Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Balneologia Polska 1/2006, s. 6-11
Honorata Nawrocka1, Barbara Poniedziałek2, Feliks Jaroszyk1, Krzysztof Wiktorowicz2
Wpływ fal torsyjnych prawoskrętnych na wybuch oddechowy granulocytów obojętnochłonnych
Effects of right-handed torsion wave on respiratory burst of neutrophils
1 z Katedry Biofizyki Akademii Medycznej w Poznaniu,
Kierownik Katedry: prof. zw. dr hab. F. Jaroszyk
2 z Katedry Biologii i Ochrony Środowiska Akademii Medycznej w Poznaniu,
Kierownik Katedry: prof. dr hab. K. Wiktorowicz
Streszczenie
Zbadano wpływ fal torsyjnych prawoskrętnych (FTP) na pozamitochondrialny metabolizm tlenowy granulocytów (PTMG) obojętnochłonnych w stanie in vitro. Poddano również obserwacji zależność wielkości PTMG od odległości aplikatora fal torsyjnych w stosunku do badanych próbek krwi.
Do badań użyto krew stanowiącą materiał po rutynowych badaniach laboratoryjnych. Pole torsyjne (FTP) generowane było przez specjalny generator fal torsyjnych. Do oceny wybuchu oddechowego użyto DCFH-DA (dwuoctan 2´7´ ć dichlorofluorescyny). Jako substancję aktywującą wykorzystano PMA (12-myristynian, 13-octan forbölu). Pomiaru fluorescencji dokonano techniką cytometrii przepływowej.
Różnica w wielkości wybuchu oddechowego w próbkach poddanych i niepoddanych działaniu FTP była istotna statystycznie przy odległości aplikatora 6,5 cm od próbek z krwią.
Wpływ pola torsyjnego prawoskrętnego objawiał się zwiększeniem produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) przez granulocyty stymulowane PMA. Wpływ ten zaobserwowano jedynie przy odległości 6,5 cm, co sugeruje przyjęcie tezy „dwustożkowości” fal torsyjnych wytwarzanych w generatorze.
1. Wstęp
Istotę fal torsyjnych (FT) opisuje teoria Shipova (1, 2, 3, 4, 9). Powyższa teoria posiada swoich zwolenników jak również wielu przeciwników. Dlatego podjęto badania wpływu FT na modelowe struktury komórkowe, które stanowiły granulocyty obojętnochłonne (neutrofile). Podjęte badania dotyczyły analizy pozamitochondrialnego metabolizmu tlenowego oraz jego zmian pod wpływem FT. Fale torsyjne posiadały polaryzację kołową prawoskrętną (FTP) oraz energię (EFT) do 1000 razy większą od energii (EZ) ziemskich fal torsyjnych. Powyższe właściwości FTP uzyskiwano dzięki odpowiedniemu koncentratorowi nazywanemu również generatorem fal torsyjnych.
Granulocyty obojętnochłonne przeważają ilościowo wśród komórek żernych krążących we krwi obwodowej (7, 8, 11). Stanowią pierwszą linię obrony organizmu człowieka przed inwazjami bakterii, grzybów i niektórych wirusów. Posiadają zdolność do odbierania sygnałów chemotaktycznych, adhezji do śródbłonka oraz diapedezy przez ścianę naczynia do miejsca, w którym toczy się proces zapalny. Tam rozpoznają, fagocytują, a następnie niszczą pochłonięte bakterie, grzyby i niektóre wirusy. Granulocyty obojętnochłonne mogą być aktywowane między innymi przez składowe dopełniacza, produkty bakteryjne, a także samą fagocytozę powodując wytwarzanie większej ilości reaktywnych pochodnych tlenowych (ROS) (7, 8, 11).
Produkty pozamitochondrialnego metabolizmu tlenowego komórek (PTMG) mogą być wykrywane między innymi metodami pośrednimi, takimi jak cytometria przepływowa (6, 10). Do oceny wytwarzania ROS w cytometrii przepływowej stosuje się między innymi DCFH – DA (dwuoctan 2´7´ – dichlorofluorescyny), który po przeniknięciu przez błonę komórkową rozprasza się wewnątrz komórki i ulega deacetylacji w spolaryzowaną cząstkę DCFH (2´7´ – dichlorofluorescyna). DCFH po aktywacji komórki i w obecności powstałego H2O2, jonów żelaza i peroksydazy utlenia się do DCF (2´7´ – dichlorofluoresceina). Związek ten emituje sygnał fluorescencyjny w zakresie 530 nm, który może być analizowany w cytometrze przepływowym.
Wybuch oddechowy in vitro wymaga aktywacji granulocytów, ponieważ ich metabolizm tlenowy w spoczynku jest niewielki. Do stymulacji komórek używa się między innymi PMA (12 – myristynian, 13 – octan forbolu) (6, 10).
2. Materiał i metoda cytofluorymetrii przepływowej
Krew użyta do badań stanowiła niewykorzystany materiał po rutynowych badaniach diagnostycznych z laboratorium Szpitala PSK 1 w Poznaniu. Ze względu na ochronę danych osobowych brak jest informacji o ewentualnych chorobach, jakie przechodzili dawcy, ani o stosowanym leczeniu.
Badaniu poddano próbki zawierające po 50 μl krwi (krew została pobrana na środek przeciwkrzepliwy). Krew poddano działaniu pola torsyjnego FTP wytwarzanego przez specjalny generator przedstawiony bliżej w następnym punkcie niniejszej pracy. Badano wpływ FTP na wybuch oddechowy granulocytów umieszczając generator odpowiednio w odległościach: 3,5 cm, 6,5 cm i 12,5 cm od górnej powierzchni probówek z krwią. Do każdego badania użyto czterech probówek z krwią pochodzącą od tego samego dawcy. Badanie wpływu FTP wykonano na krwi osób dorosłych.
Do próbek z krwią (do każdej z czterech danego badania) dodawano 10 μl DCFH – DA, przy czym dwie poddawano działaniu pola torsyjnego, dwie pozostałe inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności. Po upływie 30 min do jednej z próbek poddanych działaniu pola FTP i do jednej znajdującej się poza polem dodawano 2 μl PMA. Wszystkie próbki razem inkubowano w ciemności przez 15 min. Następnie usuwano krwinki czerwone dodając do każdej próbki 700 μl płynu lizującego. Po 10 min dokonywano pomiaru fluorescencji DCF. Do tych pomiarów użyto cytofluorometru przepływowego Cytoron Absolute (Ortho, USA) wyposażonego w laser argonowy (15 mW), który emituje światło o długości 488 nm. Na podstawie zjawiska rozproszenia światła „do przodu” i „w bok” została oceniona wielkość i granularność komórki, która przechodziła w danym momencie przez wysoko zogniskowaną wiązkę lasera. Do dalszej analizy wybrano tylko granulocyty obojętnochłonne.
Pomiary fluorescencji DCF dokonywano stosując wzmocnienie logarytmiczne sygnału. Natężenie sygnałów fotoelektrycznych zostało skonwertowane w wartości numeryczne nazwane kanałami. Do pomiaru intensywności fluorescencji granulocytów używano wartości tzw. średniego kanału, wyliczonego przez program ImmunoCount 2. Aby dokonać oceny wielkości wybuchu oddechowego porównywano wielkość średniego kanału dla granulocytów stymulowanych PMA i niestymulowanych. Analizę otrzymanych wyników wykonano w oparciu o program Statistica wersja 6.0, stosując test kolejności par Wilcoxona, test K-S i macierze korelacji.
3. Metoda i koncentratory fal torsyjnych
Teoria Shipova (9) rozszerza ogólną teorię względności A. Einsteina. Zakłada się w niej, że siły bezwładności są siłami rzeczywistymi działającymi na układ materialny. Konsekwencją takiego założenia jest postać równania ruchu punktu materialnego o masie m w przestrzeni 10-ciowymiarowej (i = 0, 1, 2, ..., 9)
Stosunkowo niedawno profesjonalne medyczne zastosowanie znalazły fale torsyjne głównie pochodzenia ziemskiego. Podobnie jak pole grawitacyjne ziemskie tak pole ziemskich fal torsyjnych mają największy wpływ na żywe organizmy znajdujące się na naszej planecie. Stanowią one wynik ruchów rotacyjnych punktów materialnych naszej planety, między innymi: ruchów mórz i oceanów. Niewątpliwie pola te, podobnie jak pole grawitacyjne i promieniowanie słoneczne, wpływały na kształt procesów ewolucji życia na Ziemi.
W warunkach naturalnych fale torsyjne mogą być spolaryzowane prawoskrętnie lub lewoskrętnie oraz posiadać niewielkie natężenie (są rozproszone). Wyniki badań naukowych wskazują na wielką przydatność medyczną fal torsyjnych o polaryzacji kołowej prawoskrętnej i o odpowiednim ich natężeniu. Sytuacja jest podobna jak w przypadku światła. Światło spolaryzowane ma zdecydowanie większe znaczenie medyczne od niespolaryzowanego.
Do medycznego wykorzystania fal torsyjnych zostały zbudowane koncentratory tych fal oraz nadano im polaryzację kołową prawoskrętną. Firma P.P.H.U. TORST opracowała takie urządzenia nazwane odpowiednio: generatory oraz polaryzatory torsyjne. W omawianej pracy do wytwarzania FTP wykorzystano generator oznaczony symbolem P364529 przez Polski Urząd Patentowy. Ze względu na fakt, iż generator stanowi projekt patentowy zastrzeżony w Polskim Urzędzie Patentowym, autorzy niniejszej pracy nie mieli możliwości jego szerszego opisu.
4. Wyniki badań
W badaniach wpływu FTP na wybuch oddechowy granulocytów obojętnochłonnych przyjęto następujące oznaczenia próbek krwi:
1 – próbki z krwią niepoddane działaniu pola FTP, niestymulowane PMA
2 – próbki z krwią niepoddane działaniu pola FTP, stymulowane PMA
3 – próbki z krwią poddane działaniu pola FTP, niestymulowane PMA
4 – próbki z krwią poddane działaniu pola FTP, stymulowane PMA
W przedstawianym tekście pracy obecne są również oznaczenia wartości różnic średniej intensywności fluorescencji DCF, gdzie:
Δ(1-3) – różnice wartości średniej fluorescencji DCF pomiędzy próbkami oznaczonymi symbolami 1 i 3
Δ(2-4) – różnice wartości średniej fluorescencji DCF pomiędzy próbkami oznaczonymi symbolami 2 i 4
Δ((4-3)-(2-1)) – różnice w wartościach średniej fluorescencji DCF pomiędzy próbkami oznaczonymi symbolami 4, 3, 2, 1.
Wpływ FTP na wytwarzanie ROS przez granulocyty obojętnochłonne przy odległości R1=3,5cm, R2=6,5 cm, R3=12,5 cm został podany w tabeli 1.
Tabela 1. Wartości średniej intensywności fluorescencji DCF przy działaniu FTP z odległości R1=3,5 cm, R2=6,5 cm oraz R3=12,5 cm.
 R1=3,5 cmR2=6,5 cmR3=12,5 cm
próbaNśredniaodch. St.średniaodch. St.średniaodch. St.
118132,929,773,912,0109,429,2
218148,930,185,022,4129,122,4
318133,728,874,316,6108,828,1
418151,329,993,024,2127,920,1
Wartości różnic 
Δ(1-3) -0,8 -0,4 0,6
Δ(2-4)-2,3-8,01,2
Δ((4-3)-(2-1))1,57,6-0,6
Na rycinach 1-3 zamieszczono graficzne przedstawienie zależności wyliczonych wartości różnic średniej fluorescencji DCF między poszczególnymi próbkami w zależności od odległości R generatora w stosunku do badanych próbek.
Ryc. 1. Wartości różnic Δ(1-3) DCF dla zbadanych odległości.
Ryc. 2. Wartości różnic Δ(2-4) DCF dla zbadanych odległości.
Ryc. 3. Wartości różnic Δ((4-3)-(2-1)) DCF dla zbadanych odległości.
Tabela 2. Test par Wilcoxona Δ(4-3) i Ä(2-1) dla poszczególnych odległości generatora od próbek.
próbyOdległośćPoziom istotności
p
Δ(4-3) i Δ(2-1)R10,21
Δ(4-3) i Δ(2-1)R20,03
Δ(4-3) i Δ(2-1)R30,76
Tabela 3. Wartości współczynnika korelacji r i poziomu istotności p dla poszczególnych różnic w zależności od wyjściowego stanu granulocytów i ich wyjściowej zdolności do aktywacji dla poszczególnych odległości.
Odległość aplikatoraWartości współczynnika korelacji r i poziom istotności p
1 a Δ(1-3)2 a Δ(2-4)1 aΔ((4-3) - (2-1))
rprprp
R10,2540,3080,1720,4940,2120,399
R2-0,2510,3140,2070,409-0,0250,923
R30,2700,2770,4550,0580,1310,604
Wartości różnic Δ(1-3) obrazują wpływ FTP na produkcję ROS w próbach niestymulowanych PMA. Wpływ ten zwiększa się za wzrostem R (ryc. 1).
Wartości różnic Δ(2-4) obrazują wpływ FTP na wytwarzanie ROS w próbach stymulowanych PMA (ryc. 2). Uzyskana wartość różnicy w przypadku odległości 6,5 cm jest istotnie statystyczna (tab. 4). W przypadku odległości 3,5 i 12,5 cm nie jest istotna statystycznie.
Tabela 4. Wyniki testu kolejności par Wilcoxona poszczególnych prób – wartości p.
próbyPoziom istotności
p
odl. R1odl. R2odl. R3
1 i 30,4780,9060,962
2 i 40,2460,0060,339
Wartości różnic Δ((4-3)-(2-1)) obrazują różnicę w wielkości wybuchu oddechowego w próbach poddanych i niepoddanych działaniu FTP. Wyniki testu kolejności par Wilcoxona między wartościami różnic Δ(4-3) w stosunku do Δ(2-1) w zależności od odległości R przedstawia tabela 2. Z zamieszczonej tabeli wynika, że różnice w wielkości wybuchu oddechowego granulocytów pomiędzy próbami poddanymi działaniu FTP (różnica 4-3) a próbami kontrolnymi (różnica 2-1) dla odległości 3,5 cm i 12,5 cm nie są istotne statystycznie. Brak jest w tych przypadkach reakcji na FTP. Natomiast dla odległości 6,5 cm ta zależność jest istotnie statystyczna, co oznacza, że FTP w sposób istotny zwiększyły wielkość wybuchu oddechowego granulocytów (tab. 1, ryc. 3).
Tabela 3 przedstawia wartości współczynnika korelacji r i poziomu istotności p dla poszczególnych różnic w zależności od wyjściowego stanu granulocytów i ich wyjściowej zdolności do aktywacji dla poszczególnych odległości.
Wartości współczynnika korelacji dla powyższych zależności są niewielkie. Oznacza to, że wpływ prawoskrętnego pola torsyjnego na produkcję wolnych rodników tlenowych nie jest uzależniony od wyjściowego stanu granulocytów (próba 1) ani od ich wyjściowej zdolności do aktywacji (próba 2).
Wyniki testu kolejności par Wilcoxona poszczególnych próbek dla różnych odległości przedstawia tabela 6.
Z powyższej tabeli wynika, że ważne dla badań poziomy istotności prób (1 i 3) oraz (2 i 4) są nieistotne statystycznie za wyjątkiem różnicy 2 i 4 dla odległości 6,5 cm. Poza tą jedną zależnością w pozostałych przypadkach brak jest reakcji granulocytów na FTP, zarówno w próbach niestymulowanych Δ(1-3) jak i stymulowanych PMA Δ(2-4). Dla odległości 6,5 cm występuje reakcja granulocytów stymulowanych PMA na FTP. Efekt zauważyć można na wykresie ramowym poszczególnych prób dla odległości 6,5 cm (ryc. 4), jak również w wartościach średnich próbek 2 i 4 przy tej samej odległości (tab. 1). Pole FTP zwiększa wytwarzanie wolnych rodników w aktywowanych granulocytach przy odległości aplikatora 6,5 cm.
Ryciny 4, 5, 6 przedstawiają rozkłady poszczególnych prób dla zbadanych odległości. Widać wyraźnie, że w przypadku odległości 3,5 cm i 12,5 cm nie zachodzą żadne zmiany w odpowiedzi PMTG na FTP. Natomiast dla odległości 6,5 cm zauważamy różnicę w rozrzucie próby 2 w porównaniu z próbą 4. Potwierdza to wcześniej przedstawione spostrzeżenia (tab. 4), że jest to zależność istotnie statystyczne.
Ryc. 4. Wykres rozkładu wartości fluorescencji DCF poszczególnych prób przy odległości R1.
Ryc. 5. Wykres rozkładu wartości fluorescencji DCF poszczególnych prób przy odległości R2.
Ryc. 6. Wykres rozkładu wartości fluorescencji DCF poszczególnych prób przy odległości R3.
5. Dyskusja
Do celów szczegółowych wykonanych badań można zaliczyć określenie wpływu FTP na zmianę wielkości wybuchu oddechowego w granulocytach stymulowanych PMA, zależność odległości źródła FTP od przedmiotu badań oraz pośrednią ocenę koncentracji wiązki FTP wytwarzanej przez generator fal torsyjnych.
Wielką trudnością dla autorów omawianej pracy w interpretacji uzyskanych wyników był brak literatury specjalistycznej dotyczącej podobnej tematyki badań.
Z badań podanych w niniejszej pracy wynika, że istnieje istotny statystycznie wpływ FTP na wielkość wybuchu oddechowego w granulocytach przy odległości 6,5 cm źródła od przedmiotu badań. Podobnego wpływu FTP na wielkość wybuchu oddechowego nie zaobserwowano przy odległości 3,5 cm, oraz przy 12,5 cm. Taki charakter oddziaływania FTP na wybuch oddechowy granulocytów, uwzględniając dodatkowo warunki geometryczne probówek z krwią danego cytofluorymetru przepływowego, wskazywałaby na „dwustożkowość” wiązki fal torsyjnych wytwarzanych w generatorze. Powyższą sugestię można zilustrować na rycinie 7 A, B i C.
Ryc. 7. Ilustracja graficzna sugerowanej „dwustożkowatości” wiązki fal tosyjnych (FTP)i jej wpływu na wybuch oddechowy granulocytów. Przypadki A, B, C ilustrują różne warianty wzajemnego położenia „ogniska” FTP oraz przedmiotu badań (krwi).
Oznaczenia dla A, B i C są takie same, gdzie:
1 – generator FTP
2 – powierzchnia czołowa generatora FTP
3 – probówka
4 – krew
5 – miejsce maksymalnej koncentracji FTP („ognisko”)
6 – wiązka fal FTP
Przyjęcie tezy „dwustożkowatości” wytwarzanych w generatorze fal torsyjnych ma wpływ na ich terapeutyczne wykorzystanie. W konsekwencji oznacza to, iż skuteczne oddziaływanie FTP na tkanki głębokie wymaga położenia powierzchni czołowej generatora na skórze organizmu żywego. W sytuacji przeciwnej należy oddalić powierzchnię czołową generatora od skóry organizmu żywego.
Powyższe stwierdzenia są uprawnione, ponieważ z badań wynika jednoznacznie, że FTP działają na wzbudzone przez PMA granulocyty gdy odległość generatora FTP wynosi około 6,5 cm od powierzchni przedmiotu badań.
Uważamy, że należy poddać dalszym analizom wpływ FT na różne zjawiska życiowe, a wyniki zamieszczone w niniejszej pracy traktujemy jako wstępne do szerszych wnikliwych badań.
6. Wnioski
Na podstawie uzyskanych wyników badań można sformułować następujące wnioski:
1. zaobserwowano wpływ FTP na wzrost wielkości wybuchu oddechowego w granulocytach krwi obwodowej, które spowodowały zwiększenie wytwarzania ROS przez granulocyty stymulowane PMA,
2. istotny statystycznie wzrost wielkości wybuchu oddechowego występuje przy odległości 6,5 cm powierzchni czołowej generatora od przedmiotu badań,
3. uzyskane wyniki badań sugerują przyjęcie tezy „dwustożkowości” koncentrowanych w generatorze fal torsyjnych, która ma znaczenie praktyczne w zastosowaniach terapeutycznych fal torsyjnych prawoskrętnych.
Piśmiennictwo
1. Akimov A., Shipov G.: Torsion fields and experimental manifestation, Proc. Internat. Conf. on New Ideas in Natural Sciences, St. Petersburg, June 1996, s. 221.
2. Akimov A., Tarasenko V.: Models of polarized states of the physical vacuum and torsion fields, Sov. Phys. J., March 1992, s. 214.
3. Bagrov V., et al.: Possible manifestations of the torsion field, Sov. Phys. J., march 1992, s. 208.
4. DeSabbata V., Gasperini M.: Torsion production by electromagnetic fields, Lett. Nuovo Cimento, march 1981,vol. 30, no. 12, s. 363.
5. Gołąb J., Jakóbisiak M.: Lasek W. (red.) Immunologia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002.
6. Nielsen O.H., Ahnefelt-Ronne I.: Inflammation and free oxygen radicals, Ugeskr Laeger. 1989 Apr 17; 151(16): 976-8
7. Ptak W., Ptak M.: Podstawy immunologii, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1999.
8. Ribeiro L.M., Oxygen free radicals in medicine (I), Acta Meed Port. 1989 Mar-Apr, 2(2): 93-102.
9. Shipov G.I.: Teorija fiziczieskowo wakuma, Wydawnictwo Nauka, Moskwa 1997.
10. Walrand S., Valeix S., Rodriquez C., Ligot P., Chassogne J., Vasson M.P.: Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes, Clin Chim Acta. 2003 May; 331(1-2): 103-10.
11. Zielińska M., Fenrych Wł., Kostrzewa A., Wiktorowicz K.: Cytometryczny pomiar produkcji nadtlenku wodoru, Diag. Lab. 1997 T. 33 nr 1 s.47-57.
otrzymano: 2005-12-16
zaakceptowano do druku: 2005-12-28

Adres do korespondencji:
Prof. zw. dr hab. Feliks Jaroszyk
ul. Fredry 10, 61-701 Poznań

Balneologia Polska 1/2006