Ludzkie koronawirusy - autor: Krzysztof Pyrć z Zakładu Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków

Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 10/2011, s. 846-852
Anna B. Kubiak1, Arkadiusz Wojtasik1, Ewa Augustynowicz-Kopeć2, Anna Zabost2, Zofia Zwolska2, *Paweł Parniewski1
Genotypowanie M. kansasii metodą TRS-PCR1)
TRS-PCR-based genotyping of Mycobacterium kansasii
1Pracownia Genetyki Molekularnej, Instytut Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk w Łodzi
Kierownik Pracowni: dr hab. Paweł Parniewski, prof. IBM PAN
2Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. nadzw. dr hab. Ewa Augustynowicz-Kopeć
Streszczenie
Wstęp. W ostatnich latach obserwowany jest wzrost zachorowań wywoływanych przez prątki należące do grupy NTM, w tym Mycobacterium kansasii. Z tego względu ważne jest znalezienie odpowiedniej metody, która pozwoli na analizę epidemiologiczną zakażeń.
Materiał i metody. W badaniach wykorzystano kolekcję 48 szczepów M. kansasii, którą wstępnie zanalizowano pod kątem różnorodności profili PRA-hsp65, a następnie wygenerowano profile prążkowe za pomocą testu TRS-PCR oraz wykonano analizę jego powtarzalności.
Wyniki i wnioski. 39 z 48 szczepów na podstawie profilu PRA-hsp65 zostało zaklasyfikowanych jako M. kansasii typ I, najczęściej izolowanego od ludzi. Testy CGG-PCR i CCG-PCR dla kolekcji szczepów M. kansasii okazały się najlepsze, gdyż zróżnicowały je w największym stopniu, co potwierdzają wysokie wartości współczynnika różnicowania, zaś ich powtarzalność była na zbliżonym poziomie. Test TRS-PCR pozwolił na potwierdzenie wyniku analizy PRA-hsp65 w przypadku trzech szczepów, które według profilu PRA-hsp65 zostały zaklasyfikowane jako M. fortuitum typu I. Szczepy te grupowały się oddzielnie od szczepów M. kansasii we wszystkich analizach TRS-PCR. Otrzymane przez nas wyniki mogą świadczyć o możliwości zastosowania metody TRS-PCR w dochodzeniach epidemiologicznych dla M. kansasii, w przypadku gdy zostanie ona uzupełniona dodatkową metodą różnicowania.
Summary
Introduction. In recent years increasing number of infections caused by NTM, including Mycobacterium kansasii, has been observed. For this reason it is important to find a reliable method, which would allow to lead epidemiological investigations.
Material and methods. In our research 48 M. kasnasii strains were used, its PRA-hsp65 profiles were initially analyzed. Then we generated fingerprints using TRS-PCR method and analysed the repeatability of research results.
Results and conclusions. 39 of 48 strains were classified according to PRA-hsp65 profiles as M. kansasii type I, which is the most commonly isolated type from humans. CGG-PCR and CCG-PCR tests proved to be the best method for our collection of M. kansasii, as they allowed for the greatest distinction between the strains. It was confirmed by high values of discriminatory indices, with repeatability at very similar levels. The TRS-PCR test has allowed us to confirm the PRA-hsp65 results for three strains, which according to PRA-hsp65 database were classified as M. fortuitum type I. These strains clustered separately from M. kansasii in all TRS-PCR analyses. Achieved results may suggest that TRS-PCR method has a potential to be used in epidemiological investigations of M. kansasii but only when is supported by other method.
Wstęp
Bakterie należące do gatunku Mycobacterium kanasasii to wolnorosnące prątki należące do grupy Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM). Ich naturalnym rezerwuarem jest głównie woda wodociągowa (1, 3, 4). Prątki te były izolowane z naturalnych zbiorników wodnych, systemów dystrybucji wody pitnej, a także z gleby oraz od niektórych zwierząt rzeźnych (3, 4, 5, 6, 23). Badania oparte na analizie polimorfizmu genu hsp65 pozwalają na wyodrębnienie od 5 do 7 typów M. kansasii (1, 3, 4, 5, 6). M. kansasii jest jednym z najczęściej izolowanych NTM w USA (1, 5). Choroby płuc wywoływane przez M. kansasii obserwowane są także w innych regionach świata, w Europie, w tym w Polsce znacznie częściej na terenach zurbanizowanych niż rolnych (1, 3, 4, 6, 7, 9).
Do czynników ryzyka zakażeń wywoływanych przez M. kansasii zalicza się choroby powodujące zaburzenia czynności układu immunologicznego, powodując obniżoną odporność organizmu. Zaobserwowano zwiększone ryzyko zachorowania u osób cierpiących na pylicę płuc, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP), mukowiscydozę, choroby nowotworowe o charakterze złośliwym, AIDS oraz wśród nosicieli wirusa HIV (1, 5, 7, 3, 6, 9).
Liczba infekcji wywoływanych przez prątki należące do grupy NTM ma tendencję wzrostową (1, 2, 6, 7, 8), wskutek czego schorzenia przez nie wywoływane są istotnym problemem klinicznym. Typowanie szczepów prątków metodami biologii molekularnej jest ważnym elementem kontroli epidemiologicznej.
Konwencjonalne metody identyfikacji i diagnostyki mykobakterii są czasochłonne i wymagające dużego nakładu pracy (8, 10, 11). W identyfikacji prątków z grupy NTM powszechnie stosowana jest analiza PRA-hsp65 (8, 6, 11, 12). Wykorzystuje się również inne metody w oparciu o sekwencjonowanie wybranych fragmentów DNA, real-time PCR, a także testy hybrydyzacyjne, takie jak The AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, CA, USA), Inno LiPA Mycobacteria v2 (Innogenetics, Ghent, Belgia), GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Nehren, Germany) (8, 12, 10, 9). W celach epidemiologicznych stosuje się techniki MIRU-VNTR, rep-PCR, PFGE, RFLP, a także analizy wykorzystujące specyficzne dla danego gatunku rodzaje sekwencji insercyjnych (8, 4, 1, 15).
M. kansasii uważany jest za bardzo zróżnicowany gatunek NTM (4, 6), dlatego istnieje potrzeba skutecznej metody identyfikacji tych prątków, użytecznej również w dochodzeniach epidemiologicznych. Dotychczas nie udało się opracować łatwego i skutecznego testu epidemiologicznego dla M. kansasii. Metody oparte o analizę sekwencji 16S rDNA, amplifikację regionu pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA, badanie polimorfizmu genu kodującego białko szoku cieplnego, a także obecności sekwencji insercyjnej IS1652 nie pozwalają na dostateczne różnicowanie szczepów M. kansasii (4, 23).
W tej pracy proponujemy zastosowanie testu TRS-PCR w analizach różnicowania kolekcji szczepów M. kansasii. Trójnukleotydowe sekwencje powtórzone (TRS – trinucleotide repeat sequences) to powszechne motywy mikrosatelitarne obecne w genomach wielu gatunków drobnoustrojów (21). W przypadku szczepów M. tuberculosis CDC1551, M. tuberculosis H37Rv i M. bovis stwierdzono, że motywy (CGG)n są nadreprezentowane (22), zaś obecność różnych motywów TRS wykazano także w genomach innych gatunków baterii, np. E. coli, L. momocytogenes, M. tuberculosis, S. enterica (22). W naszych poprzednich badaniach wykorzystaliśmy test TRS-PCR do skutecznego różnicowania szczepów Mycobacterium gordonae (14) oraz uropatogennych szczepów Escherichia coli (13).
W pierwszym etapie określiliśmy przydatność testu do różnicowania kolekcji 48 szczepów M. kansasii. Spośród zastosowanych dziesięciu starterów PCR (tab. 2) wybraliśmy dwa najlepiej różnicujące – zawierające motyw CGG lub CCG. Startery te pozwalają różnicować szczepy M. kansasii, jednakże dla celów epidemiologicznych analizy takie musiałyby być uzupełnione przez dodatkowe metody różnicowania. Ponadto wykazaliśmy skuteczność różnicowania za pomocą metody CGG-PCR takich gatunków prątków jak M. avium, M. gordonae, M. kansasii, M. xenopi, M. tuberculosis i M. intracellulare.
Tabela 1. Zestawienie wyników analizy PRA-hsp65 badanych izolatów M. kansasii.
Typ PRA - hsp65Typ I M. kansasiiSzczepy nietypowalneSzczepy zaklasyfikowane jako M. fortuitum typ ISzczepy zaklasyfikowane jako M. avium typ I
Liczba szczepów39531
Tabela 2. Analiza stopnia różnicowania oraz powtarzalności testu TRS-PCR dla badanych izolatów M. kansasii.
StarterCGGCCGCAGGTCGTGCACCTGGACTCCAGG
Współczynnik różnicowania (DI)0,9430,9390,8450,7690,5830,5740,5400,452Brak produktów amplifikacjiBrak produktów amplifikacji
Powtarzalność analizy (R) (%)92,6190,8293,6193,1490,8981,2189,0192,92
Materiał i metody
Szczepy bakteryjne
W badaniach wykorzystano 48 szczepów izolowanych od chorych pochodzących z kolekcji Zakładu Mikrobiologii IGiCHP. Kolekcja ta została wstępnie zdefiniowana jako Mycobacterium kansasii na podstawie wyników testu HPLC i GenoType Mycobacterium (Hain Lifescience, Nehren, Germany). W badaniach wykorzystano również szczepy: M. avium, M. gordonae, M. kansasii, M. xenopi, M. tuberculosis i M. intracellulare (IGiChP, Warszawa).
Izolacja DNA
Izolację genomowego DNA wykonano metodą z użyciem DNAzolu oraz perełek szklanych według wcześniej opublikowanych procedur (19, 14). Wysuszony osad DNA, zawieszano w 50 μl wody destylowanej (MiliQ Plus, Milipore), a następnie doprowadzano do stężenia około 50 ng/μl.
Analiza PRA-hsp65
W pierwszym etapie dokonano amplifikacji fragmentu genu hsp65 (441 pz) według opisanej wcześniej metody (20). Reakcję PCR prowadzono w termocyklerze T-3000 (Biometra). Analizę wielkości i liczby fragmentów powstałych po trawieniu enzymami BstEII i HaeIII (Fermentas), wykonywano na podstawie rozdziałów elektroforetycznych wobec standardu wielkości fragmentów DNA – GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder (Fermantas). Typy profili PRA-hsp65 określano poprzez porównanie danych dostępnych w bazie PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.html).
Analizy TRS-PCR

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 30 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott BA et al.: On behalf of the ATS Mycobacterial Diseases Subcommittee, An Offical ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases. Am J Respir Crit Care Med 2007; Vol 175: 367-416.
2. Shin JH, Lee EJ, Lee HR et al.: Prevalence of non-tuberculous mycobqacteria in a hospital environment. Journal of Hospital Infection 2007; 65: 143-148.
3. Alcaide F, Richter I, Bernasconi C et al.: Heterogeneity and Clonality among Isolates of Mycobacterium kansasii: Implications for Epidemiological and Pathogenicity Studies. Journal of Clinical Microbiology 1997; Vol. 35, No. 8, p. 1959-1964.
4. Picardeau M, Prod’hom G, Raskine L et al.: Genotypic Characterization of Five Subspecies of Mycobacterium kansasii. Journal of Clinical Microbiology 1997; Vol. 35, No. 1: p. 25-32.
5. Zahang Y, Mann LB, Wilson RW et al.: Molecular Analysis of Mycobacterium kansasii Isolates from the United States. Journal of Clinical Microbiology 2004; Vol. 42, No. 1: p. 119-125.
6. Taillard C, Greub G, Weber R et al.: Clinical Implications of Mycobacterium kansasii Species Heterogeneity: Swiss National Survey. Journal of Clinical Microbiology 2003; Vol. 41, No. 3, p. 1240-1244.
7. Szturmowicz M, Fijałkowska A, Rowińska-Zakrzewska E et al.: Mycobacterium kansasii infection in chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH), report of two cases. Pneumolonl Alergol Pol 2004; 72: 523-529.
8. Neonakis IK, Gitti Z, Krambovitis E, Spandidos DA: Molecular diagnostic tools in Mycobacteriology. Journal of Microbiological Methods 2008; 75: 1-11.
9. Safianowska A, Walkiewicz R, Nejman-Gryz P et al.: The comparison between two methods for typing of nontuberculous mycobacteria: high pressure liquid chromatography and molecular assai GenoType Mycobacterium CM/AS. Pneumolnol Alergol Pol 2010; Vol. 78, No. 5, 363-368.
10. Richter E, Niemann S, Rusch-Gerdes S, Hoffner S: Identification of Mycobacterium kansasii by Using a DNA Probe (AccuProbe) and Molecular Techniques. Journal of Clinical Microbiology 1999; Vol. 37, No. 4: 964-970.
11. Chimara E, Ferrazoli L, Ueky SYM et al.: Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of PRA-hsp65 patterns. BioMed Central Microbiology 2008; 8: 48.
12. Sajduda A, Martin A, Portales F, Palomino JC: hsp65 PCR-restriction analysis (PRA) with capillary electrophoresis in comparison to three other methods for identification of Mycobacterium species. Journal of Microbiological Methods 2010; 80: 190-197.
13. Adamus-Bialek W, Wojtasik A, Majchrzak M et al.: (CGG) 4-Based PCR as a Novel Tool for Discrimanation of Uropoathogenic Escherichia coli Strains: Comparison with Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus – PCR, Journal of Clinical Microbiology 2009, Vol. 47, No. 12: 3937-3944.
14. Wojtasik A, Majchrzak M, Adamus-Bialek W et al.: Trinucleotide repeat sequence-based PCR as a potential approach for genotyping Mycobacerium gordonae strains. Journal of Microbiological Methods 2011; 85: 28-32.
15. Thibault VC, Grayon M, Boschiroli ML et al.: New variable-number tandem-repeat markers for typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M. avium strains: comparison with IS900 and IS1245 restriction fragment length polymorphism typing. J Clin Microbiol 2007; 45: 2404-2410.
16. Hunter PR, Gaston MA: Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J Clin Microbiol 1988; 26: 2465-2466.
17. Fangrat A, Walkiewicz R, Safianowska A et al.: Identyfication of Mycobacteriaceae species based on the hsp-65 gene polymorphism analysis by PCR-RFLP. Pneumolonl Alergol Pol 2006; 74: 95-100.
18. Tortoli E: Mycobacterium kansasii, species or complex? Biomolecular and epidemiological insights. Kekkaku 2003; 78: 705-709.
19. Madiraju MV, Qin MH, Yamamoto K et al.: The dnaA gene region of Mycobacterium avium and the replication activities of its 5’ and 3’ flanking regions. Microbiology 1999; 145: 2913-2921.
20. Telenti A, Marchesi F, Balz M et al.: Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol 1993; 31: 175-178.
21. Parniewski P, Bacolla A, Jaworski A, Wells RD: Nucleotide excision repair affects the stability of long transcribed (CTG*CAG) tracts in an orientation – dependent manner in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 1999; 27: 616-623.
22. Otsuka Y, Parniewski P, Zwolska Z et al.: Characterisation of a trinucleotide repeat sequence (CGG)5 and potential use in restriction fragment length polymorphism typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2004; 42: 3538-3548.
23. Van Soolingen D: Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements. Journal of Internal Medicine 2001; 249: 1-26.
otrzymano: 2011-08-18
zaakceptowano do druku: 2011-09-14

Adres do korespondencji:
*Paweł Parniewski
Pracownia Genetyki Molekularnej Instytut Biologii Medycznej PAN
ul. Lodowa 106, 93-232 Łódź
tel.: (42) 272-36-33
e-mail: pparniewski@cbm.pan.pl

Postępy Nauk Medycznych 10/2011
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych