografia argentometryczna na cienkiej warstwie (Ag-TLC) lub wysokosprawna chromatografia cieczowa z zastosowaniem kolumn pokrytych azotanem srebra (Ag-HPLC). Do pełnego rozdziału izomerów cis i trans stosowane są kolumny kapilarne o długości od 30 do 100 metrów, przy czym preferowane są kolumny o długości 100 metrów. Zastosowanie 100-metrowej kolumny umożliwia lepszy wgląd w skład puli sprzężonych dienów kwasu linolowego w tłuszczach pochodzenia zwierzęcego oraz powstających w procesach utwardzania tłuszczów roślinnych (13, 14).

Sprzężone dieny kwasu linolowego są produktem pośrednim powstającym w czasie uwodorniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych: linolowego (C18:2 c9, c12) i a-linolenowego (C18:3 c9, c12, c15) w przewodzie pokarmowym zwierząt przeżuwajacych (tzw. „proces biohydrogenacji”). Pierwszym etapem tego procesu jest izomeryzacja cząsteczki kwasu linolowego przez enzymy anaerobowej bakterii Butyrivibrio fibrisolvents (15). Cząsteczka sprzężonego dienu kwasu linolowego wytworzona w wyniku działania izomerazy bakteryjnej jest następnie przekształcana do kwasu wakcenowego (C18:1 t11) i elaidynowego (C18:1 t9). Jednakże część powstałych CLA nie podlega dalszym procesom biohydrogenacji i ulega wchłonięciu, a następnie inkorporacji do tłuszczu mleka, śródmięśniowego i zapasowego.

Bakterie zasiedlające jelito grube zwierząt monogastrycznych i człowieka zdolne są również do przekształcania kwasu linolowego w CLA. Jednakże u tych gatunków większość kwasu linolowego dostarczanego z pożywieniem (ok. 96%) ulega wchłonięciu w jelicie cienkim. W związku z tym niewielka ilość substratu jest dostępna dla enzymów bakterii zasiedlających jelito grube. Dlatego dla ludzi i zwierząt monogastrycznych zarówno wytwarzanie CLA w jelicie grubym, jak i ich wchłanianie są niewielkie (16). W tłuszczu zapasowym i śródmięśniowym zwierząt monogastrycznych zawartość CLA jest znacznie mniejsza niż u zwierząt przeżuwających i wynosi przeciętnie od 0,6 do 0,9 mg CLA/g tłuszczu (13). Śladowe ilości CLA wykrywano również w rybach, ale mechanizmy tworzenia się związków tej grupy u tego gatunku nie są jeszcze wyjaśnione (13).

Najwięcej sprzężonych dienów kwasu linolowego jest w tłuszczu mleka krowiego oraz w tłuszczu wołowym. Wśród sprzężonych dienów kwasu linolowego w tłuszczu zwierząt przeżuwających dominuje izomer o konfiguracji cis-9, trans-11. Ocenia się, że w mleku i jego przetworach izomer cis-9, trans-11 stanowi 73-93% wszystkich izomerów CLA, zaś w wołowinie – 57-85% CLA ogółem (17). Z uwagi na dominację, izomer o konfiguracji cis-9, trans-11 nazwano kwasem żwacza lub żwaczowym (ang. rumenic acid).

Sprzężone dieny kwasu linolowego występują w organizmie człowieka. Izomery CLA wykrywane w tkance tłuszczowej człowieka mają najczęściej konfigurację c9, t11 i t9, t11; w śladowych ilościach wykrywane są również izomery o konfiguracji t9, c11 i c9, c11 (18). Izomer o konfiguracji c9, t11 występuje również w osoczu i w mleku kobiecym (19). Początkowo przypuszczano, że CLA obecne w organizmie człowieka są wyłącznie pochodzenia egzogennego. Przypuszczenie to oparte było na obserwacjach, że zawartość CLA w tłuszczu mleka kobiecego zależy od spożycia mleka i jego przetworów przez karmiące matki (19, 20) oraz spostrzeżeniach, że po wzbogaceniu pożywienia człowieka w oleje bogate w kwas linolowy nie obserwowano zmian w udziale CLA w puli kwasów tłuszczowych osocza (21).

Chociaż zapotrzebowanie człowieka na sprzężone dieny kwasu linolowego nie zostało jeszcze dokładnie określone, ekstrapolacje wyników badań ze zwierząt doświadczalnych na człowieka wskazują, że dzienne spożycie CLA nie jest wystarczające, aby związki te mogły wywierać korzystne działanie w organizmie człowieka. Dlatego przypuszczano, że CLA nie tylko są dostarczane z pożywieniem, ale i mogą być wytwarzane w organizmie.

W latach 80-tych wysunięto przypuszczenie, że sprzężone dieny kwasu linolowego mogą powstawać in vivo w wyniku wolnorodnikowej peroksydacji kwasu linolowego (22). Według tej hipotezy w wyniku „wyrwania” atomu wodoru przez np. rodnik hydroksylowy i przemieszczenia wiązania podwójnego z cząsteczki kwasu linolowego mógłby powstać rodnik kwasu linolowego o strukturze sprzężonego dienu, który jeszcze przed reakcją z tlenem singletowym reagowałby z białkiem. W konsekwencji doprowadziłoby to do przekształcenia cząsteczki białka w formę rodnikową i powstania sprzężonego dienu kwasu linolowego. Dotychczas brak jest dowodów potwierdzających działanie tego mechanizmu w organizmie in vivo. Są jednakże dowody, że CLA mogą powstawać w wyniku wolnorodnikowej peroksydacji kwasu linolowego w czasie obróbki technologicznej żywności.

Inni badacze przypuszczali, że kwas wakcenowy (c18:1, t11) może być przekształcany do CLA zarówno w organizmie człowieka i zwierząt monogastrycznych, jak i przeżuwaczy (23). Bezpośrednie dowody istnienia tej ścieżki metabolicznej u człowieka pochodzą z badań Adolfa i wsp. (24) z użyciem znakowanych kwasów tłuszczowych. Autorzy ci wykryli, że w organizmie człowieka izomer t11 kwasu C18:1 jest przekształcany do CLA o konfiguracji c9, t11, zaś izomer c11 kwasu C18:1 – do CLA o konfiguracji c9, c11 (24).

CLA o konfiguracji c9, t11 jest wytwarzany z kwasu wakcenowego (c18:1, t11) przez desaturazę D-9 (EC. 1. 14. 99. 5) w kilkuetapowym procesie, w którym pośredniczą cytochrom b₅, reduktaza cytochromu b₅ i tlen cząsteczkowy (25, 26). U zwierząt na diecie z kwasem wakcenowym zawartość CLA w tkankach zwiększa się. W badaniach na myszach potwierdzono, że w organizmie zwierząt kwas wakcenowy ulega desaturacji do sprzężonych dienów kwasu linolowego (27). Proces ten podobnie jak powstawanie długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych z ich form macierzystych (elongacja i desaturacja) może zachodzić w wątrobie. Santora i wsp. (27) odnotowali ponadto, że u zwierząt na diecie z CLA, sprzężone dieny kwasu linolowego wykrywano w triglicerydach i w fosfolipidach. Gdy zwierzęta utrzymywano na diecie nie zawierającej CLA, sprzężone dieny kwasu linolowego występowały jedynie w cząsteczkach triglicerydów. Może to wskazywać, że desaturacja kwasu wakcenowego do CLA zachodzi nie tylko w wątrobie, ale i w tkance tłuszczowej. W serii doświadczeń na krowach przy zastosowaniu kwasu sterculinowego, który jest inhibitorem desaturazy D-9 wyliczono, że ok. 64% CLA obecnego w mleku pochodzi z endogennej syntezy tego związku z kwasu wakcenowego (28).

Dowody, że kwas wakcenowy jest substratem dla endogennej syntezy CLA dają podstawę do weryfikacji dotychczasowych uogólnień dotyczących działania monoenowych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans w organizmie człowieka oraz rekomendacji ograniczania ich spożycia. Stwarza to konieczność rozszerzenia badań porównujących działanie poszczególnych izomerów trans kwasu C18:1 u zwierząt doświadczalnych. Dodać należy, że profile izomerów pozycyjnych o konfiguracji trans kwasu C18:1 w tłuszczu mleka krowiego i margarynach wyprodukowanych tradycyjną metodą częściowego uwodorniania olejów roślinnych przy zastosowaniu, temperatury, ciśnienia i katalizatora (mrówczanu niklu) są odmienne. W mleku i jego przetworach dominuje izomer o konfiguracji t11, tj. kwas wakcenowy (ok. 38%), zaś w margarynach izomery t9 i t10, które stanowią odpowiednio 39% i 21% izomerów trans kwasu C18:1 (29).

Sprzężone dieny kwasu linolowego występują w wielu produktach żywnościowych, ale ich udział w puli kwasów tłuszczowych produktów poszczególnych grup różni się istotnie. W tabeli 1 (str. 28) podano zawartość kwasu linolowego i CLA w niektórych produktach spożywczych.

W naturalnych olejach roślinnych sprzężone dieny kwasu linolowego praktycznie nie występują; w olejach rafinowanych ich zawartość jest śladowa – 0,1-0,7 mg/g tłuszczu (13), a wśród związków tej grupy najczęściej występują izomery, w cząsteczkach których wiązania podwójne występują przy węglu 9 i 11 oraz 10 i 12 i około połowy z nich ma konfigurację przestrzenną trans-trans (31).

Chin i wsp. (32), Decker (17), Fogerty i wsp. (19) oraz Parodi (33) w pracach przeglądowych dotyczących zawartości CLA w różnych produktach żywnościowych stwierdzili, że zawartość CLA w tłuszczu mleka może wahać się od 8,6 do 100 mmoli/g tłuszczu (tj. od 2,3 do 26 mg/g).

Badania wykonane w naszym Instytucie w ramach grantu KBN nr 5P06G011 16 pt.: „Występowanie sprzężonych dienów kwasu linolowego w mleku i przetworach z mleka, mięsie i produktach mięsnych oraz w odżywkach dla niemowląt i małych dzieci” potwierdziły, że zawartość CLA w tłuszczu mleka krowiego zależy w największym stopniu od sposobu żywienia zwierząt. W próbkach tłuszczu mleka krów hodowanych tradycyjnie (w lecie wypasanych na pastwisku i w zimie karmionych mieszankami paszowymi) w małych gospodarstwach rolnych w województwie lubelskim obserwowano wyraźne (ok. 2-krotne) wahania sezonowe zawartości CLA o konfiguracji c9, t11 (od średnio 5,1 mg/g tłuszczu w zimie do 10 mg/g tłuszczu w lecie). Natomiast w próbkach tłuszczu mleka krów hodowanych nowocześnie, w dużych gospodarstwach w województwie wielkopolskim, nie obserwowano tak wyraźnych wahań sezonowych w zawartości CLA o konfiguracji c9, t11 (od średnio 4,2 mg/g tłuszczu w zimie do 5,3 mg/g tłuszczu w lecie). W ramach tych badań stwierdzono również, że podobne wahania sezonowe występują w zawartości izomerów trans kwasu C18:1 w tłuszczu mleka krowiego (w tłuszczu mleka krów hodowanych w województwie lubelskim zawartość izomerów trans kwasu C18:1 wynosiła średnio 16,2 mg/g tłuszczu w zimie i 30,6 mg/g tłuszczu w lecie; w tłuszczu mleka krów z Wielkopolski – 15,1 mg/g tłuszczu w zimie i 17,9 mg/g tłuszczu w lecie). Ponadto występowały ścisłe dodatnie zależności między zawartością CLA o konfiguracji c9, t11 i izomerów trans kwasu C18:1 w tłuszczu mleka krowiego (wsp. korelacji r =+0,99) (34).

Sprzężone dieny kwasu linolowego wytwarzane są przez bakterie zasiedlające żwacz, stąd też skład paszy zwierząt, a ściślej zawartość w niej wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (linolowego i a-linolenowego) jako substratów dla działania enzymów bakterii, w największym stopniu determinować będzie zawartość sprzężonych dienów w tłuszczu mleka oraz tłuszczu śródmięśniowym i zapasowym. W wielu szczegółowych badaniach żywieniowych wykazano, że udział CLA w puli kwasów tłuszczowych mleka zwiększa się, gdy pasza zwierząt zostanie wzbogacona w oleje roślinne bogate w kwas linolowy albo a-linolenowy: rzepakowy, słonecznikowy albo olej z siemienia lnianego (35, 36, 37). Spośród wielu prac dotyczących żywieniowych sposobów zwiększania zawartości CLA w tłuszczu mleka warto odnotować badania Franklina i wsp. (38), w których stwierdzono, że po dodaniu alg morskich Schizochytrium sp. do paszy krów zmniejszała się zawartość tłuszczu w mleku, ale zawartość długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych z rodziny n-3, kwasu wakcenowego i CLA w tłuszczu mleka zwiększyła się istotnie; nie zmieniły się przy tym cechy organoleptyczne mleka.

Oczywistym jest, że zwiększenie zawartości sprzężonych dienów kwasu linolowego w tłuszczu zwierząt (mleka oraz śródmięśniowym i zapasowym) można uzyskać najłatwiej dodając do pożywienia zwierząt preparaty CLA. Dowiodły tego liczne badania żywieniowe przeprowadzone na wielu gatunkach zwierząt, np. świniach (39), szczurach (40). Takie postępowanie jest uzasadnione ze względów poznawczych; nie ma jednakże praktycznego uzasadnienia z punktu widzenia nakładów finansowych. Warto zaznaczyć, że po wzbogaceniu paszy kur w CLA, związki te są inkorporowane do tłuszczu żółtka jaja (41).

Głównym źródłem sprzężonych dienów kwasu linolowego dla człowieka jest pożywienie, a ściślej pełne mleko krowie i jego przetwory (szczególnie masło) oraz tłuszcz zawarty w mięsie wołowym. W puli kwasów tłuszczowych mięsa innych zwierząt przeżuwających, np. sarny, jelenia zawartość CLA jest mniejsza niż w puli kwasów tłuszczowych wołowiny. Wstępne analizy próbek mięśnia Longisium dorsi sarny, jelenia, daniela i jagniąt w naszym laboratorium wskazują, że CLA stanowią odpowiednio 0,06-0,18%, 0,04-0,29%, 0,07-0,08% i 0,20-0,54% puli kwasów tłuszczowych tego mięśnia (42).

W początkowych badaniach nad sprzężonymi dienami kwasu linolowego spostrzeżono, że w wołowinie pieczonej na ruszcie zawartość CLA jest większa niż w wołowinie surowej. Przypuszczano, że jest to wynikiem wolnorodnikowej peroksydacji kwasu linolowego zawartego w surowcu, która nasila się pod wpływem temperatury w atmosferze powietrza. W kolejnych badaniach stwierdzono jednak, że w przeliczeniu na g tłuszczu, obróbka termiczna mięsa (gotowanie, pieczenie, opiekanie) nie mają istotnego wpływu na zawartość CLA w produkcie (43).

Chociaż powstawanie sprzężonych dienów kwasu linolowego drogą wolnorodnikowej peroksydacji kwasu linolowego i a-linolenowego ma znaczenie drugorzędne, modyfikacja procesów technologicznych może być wykorzystywana dla zwiększenia zawartości CLA w produktach mleczarskich. Najważniejszymi parametrami technologicznymi wpływającymi na zawartość CLA w przetworach z mleka są temperatura, dostęp powietrza, skład aminokwasowy białek oraz czas dojrzewania produktu. Obróbka technologiczna serów w temperaturze 80°C i 90°C powoduje zwiększenie udziału CLA w tłuszczu w porównaniu do serów poddawanych obróbce w temperaturze 60°C (44). Dostęp powietrza ułatwia powstawanie CLA drogą wolnorodnikowej oksydacji kwasu linolowego i a-linolenowego. Dlatego zawartość CLA w tłuszczu serów dojrzewających w atmosferze powietrza jest większa niż tych, które dojrzewają w atmosferze azotu (44, 45). Białka serwatkowe lub mleko w proszku dodane w czasie produkcji serów mogą służyć jako donor protonów. Umożliwi to nasilenie procesu izomeryzacji kwasu linolowego i spowoduje zwiększenie udziału CLA w tłuszczu serów (46).

Od dawna wiadomo, że CLA powstają w wyniku działania izomerazy kwasu linolowego – enzymu bakterii zasiedlających żwacz. W logiczny sposób nasunęło to pytanie, czy kultury starterowe stosowane w produkcji fermentowanych przetworów z mleka i mięsa mogą podobnie wytwarzać CLA?

Ostatnio Jiang i wsp. (47) wykazali, że spośród wielu badanych w hodowli in vitro szczepów bakterii jedynie Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii ATCC 6207, Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii-Propioni-6 i Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii 9093 były w stanie przekształcać wolny kwas linolowy w sprzężone dieny o konfiguracji c9, t11 i t9, c11. Charakterystyczne jest, że wolny kwas linolowy w medium hamuje wzrost tych szczepów bakterii, które są zdolne przekształcać go w CLA. Pozwala to przypuszczać, że konwersja kwasu linolowego do CLA może stanowić mechanizm detoksyfikacji dla tych szczepów bakterii (47). Ponadto, jak wynika z badań Jianga i wsp. (47) dalsze etapy biohydrogenacji kwasu linolowego przez bakterie zasiedlające żwacz i szczepy stosowane w produkcji przetworów fermentowanych z mleka różnią się, gdyż w wyniku działania tych pierwszych powstaje kwas wakcenowy (C18:1, t11), a tych ostatnich – kwas oleinowy (C18:1, c9).

Ostatnie badania nad sposobami zwiększania zawartości CLA w żywności koncentrują się na wykorzystaniu enzymów z Candida antarctica, które umożliwiają kilkunastokrotne zwiększenie zawartości CLA w tłuszczu masła (48). System ciągłej ekstrakcji w fazie nadkrytycznej może być również wykorzystywany dla wzbogacania tłuszczu mleka w CLA (48). Przypuszcza się, że dzięki metodom inżynierii genetycznej geny izomerazy Butyrivibrio fibrisolvents zostaną wszczepione do innych bakterii, np. Escherichia coli, co umożliwi niedrogą produkcję CLA (48).