Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Pediatria 4/2010, s. 124-127
*Paweł Łaguna1, Maciej Trzaska2
Charakterystyka i podział rekombinowanych preparatów krzepnięcia zarejestrowanych w Polsce w leczeniu hemofilii A i B z uwzględnieniem nowej klasy czynnika uzyskiwanego z komórek ludzkich
Characteristics and generation of recombinant factor concentrates in the treatment of haemophilia A and B registered type of clotting factor derived from human cells
1Katedra i Klinika Pediatrii Hematologii i Onkologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Katedry i Kliniki: prof. dr hab. n. med. Michał Matysiak
2Octapharma AG S.A. Przedstawicielstwo w Polsce
Summary
Developments in haemophilia treatment during last 30 years are an example of spectacular medical success. The introduction of new drugs in clinical practice and treatment of children, as well as regular prophylaxis, has made a significant improvement in patients quality of life. Progress has been observed not only in methods of treatment but also in factor concentrates. Lyophilised plazma-derived factors were followed by recombinant factors. New generations of these recombinant factors differed amongst themselves by amounts of plasma content. As a result, virological safety of rFVIII concentrates in replacement therapy in haemophilia. A patients has greatly improved and the risk of blood-borne pathogen transmission in these patients has virtually been abolished. Currently clinical studies are being performed on a new generation of recombinant products fully derived from human cells. This article reviews characteristics of different generations of recombinant factors VIII and IX registered in Poland.
WSTĘP
Wzrastająca ilość zakażeń wirusem HIV, która pod koniec lat 70. i na początku lat 80. dotknęła populację pacjentów z hemofilią, stała się impulsem do rozpoczęcia prac nad opracowaniem rekombinowanych czynników krzepnięcia (1, 2). Zakażenia wirusem HIV w tej grupie chorych były efektem stosowania głównie nisko oczyszczonych, osoczopochodnych czynników krzepnięcia, a także braku rutynowych testów wykrywających obecność wirusa HIV i innych patogenów mogących przenosić się przez krew i jej składniki (3).
W 1984 roku udało się po raz pierwszy sklonować gen kodujący białko czynnika VIII (4) i wprowadzić go do komórek jajowych chomika chińskiego (CHO – Chinese hamster ovary), co dało początek działaniom zmierzającym do produkcji rekombinowanych czynników krzepnięcia. Powtarzalny proces namnażania komórek odbywa się w bioreaktorach w kontrolowanych warunkach fizyko-chemicznych. Podział czynników rekombinowanych stosowanych w leczeniu hemofilii A i B na poszczególne klasy związany jest z technologią ich wytwarzania i uwzględnia stopień zawartości składników osoczopochodnych lub zwierzęcych. Wspólnym mianownikiem dotychczas zarejestrowanych w Polsce czynników rekombinowanych jest wykorzystanie do ich produkcji komórek zwierzęcych (jajniki i komórki nerki chomika).
Rekombinowane czynniki krzepnięcia I generacji
Preparaty te zostały wprowadzone do praktyki klinicznej w późnych latach 80. Przykładem takiego czynnika zarejestrowanego w Polsce jest Recombinate. Do jego wytwarzania używane są albuminy zarówno zwierzęce (proces hodowli komórkowej w bioreaktorze), jak i ludzkie (jako stabilizator gotowego leku). W biotechnologicznym procesie produkcji staranna selekcja zwierząt oraz rygorystyczne zasady oczyszczania ograniczają do minimum ryzyko przeniesienia czynników zakaźnych (5, 6). Albumina ludzka uzyskiwana jest z osocza ludzkiego metodą frakcjonowania Cohna. Proces produkcji tego czynnika zapewnia bezpieczeństwo chorym, o czym świadczy fakt, iż do tej pory nie jest znany ani jeden przypadek przeniesienia wirusa HIV, HBV i HCV tą drogą (7).
Tabela 1. Porównanie generacji czynników rekombinowanych.
GeneracjaProduktLinia komórkowaProdukowane białkoOsoczowe lub zwierzęce składniki wykorzystywane do hodowli komórekStabilizatorTechnologia oczyszczania i inaktywacji wirusówZarejestrowane w Polsce wskazania do stosowania
I generacjaRecombinate (12)CHOCzynnik VIIITakAlbumina ludzkaChromatografia immunoabsorbcyjna; Nanofiltracja; Chromatografia jonowymienna (kationowa i anionowa)Leczenie i profilaktyka krwawień u chorych na ­hemofilię A (wrodzony niedobór czynnika VIII)
II generacjaKogenate (13)BHKCzynnik VIIITakSacharoza, Polisorbat 80Chromatografia immunoabsorbcyjna; Nanofiltracja; Chromatografia jonowymienna (kationowa i anionowa); Metoda solvent/detergentLeczenie i profilaktyka krwawień u chorych na ­hemofilię A (wrodzony niedobór czynnika VIII)
III generacjaAdvate (14)CHOCzynnik VIIINieMannitol, Polisorbat 80Chromatografia immunoabsorbcyjna; Nanofiltracja; Chromatografia jonowymienna (kationowa i anionowa)Leczenie i profilaktyka krwawień u pacjentów z ­hemofilią A (wrodzony niedobór czynnika VIII)
Refacto AF (15)CHOCzynnik VIII pozbawiony domeny BNieSacharoza, Polisorbat 80Chromatografia jonowymienna; Metoda solvent/detergent; Chromatografia immunoabsorbcyjna z wykorzystaniem syntetycznego ligandu; NanofiltracjaLeczenie i profilaktyka krwawień u pacjentów z ­hemofilią A (wrodzony niedobór czynnika VIII)
BeneFIX (16)CHOCzynnik IXNieSacharoza, Polisorbat 80Chromatografia jonowymienna; Metoda solvent/detergent; NanofiltracjaLeczenie i zapobieganie krwawieniom u pacjentów z hemofilią B (wrodzony niedobór czynnika IX)
 

Wskazania w trakcie badań

IV generacjaHuman-cl rhFVIII (19)HEK 293FCzynnik VIII pozbawiony domeny BNieMetoda solvent/detergent; Nanofiltracja (Planova 20)Leczenie i profilaktyka krwawień u pacjentów z hemofilią A (wrodzony niedobór czynnika VIII). Profilaktyka krwawień po zabiegach chirurgicznych
Rekombinowane czynniki krzepnięcia II generacji
Proces produkcji tej grupy czynników zbliżony jest do metody uzyskania czynników I generacji. W stosunku do niej wyeliminowano zawartość albuminy ludzkiej w gotowym produkcie. Albumina ludzka została zastąpiona sacharozą, co wpływa na podwyższenie bezpieczeństwa mikrobiologicznego gotowego leku (8). Przykładem tej klasy czynnika krzepnięcia zarejestrowanego w Polsce jest Kogenate.
Rekombinowane czynniki krzepnięcia III generacji
W porównaniu do poprzedniej klasy czynników, po raz kolejny poprawiono margines bezpieczeństwa przed potencjalnymi zakażeniami patogenami. Z całego etapu przygotowania, produkcji i formulacji czynnika wyeliminowano dodatek jakichkolwiek komponentów osoczopochodnych zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych (9, 10). Reprezentantem tej klasy czynników krzepnięcia zarejestrowanego w Polsce jest na przykład Refacto AF.
Rekombinowane czynniki krzepnięcia IV generacji
Rekombinowane czynniki krzepnięcia IV generacji stanowią zupełnie nową klasę preparatów będącą obecnie w trakcie badań klinicznych w wielu krajach, w tym w Polsce. Rekombinowany czynnik VIII IV generacji pozbawiony domeny B, jako pierwszy na świecie uzyskiwany jest z komórek ludzkich (Human-cl rhFVIII). Medium hodowlane stanowią komórki HEK 293F (Human Embrionic Kidney). Komórki te pochodzą z embrionalnej tkanki nerki ludzkiej. W celu uzyskania nieśmiertelnych klonów komórki te zmodyfikowano genami pochodzącymi z adenowirusów. Następnym etapem syntezy była transfekcja z wykorzystaniem ludzkiego cDNA kodującego wytwarzanie czynnika VIII. W drodze selekcji, do dalszej hodowli wybrano klon oznaczony numerem 293. Jest on przystosowany do trwałego wytwarzania ludzkiego czynnika krzepnięcia VIII oraz do wzrostu na pożywkach wolnych od dodatków komponentów osoczopochodnych lub zwierzęcych, tzw. serum free (F). Jako substraty wzrostowe służą białka pochodzenia roślinnego (tzw. peptony) będące głównie źródłem związków azotowych oraz rekombinowana insulina ludzka (11).
Podstawową przewagą czynnika krzepnięcia uzyskanego z komórek ludzkich (IV generacji) nad czynnikami uzyskiwanymi z komórek zwierzęcych jest wykorzystanie ludzkiego mechanizmu postranslacyjnej modyfikacji czynnika VIII. Dzięki temu możliwe jest uniknięcie uzyskania gotowego białka zawierającego postranslacyjne modyfikacje charakterystyczne dla gryzoni, które mogą być immunogenne dla ludzi. Postranslacyjne modyfikacje białek są charakterystyczne dla poszczególnych gatunków – to samo białko może bowiem zostać zmodyfikowane w różny sposób zależny od syntetyzujących je komórek. Różnice te dotyczą zwłaszcza glikozylacji oraz sulfonowania (17, 18).
Tabela 2. Różnice w postranslacyjnej modyfikacji czynnika z komórek Human-cl rhFVIII i gryzoni.
Zmiana postranslacyjnaKomórki ludzkie (HEK 293F)Komórki zwierzęce (CHO; BHK)
Epitop Gala1-Gal (17)BrakWystępuje
Epitop N-glikolowany kwas neuramidowy (17)BrakWystępuje
Sulfonowanie N-terminalnej tyrozyny 1680 łańcucha lekkiego (17, 18)TakNie
Sugeruje się, że całkowite sulfonowanie czynnika Human-cl rhFVIII może zwiększać powinowactwo do wiązania czynnika von Willebranda (von Willebrand factor – vWF) w porównaniu do czynników rekombinowanych, uzyskiwanych z komórek gryzoni (11). IV generacja rekombinowanego czynnika VIII (Human-cl rhFVIII) jest chromatograficznie zgodna z naturalnym, osoczopochodnym czynnikiem krzepnięcia Octanate (Octapharma) (17). Również porównanie danych farmakokinetycznych z dostępnymi obecnie produktami rekombinowanymi nie wykazuje istotnych różnic w aktywności rekombinowanego czynnika VIII IV generacji (11, 19). Dzięki postranslacyjnym modyfikacjom rekombinowanego czynnika VIII zachodzącym w komórkach ludzkich, postuluje się potencjalnie mniejszą immunogenność takiego czynnika w porównaniu do aktualnie dostępnych produktów rekombinowanych (11, 20). Może mieć to ogromne znaczenie dla chorych na hemofilię A, dla których w chwili obecnej największym problemem terapii jest możliwość wystąpienia inhibitora. Powikłanie to, będące wynikiem powstawania przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikowi VIII, powoduje liczne komplikacje zdrowotne związane z nawracającymi wylewami, ale także powoduje znaczące zwiększenie nakładów na leczenie związane z podaniem leków omijających inhibitor lub z terapią neutralizującą występowanie inhibitora (21). Wprowadzenie nowej generacji czynników rekombinowanych VIII pochodzących z komórek ludzkich wywoła zapewne na nowo dyskusję dotyczącą porównania immunogenności poszczególnych klas czynników krzepnięcia (22), a już szczególnie porównania między sobą czynników rekombinowanych, w tym rekombinantów do czynników osoczopochodnych. Jest to bowiem temat niezmiennie przewijający się w piśmiennictwie medycznym (23-25). Jak dotąd, dostępne badania wykazują, iż częstotliwość występowania inhibitora u chorych leczonych za pomocą rekombinowanych czynników krzepnięcia waha się od 15 do 38% (26, 27). Wysoki odsetek wywołania inhibitora notuje się zwłaszcza u pacjentów uprzednio nieleczonych (28, 29), poniżej 6. m.ż. (30). Z drugiej strony stwierdzić należy, iż zgodnie z aktualnymi zaleceniami dotyczącymi leczenia dzieci z hemofilią, w wielu krajach preparaty rekombinowane są lekami z wyboru. Dotyczy to zwłaszcza Ameryki Północnej oraz państw europejskich dotkniętych wcześniej przez problemy z HIV wśród populacji pacjentów z hemofilią (31-33). Także polskie zalecenia sugerują stosowanie u chorych na hemofilię rekombinowanych czynników krzepnięcia (34). Wprowadzenie nowej, IV generacji czynników krzepnięcia, może zatem wpłynąć na redukcję immunogenności wśród tej grupy pacjentów.
Kolejną potencjalną zaletą wprowadzenia rekombinowanych czynników krzepnięcia uzyskanych z komórek ludzkich jest możliwość uniknięcia przeniesienia zakaźnych patogenów zwierzęcych na ludzi. Choć ryzyko takie praktycznie jest bardzo małe, w przeszłości notowano jednak przypadki zakażeń czynnikami chorobotwórczymi poprzez leki rekombinowane uzyskiwane z komórek CHO (35, 36). Nowym przykładem kontaminacji mikrobiologicznej leków rekombinowanych, zaobserwowanym w 2009 r., jest przypadek leków Fabrazyme i Cerezyme produkowanych przez firmę Genzyme. Technologia produkcji obu leków oparta jest również o komórki CHO, wykorzystywane do syntezy rekombinowanych czynników krzepnięcia. Za każdym razem czynnikiem zakaźnym był ten sam wirus – Vesivirus 2117. Patogen ten nie jest groźny dla ludzi, niemniej skutecznie zakłócił produkcję obu leków (37). Wprowadzenie rekombinowanych czynników krzepnięcia IV generacji produkowanych przez komórki ludzkie będzie dodatkowym buforem bezpieczeństwa mikrobiologicznego dla pacjentów z hemofilią.
W II i III kwartale bieżącego roku odbyły się w Polsce pierwsze w historii przetargi na zakup rekombinowanych czynników krzepnięcia, co najmniej II generacji. Jest to kolejny milowy krok w leczeniu hemofilii w Polsce, po wprowadzeniu w 2008 leczenia profilaktycznego u dzieci do 18. r.ż. Zgodnie z programem lekowym opublikowanym przez NFZ, czynniki rekombinowane stosowane będą w pierwotnej profilaktyce krwawień nowo zdiagnozowanych dzieci z ciężką postacią hemofilii A i B, które nie były dotychczas leczone preparatami osoczopochodnymi (38). Ewentualne założenie centralnego portu żylnego dla tej grupy pacjentów będzie również wykonywane w osłonie czynnika rekombinowanego. Według danych uzyskanych z Zakładu Zamówień Publicznych, do końca 2010 r. programem leczenia tą grupą preparatów objętych będzie 5 dzieci z hemofilią A i 2 z hemofilią B. Należy mieć nadzieję, że w ramach dalszej poprawy jakości leczenia tej grupy pacjentów, w przyszłości podstawę terapii stanowić będą czynniki uzyskiwane z komórek ludzkich. Dzięki wykorzystaniu takich samych postranslacyjnych modyfikacji czynnika VIII jak w komórkach ludzkich, produkt ten jest bowiem całkowicie wolny od dodatków pochodzących z gryzoni. Dlatego Human-cl rhFVIII może mieć potencjalne korzyści w stosunku do aktualnych generacji czynnika dla chorych z hemofilią A ze względu na niższe ryzyko przeniesienia ewentualnych czynników zakaźnych, a przede wszystkim mniejszą immunogenność.
Piśmiennictwo
1. Pipe SW: Implication of emerging pathogens in the management of haemophilia. Haemophilia 2006; 12 (Suppl 1): 1-2. 2. Arnold DM et al.: Mortality Rates and Causes of Death among all HIV – positive individuals with Heamophilia in Canada over 21 Years of Follow-up. Blood 2006; vol. 108 no 2. 3. Evatt B: Infectious Disease in the Blood Supply and the Public Health Response. Semin Hematol 43 (suppl 3): S4-S9, 2006. 4. Toole JJ et al.: Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature 1984; 312 (5992): 342-347. 5. Koplove HM: Cell Culture and Purification Process – Purity and Safety Testing. Recombinate Technology Issues, Springer-Verlag 1994, USA. 6. Kaufman, et al.: Synthesis, Processing, and Secretion of Recombinant Human Factor VIII Expressed in Mammalian Cells. The Journal of Biological Chemistry May 5 1988; Vol. 236, No. 13: pp. 6352-6362, USA. 7. Tabor E: The epidemiology of virus transmission by plasma derivatives: clinical studies verifying the lack of transmission of hepatitis B and C viruses and HIV type 1. Transfusion 1999, Volume 39, p. 1160-8. 8. Lusher JM, Scharrer I: Evolution of recombinant factor VIII safety: Kogenate and Kogenate FS/Bayer. Int J Hematol 2009; 90 (4): 446-454. 9. Pipe S: Antihemophilic factor (recombinant) plasma/albumin-free method for the management and prevention of bleeding episodes in patients with hemophilia A. Biologics 2009; 3: 117-125. 10. Blanchette VS et al.: For the rAHF-PFM Clinical Study Group. Plasma and albumin-free recombinant factor VIII: pharmacokinetics, efficacy and safety in previously treated pediatric patients. J Thromb Haemost 2008; 6: 1319-26. 11. Symposium ?From human to humans – Introducing the first recombinant human F VIII product produced from a human cell line? at the International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) Congress in Boston, Massachusetts, USA, July 15, 2009. Sponsored by Octapharma AG, Lachen, Switzerland. 12. http://www.baxter.com.pl/downloads/charakterystyki/BioScience/Recombinate_250_IU.pdf (Recombinate – Sprawdzono dnia 10.11.2010). 13. http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000275/WC500044445.pdf (Kogenate – Sprawdzono dnia 10.11.2010). 14. http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR_Product_Information/human/000520/WC500022467.pdf (Advate – Sprawdzono dnia 10.11.2010). 15. http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000232/WC500049008.pdf (Refacto AF – Sprawdzono dnia 10.11.2010). 16. http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000139/WC500020390.pdf (BeneFIX – Sprawdzono dnia 10.11.2010). 17. Sandberg H, Ramström M, Stenlund Pet al.: Product Characteristic of Human Cell Line Recombinant Factor VIII, (Human-cl rhFVIII). Poster presented at WFH, Buenos Aires 2010. 18. Leyte et al.: J Biol. Chem., vol 266, 740-746, 1991. 19. Zozulya N et al.: Pharmacokinetic, Efficacy and Safety Data of the First Recombinant F VIII From a Human Cell Line. 20. Kobayashi T, Ezzelarab M: Curr Opin Organ Transplant 2006; 11: 154-9. 21. Gringeri A et al.: Cost of care and quality of life for patients with hemophilia complicated by inhibitors: the COCIS Study Group. Blood 2003; 102: 2358-63. 22. Iorio A et al.: Rate of inhibitor development in previously untreated hemophilia A patients treated with plasma-derived or recombinant factor VIII concentrates: a systematic review. J Thromb Haemost 2010; 8: 1256-65. 23. Gouw SC et al.: Recombinant vs. plas – ma-derived factor VIII products and the development of inhibitors in pre-viously untreated patients with severe hemophilia A: the CANAL cohort study. Blood 2007; 109: 4693-4697. 24. Zdziarska J et al.: Właściwości lecznicze i bezpieczeństwo stosowania rekombinowanych preparatów czynników VIII i IX krzepnięcia. Polskie Archiwum Medycyny Wewnętrznej 2009; Vol. 119 (6). 25. Franchini M, Lippi G: Recombinant Factors VIII Concentrates. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2010; Vol. 36, N. 5. 26. Kreuz W et al.: Full-length sucrose-formulated recombinant factor VIII for treatment of previously untreated or minimally treated young children with severe haemophilia A: results of an international clinical investigation. Thromb Haemost 2005; 93: 457-467. 27. Rothschild C et al.: French previously untreated patients with severe hemophilia A after exposure to recombinant factor VIII: incidence of inhibitor and evaluation of immune tolerance. Thromb Haemost 1998; 80: 779-83. 28. Goudemand J et al.: Influence of the type of factor VIII concentrate on the incidence of factor VIII inhibitors in previously untreated patients with severe hemophilia A. Blood 2006; 107: 46-51. 29. Mannucci PM et al.: Factor VIII products and inhibitor development: the SIPPET study (survey of inhibitors in plasma-product exposed toddlers). Haemophilia (2007); 13 (Suppl. 5), 65-68. 30. Chalmers EA et al.: Early factor VIII exposure and subsequent inhibitor development in children with severe haemophilia A. Haemophilia 2007; 13: 149-55. 31. Association of Hemophilia Clinic Directors of Canada. Clinical Practice Guidelines. Hemophilia and von Willebrand disease. CMAJ 1995; 153: 147-157. 32. MASAC recommendations concerning the treatment of hemophilia and other bleeding disorders, revised October 2006 (Document #177), National Hemophilia Foundation. 33. Batlle J et al.: Consensus opinion for the selection and use of therapeutic products for the treatment of hemophilia in Spain. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19: 333-340. 34. Windyga J et al.: Polskie zalecenia postępowania we wrodzonych skazach krwotocznych na tle niedoboru czynników krzepnięcia. Część I: Zasady postępowania w hemofilii A i B. Acta Haematol Pol 2008; 39: 537-564. 35. Burstyn DG: Contamination of genetically engineered Chinese hamster ovary cells. Dev Biol Stand 1996; 88: 199-203. 36. Minor PD: Are recombinant products really risk free? Haemophilia 2001; 7: 114-116. 37. EMEA statement: Doc. Ref. EMEA/510766/2009. 38. http://www.nfz.gov.pl/new/index.php?katnr=3&dzialnr=12&artnr=4075 Sprawdzono dnia 10.11.2010.
otrzymano: 2010-11-03
zaakceptowano do druku: 2010-12-06

Adres do korespondencji:
*Paweł Łaguna
Katedra i Klinika Pediatrii Hematologii i Onkologii WUM
ul. Marszałkowska 24, 00-579 Warszawa
tel.: (22) 621-53-62
e-mail: skazy@litewska.edu.pl

Nowa Pediatria 4/2010
Strona internetowa czasopisma Nowa Pediatria