Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 3/2011, s. 217-221
*Anna Andrzejewska1, Jan W. Długosz2
Udział mikroskopii elektronowej w badaniach nad patogenezą ostrego zapalenia trzustki
The significance of electron microscopy in elucidation of pathogenesis of acute pancreatitis
1Zakład Patomorfologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. med. Lech Chyczewski
2Klinika Gastroenterologii i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. Andrzej Dąbrowski
Streszczenie
Ogólnie przyjmuje się, że ostre zapalenie trzustki (ozt) jest chorobą, w której trzustka ulega uszkodzeniu przez własne enzymy trawienne. Mechanizmy odpowiedzialne za wewnątrzkomórkową aktywację enzymów nie są do końca wyjaśnione. W pracy dokonano przeglądu badań ultrastrukturalnych, które były najbardziej istotne w badaniach nad patogenezą ozt. Przedstawiono ultrastrukturalne dowody na potwierdzenie najważniejszych hipotez patogenetycznych: kolokalizacji i autofagii. Podkreślono rolę badań ultrastrukturalnych w powiązaniu zaburzeń w mikrokrążeniu trzustkowym z nasileniem choroby, jak również w potwierdzeniu roli rodników tlenowych w patogenezie ozt.
Summary
Acute pancreatitis is generally believed to be a disease in which the pancreas is injured by digestive enzymes that it normally produces. The mechanisms responsible for intracellular activation of digestive enzyme zymogens have not been elucidated with certainty. This paper reviews the ultrastructural changes in acinar pancreatic cells which have been the most significant in elucidation of pathogenesis of acute pancreatitis. This review focuses on the ultrastructural evidences supporting the validity of the main pathogenetic hypotheses: co-localization and autophagy. The paper emphasizes the role of ultrastructural studies in the connection of pancreatic microcirculation disturbances with severity of disease and the importance of oxygen radicals in the pathogenesis of acute pancreatitis.
Ostre zapalenie trzustki (ozt) wg koncepcji przyjętej przez wielu badaczy jest chorobą z samotrawienia charakteryzującą się proteolityczną destrukcją miąższu, martwicą ścian naczyń krwionośnych prowadzącą do krwotoków, martwicą tkanki tłuszczowej oraz odczynem zapalnym. Powszechnie przyjmuje się, że kluczowym mechanizmem w patogenezie ozt jest przedwczesna aktywacja trypsynogenu, która zapoczątkowuje sekwencję zdarzeń prowadzących do wewnątrzkomórkowej aktywacji enzymów trzustkowych. Fizjologicznie trawienne enzymy trzustkowe zawarte w ziarnistościach zymogenu są odseparowane od enzymów lizosomalnych „zamkniętych” w lizosomach. W warunkach prawidłowych niektóre z enzymów trawiennych, np. amylaza, lipaza, DNAaza, RNAaza są wydzielane przez komórki trzustkowe w formie aktywnej, ale inne, potencjalnie niebezpieczne, np. trypsyna, chymotrypsyna, fosfolipaza, elastaza, karboksypeptydaza są syntetyzowane jako nieaktywne proenzymy, których aktywacja zachodzi dopiero po ich przejściu do dwunastnicy, gdzie enterokinaza aktywuje trypsynogen do trypsyny, która z kolei katalizuje aktywację innych proenzymów.
Tak więc zasadniczym problemem stało się wyjaśnienie, jakie zmiany zachodzą w komórkach trzustkowych we wczesnych okresach ozt, które doprowadzają do wewnątrzkomórkowej aktywacji enzymów. Było to impulsem do przeprowadzenia wielu badań nie tylko biochemicznych i czynnościowych, ale również morfologicznych, w tym ultrastrukturalnych przy użyciu eksperymentalnych modeli ozt. Jedną z ważniejszych hipotez jest tzw. hipoteza kolokalizacji (co-localization hypothesis) (1). Punktem wyjścia do jej powstania były głównie badania ultrastrukturalne. Przy użyciu techniki freeze fracture i mikroskopii elektronowej wykazano, że najwcześniejsze zmiany ultrastrukturalne w doświadczalnym obrzękowym ceruleinowym ozt dotyczą błon ziarnistości zymogenu i błon plazmatycznych komórek pęcherzykowych trzustki (2). Stwierdzono, że blokada egzocytozy ziarnistości zymogenu, upośledzenie dojrzewania wakuoli zagęszczających (normalnie proces ten prowadzi do segregacji enzymów trawiennych i lizosomalnych) oraz zlewanie się ziarnistości zymogenu prowadziło do formowania dużych, ograniczonych błonami wakuoli wewnątrzcytoplazmatycznych, które we wszystkich stadiach swego rozwoju zawierały enzymy trawienne i lizosomalne (2, 3, 4, 5, 6, 7). Ta współlokalizacja jest istotna w rozwoju ozt ponieważ enzymy lizosomalne, takie jak np. katepsyna B są zdolne do aktywowania trypsynogenu i wyzwalania kaskady enzymów trzustkowych (8, 9). Badania ultrastrukturalne z immunolokalizacją wykazały, że aktywacja trypsynogenu ma miejsce w wakuolach cytoplazmatycznych, a powstała trypsyna jest uwalniana do cytosolu (10, 11). Rolę katepsyny B w wewnątrzkomórkowej aktywacji trypsynogenu potwierdziły ostatecznie badania Halangka i wsp. (12), którzy stwierdzili, że u myszy pozbawionych genu katepsyny ctsb gen (-) aktywność trypsyny w trzustce w indukowanym ceruleiną ozt była o ponad 80% niższa niż u zwierząt ctsb gen (+), a badania ultrastrukturalne wykazały mniejsze uszkodzenie komórek pęcherzykowych. Badania Van Acker i wsp. (13) potwierdziły, że aktywacja trypsynogenu oraz zwiększenie kruchości struktur subkomórkowych są zależne od aktywności katepsyny B. Nowe badania ultrastrukturalne połączone z immunobarwieniem w mikroskopie elektronowym wykazały uszkodzenie błon komórkowych komórek pęcherzykowych w ceruleinowym i taururocholanowym ozt co prowadziło do napływu wapnia oraz penetracji albumin i IgG do cytoplazmy (14).
Ostatnio Hashimoto i wsp. (15) zaproponowali teorię autofagii dla aktywacji trypsynogenu w ozt. Badacze ci wykonali niezwykle interesujące badania z użyciem mikroskopu elektronowego i oznaczania ekspresji microtubule-associated protein 1 light chain 3 w ozt nad rolą zjawiska autofagocytozy w aktywacji trypsynogenu w komórkach pęcherzykowych trzustki – przy pomocy tych technik wykazali, że cytoplazmatyczne wakuole powstające w komórkach pęcherzykowych w indukowanym cholecystokininą ozt mają charakter wakuoli autofagowych. W celu przeanalizowania roli makroautofagii w ozt użyli myszy pozbawionych genu autofagii (autophagy-related 5 gen) w komórkach pęcherzykowych trzustki. Okazało się, że u zwierząt tych nie rozwinęło się ozt, a tylko niewielki, ograniczony obrzęk, a aktywacja trypsynogenu była znacznie zredukowana. Wyniki te sugerują, że proces autofagocytozy zwiększa dewastację komórek pęcherzykowych przez aktywację trypsynogenu do trypsyny we wczesnych stadiach ozt. Również najnowsze badania potwierdzają kluczowe znaczenie autofagocytozy ozt (16). W naszych pracach w przebiegu ozt indukowanego ceruleiną (17, 18, 19) w większości komórek pęcherzykowych trzustki obserwowaliśmy liczne, różnej wielkości wakuole – niektóre z nich zawierały łatwe do identyfikacji organelle komórkowe, takie jak częściowo zdegradowane ziarnistości zymogenu, fragmenty szorstkiej sieci śródplazmatycznej, mitochondria, w innych obserwowaliśmy tylko amorficzną zawartość i/lub błoniaste struktury (ryc. 1). Podobne, aczkolwiek bardziej nasilone zmiany stwierdzaliśmy w martwiczo--krwotocznym taurocholanowym ozt (20, 21). Obraz ten odpowiada tzw. makroautofagii, którą definiuje się jako sekwestrację części cytoplazmy obejmującą nie tylko rozpuszczalne białka, ale także organelle komórkowe do tzw. autofagosomów. Przez połączenie się z lizosomami autofagosomy stają się autolizosomami zawierającymi enzymy hydrolityczne, które nie tylko degradują sekwestrowany materiał, ale również hydrolizują trypsynogen do trypsyny (katepsyna B) (15, 22, 23). W naszych badaniach aktywacja trypsynogenu była 3-4-krotnie wyższa u zwierząt z ozt niż w grupie kontrolnej (17, 18, 20).
Ryc. 1. Fragment komórki pęcherzykowej z wakuolami autofagowymi – jedna z nich zawiera ziarnistosci zymogenu (ZZ), fragmenty sieci śródplazmatycznej, mitochondrium. Pow. x 7000. Ceruleinowe ozt. Badania własne.
Jungerman i wsp. (24) stwierdzili, posługując się badaniami ultrastrukturalnymi z użyciem p/ciał przeciw aktynie i beta-tubulinie, postępującą degradację tych białek strukturalnych w obrębie mikrotubul i mikrofilamentów – zdaniem tych badaczy jest to najwcześniejsza morfologiczna zmiana w ceruleinowym ozt, która może prowadzić do zaburzeń w segregacji, transporcie i wydalaniu enzymów trawiennych. Za zjawisko to mogą być m.in. odpowiedzialne wolne rodniki tlenowe, którym przypisuje się istotną rolę w inicjacji i rozwoju ozt (25, 26, 27, 28, 29). Zastosowanie w przebiegu doświadczalnego ozt antyoksydantów, np. tauryny (30), melatoniny (31) czy allopurinolu (32) w sposób istotny poprawiało stan organelli komórkowych w badaniu w mikroskopie elektronowym. Z przytoczonych przykładów wynika, że ocena ultrastrukturalna wniosła istotny wkład do potwierdzenia roli rodników tlenowych w patogenezie ozt.
Dzięki badaniom ultrastrukturalnym stwierdzono, że powstające w przebiegu stymulacji ceruleiną wakuole wewnątrzcytoplazmatyczne zlewają się z boczną bądź podstawną, zamiast szczytową, częścią błony plazmatycznej (ryc. 2), wydalając swoją zawartość do przestrzeni śródmiąższowej, co z kolei prowadzi do narastania obrzęku (2, 33, 34). W przestrzeni śródmiąższowej znajdowały się czasem fragmenty zniszczonych komórek pęcherzykowych z ziarnistościami zymogenu (ryc. 3). Tak więc uczynnione enzymy znajdujące się w tkance śródmiąższowej gruczołu, jak również obserwowane w mikroskopie elektronowym „wyrzucanie” ziarnistości zymogenu do tkanki śródmiąższowej mogą prowadzić do uwalniania czynników wazoaktywnych i zaburzeń w mikrokrążeniu trzustkowym, które jest uważane za istotny czynnik w patogenezie ozt (35, 36).
Ryc. 2. Wakuole wewnątrzcytoplazmatyczne zlewające się z podstawną częścią błony komórki pęcherzykowej. Pow. x 4400. Ceruleinowe ozt. Badania własne.
Ryc. 3. Fragment uszkodzonej komórki pęcherzykowej z ziarnistościami zymogenu w obrębie obrzękniętej przestrzeni śródmiąższowej (*). CL – światło naczynia krwionośnego. Pow. x 7000. Ceruleinowe ozt. Badania własne.
Badania ultrastrukturalne przyczyniły się w znacznym stopniu do powiązania zaburzeń w mikrokrążeniu trzustkowym a rozwojem ozt. Upośledzenie mikrokrążenia we wczesnych stadiach ozt może odgrywać istotną rolę w progresji zmian obrzękowych do zmian krwotocznych i/lub martwiczych. Takano i wsp. (33) stwierdzili, że połączenie ceruleinowego ozt ze stresem prowadziło do stwierdzanej ultrastrukturalnie destrukcji komórek śródbłonka oraz zakrzepicy we włośniczkach – głównie z tymi zmianami strukturalnymi w obrębie układu włośniczkowego autorzy wiązali przejście ozt obrzękowego w krwotoczne. Brackett i wsp. (37) zwrócili uwagę na obrzęk komórek śródbłonka z formowaniem elektronowo przeziernych, wpuklających się do światła naczyń bąbli (blebs), odcinkową dezintegrację naczyniowych błon podstawnych, jak również uszkodzenie mitochondriów zarówno w komórkach śródbłonka, jak i mięśni gładkich błony środkowej tętniczek w ozt indukowanym zamknięciem pętli dwunastnicy (the closed duodenal loop technique). Również nasze badania ultrastrukturalne wykazały zależność między nasileniem zmian zapalnych a stanem naczyń w trzustce. Zarówno w ceruleinowym, jak i martwiczo-krwotocznym ozt często stwierdzaliśmy znaczny obrzęk (ryc. 4), a czasem całkowitą destrukcję komórek śródbłonka, sporadyczne pękanie naczyń krwionośnych, a także obecność skupisk płytek krwi i granulocytów w świetle naczyń. Zmiany w układzie naczyniowym były zdecydowanie mniej wyrażone w obrzękowej postaci ozt.1
Ryc. 4. Znaczny obrzęk komórek śródbłonka (E). AC – komórka pęcherzykowa. Pow. x 7000. Ceruleinowe ozt. Badania własne.
Reasumując, można stwierdzić, że badanie techniką mikroskopii elektronowej zmian zachodzących na poziomie subkomórkowym w przebiegu ostrego zapalenia trzustki istotnie przyczyniło się do wyjaśniania patogenezy tego schorzenia. Szczególnie ważny, jeśli nie decydujący, wydaje się udział badań ultrastrukturalnych w wiodących hipotezach kolokalizacji i autofagii. Często zjawiska obserwowane w mikroskopie elektronowym w przebiegu ozt w komórkach pęcherzykowych trzustki inicjowały badania czynnościowe i biochemiczne zmierzające do wyjaśnienia skomplikowanych procesów zachodzących w trzustce w przebiegu zapalenia, a przez to przyczyniły się do poszukiwania jak najlepszych metod terapeutycznych.
Piśmiennictwo
1. Van Acker GJD, Perides G, Steer ML: Co-localization hypothesis: A mechanism for the intrapancreatic activation of digestive enzymes during the early phases of acute pancreatitis. World J Gastroenterol 2006; 12: 1985-1990.
2. Kern HF, Adler G, Scheele GA: Structural and biochemical characterization of maximal and supramaximal hormonal stimulation of rat exocrine pancreas. Scand J Gastroenterol suppl. 1985; 112: 20-29.
3. Saito I, Hashimoto S, Saluja A et al.: Intracellular transport of pancreatic zymogens during caerulein supramaximal stimulation. Am J Physiol 1987; 253: G517-526.
4. Watanabe O, Baccino FM, Steer ML et al.: Supramaximal caerulein stimulation and ultrastructure of rat pancreatic acinar cell: early morphological changes during development of experimental pancreatitis. Am J Physiol 1984; 246: G457-467.
5. Saluja A, Hashimoto S, Saluja M et al.: Subcellular redistribution of lysosomal enzymes during caerulein-induced pancreatitis. Am J Physiol 1987; 253: G508-516.
6. Saluja A, Saito I, Saluja M et al.: In vivo rat pancreatic acinar cell function during supramaximal stimulation with caerulein. Am J Physiol 1985; 249: G702-710.
7. Grönroos JM, Aho HJ, Hietaranta AJ et al.: Early acinar cell changes in caerulein-induced interstitial acute pancreatitis in the rat. Exp Pathol 1991; 41: 21-30.
8. Greenbaum LA, Hirshkowitz A: Endogenous cathepsin activates trypsinogen in extracts of dog pancreas. Proc Soc Exp Biol Med 1961; 107: 74-76.
9. Steer ML, Meldolesi J: Pathogenesis of acute pancreatitis. Ann Rev Med 1988; 39: 95-105.
10. Hofbauer B, Saluja AK, Lerch MM et al.: Intra-acinar cell activation of trypsinogen during caerulein-induced pancreatitis in rats. Am J Physiol 1998; 275: G352-362.
11. Sherwood MW, Prior IA, Voronina SG et al.: Activation of trypsinogen in large endocytic vacuoles of pancreatic acinar cells. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 5674-5679.
12. Halangk W, Lerch MM, Brandt-Nedelev B et al.: Role of cathepsin B in intracellular trypsinogen activation and the onset of acute pancreatitis. J Clin Invest 2000; 106: 773-781.
13. Van Acker GJ, Weiss E, Steer ML et al.: Cause-effect relationships between zymogen activation and other early events in secretagogue-induced acute pancreatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007; 292: G1738-1746.
14. Müller MW, McNeil PL, Büchler P et al.: Acinar cell membrane disruption is an early event in experimental pancreatitis in rats. Pancreas 2007; 35: e30-40.
15. Hashimoto D, Ohmuraya M, Hirota M et al.: Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells. J Cell Biol 2008; 181: 1065-1072.
16. Gukovsky I, Gukovskaya AS: Impaired autophagy underlies key pathological responses of acute pancreatitis. Autophagy 2010; 6: 428-429.
17. Andrzejewska A, Długosz JW, Augustynowicz A: Effect of endothelin-1 receptor antagonists on histological and ultrastructural changes in the pancreas and trypsinogen activation in the early course of caerulein-induced acute pancreatitis in rats. World J Gastroenterol 2005; 11: 1115-1121.
18. Andrzejewska A, Długosz JW: Differential effects of endothelins on histological and ultrastructural changes and trypsinogen activation in the secretagogue-induced acute pancreatitis in rats. Exp Toxic Pathol 2010; Epub ahead of print.
19. Andrzejewska A, Jurkowska G: Nitric oxide protects the ultrastructure of pancreatic acinar cells in the course of caerulein-induced acute pancreatitis: Int J Exp Path 1999; 80: 317-324.
20. Andrzejewska A, Długosz JW: The endothelin-1 receptor antagonists ameliorate histology and ultrastructural alterations in the pancreas and decrease trypsinogen activation in severe taurocholate pancreatitis in rats. Int J Exp Path 2003; 84: 221-229.
21. Długosz JW, Andrzejewska A, Wróblewski E et al.: Beneficial effect of iloprost on the course of acute taurocholate pancreatitis in rats and its limitation by antecedent acute ethanol intake. Exp Toxic Pathol 2003; 55: 401-409.
22. Cuervo AM: Autophagy: Many paths to the same end. Mol Cell Biochem 2004; 263:55-72.
23. Dunn WA: Studies of the mechanisms of autophagy: maturation of the autophagic vacuole. J Cell Biol 1190; 110: 1935-1945.
24. Jungermann J, Lerch MM, Weidenbach H et al.: Disassembly of rat pancreatic acinar cell cytoskeleton during supramaximal secretagogue stimulation. Am J Physiol 1995; 268: G328-338.
25. Sweiry JH, Mann GE: Role of oxidative stress in the pathogenesis of acute pancreatitis. Scand J Gastroenterol suppl. 1996; 219: 10-15.
26. Schoenberg MH, Büchler M, Beger HG: Oxygen radicals in experimental acute pancreatitis. Hepatogastroenterology 1994; 41: 313-319.
27. Schoenberg MH, Birk D, Beger HG: Oxidative stress in acute and chronic pancreatitis. Am J Clin Nutr 1995; 62: 1306S-1314S.
28. Schulz HU, Niederau C, Klonowski-Stumpe H et al.: Oxidative stress in acute pancreatitis. Hepatogastroenterology 1999; 46: 2736-2750.
29. Dąbrowski A, Konturek SJ, Konturek JW et al.: Role oxidative stress in pathogenesis of caerulein-induced acute pancreatitis. Eur J Pharmacol 1999; 377: 1-11.
30. Ates Y, Mas MR, Mas N et al.: Acinar cell ultrastructure after taurine treatment in rat acute necrotizing pancreatitis. Saudi Med J 2006; 27: 446-452.
31. Esrefoglu M, Gül M, Ateş B et al.: Ultrastructural clues for the protective effect of melatonin against oxidative damage in cerulein-induced pancreatitis. J Pineal Res 2006; 40: 92-97.
32. Brunelli A, Scutti G: An ultrastructural study to investigate the effect of allopurinol on cerulein-induced damage to pancreatic acinar cells in rat. Int J Pancreatol 1998; 23: 25-29.
33. Takano S, Kimura T, Kawabuchi M et al.: Ultrastructural study of the effects of stress on the pancreas in rats. Pancreas 1994; 9: 249-257.
34. Scheele G, Adler G, Kern H: Exocytosis occurs at the lateral plasma membrane of pancreatic acinar cell during supramaximal secretagogue stimulation. Gastroenterology 1987; 92: 345-353.
35. Sweiry JH, Mann GE: Pancreatic microvascular permeability in caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol 1991; 261: G685-G692.
36. Kelly D, Delaney C, McEntee G et al.: Correlation of ultrastructural acinar cell changes in cerulein pancreatitis with local microvascular abnormalities. B J 1989; 30: A472.
37. Brackett KA, Crocket A, Joffe SN: Ultrastructure of early development of acute pancreatitis in the rat. Dig Dis Sci 1983; 28: 74-84.
otrzymano: 2011-01-10
zaakceptowano do druku: 2011-02-22

Adres do korespondencji:
*Anna Andrzejewska
Zakład Patomorfologii Lekarskiej UM w Białymstoku
ul. Waszygtona 13, 15-269 Białystok
tel.: (85) 748-59-15
e-mail: anna.andrzejewska@poczta.fm

Postępy Nauk Medycznych 3/2011
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych