© Borgis - Postępy Fitoterapii 4/2011, s. 232-237
*Robert Kubina1, Agata Kabała-Dzik1, Rafał Jakub Bułdak2, Ewa Szaflarska-Stojko1, Paweł Tylka1, Beata Bielec1, Barbara Stawiarska-Pięta1
Ocena właściwości proapoptotycznych etanolowego ekstraktu propolisu w badaniach in vitro**
The in vitro proapoptotic activities evaluation of ethanolic extract of propolis
1Katedra i Zakład Patologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
Kierownik Katedry i Zakładu Patologii: dr hab. n. med. Barbara Stawiarska-Pięta
2Katedra i Zakład Fizjologii, Wydział Lekarski z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach
Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. n. med. Krystyna Wanda Żwirska-Korczala
Summary
Modern epidemiological data prove that the majority of substances of natural origin demonstrating anticancerogenic properties are non-toxic, safe and in a longer term do not influence a human organism in a negative way. The research involved an in vitro model with the use of propolis that belongs to these substances in order to show its anti-neoplastic properties. A solution of ethanol extract of propolis (EEP) in dimethyl sulfoxide was used as a material for the research. In the conducted research, an increase in the percentage of apoptotic cells in both the case of Me45 malignant melanoma and Hct-116 colorectal cancer cell lines was observed. Used EEP with concentration of 50 μg/ml caused a 16.56% increase in the number of apoptotic cells in the case of Me45 and a 21.02% increase in the case of Hct-116. A 0.498 ng/mg increase in the concentration of caspase-8 in the Me45 malignant melanoma cell culture, to which EEP with concentration 50 μg/ml was added, was showed in relation to its concentration in the control culture. In the case of Hct-116 line, an increase of caspase concentration amounted to 0.884 ng/mg in cultures with addition of the same dose of propolis, in relation to the value in the group without propolis. The increase in apoptosis of neoplastic cell lines in vitro was higher after administration of EEP with concentration of 100 μg/ml vs. 50 μg/ml.
Wstęp
Apoptoza jest ważnym celem terapii przeciwnowotworowej, jednakże większość środków farmakologicznych stosowanych w chemioterapii indukuje apoptozę zarówno w komórkach objętych procesem nowotworowym, jak i prawidłowych, co nie jest bez znaczenia w uzyskaniu właściwego celu terapeutycznego. Modulowanie skłonności komórki do ulegania apoptozie wzbudza więc z oczywistych względów zainteresowanie onkologów. Ograniczenia wynikające ze stosowania leków przeciwnowotworowych, które uszkadzają prawidłowe komórki, przyczyniają się do poszukiwania związków, które wybiórczo wykazywałyby działanie toksyczne tylko wobec komórek nowotworowych (1).
Nowym trendem w ogólnoświatowych badaniach, związanych z apiterapią, jest szersze poznanie mechanizmów aktywności proapoptotycznej propolisu w stosunku do komórek zmienionych nowotworowo. Wielu naukowców sugeruje, że substancje biologicznie czynne zawarte w propolisie zdolne są do aktywowania szlaku programowanej śmierci komórek, który w procesie onkogenezy zostaje zahamowany. Działanie takie potwierdzono już w badaniach in vitro na komórkach nowotworowych. Aktywność taka, jak sugerują autorzy jest spowodowana synergizmem substancji chemicznych zawartych w propolisie (2).
Propolis to produkt bezpostaciowy, lepki i kleisty. Jego barwa jest zależna od surowca z jakiego się go pozyskuje. Może mieć kolor żółty, szarozielony, zielony, czerwony, brunatny, nawet czarny. Propolis ma charakterystyczny zapach, w którym wyczuwa się aromat igliwia i miodu. W Polsce, podobnie jak w krajach Europy Środkowej i Wschodniej, propolis pozyskiwany jest głównie z topoli czarnej (Populus nigra), poza tym z brzozy (Betula) i olchy (Alnus) (3-5).
Propolis zawiera w swym składzie od 50 do 80% substancji żywicznych, 8-30% wosku pszczelego, a ponadto olejki eteryczne (1-4%), wosk roślinny (6%), garbniki (10%), pyłek kwiatowy (5%) oraz substancje lipidowo-woskowe (8%). Do celów leczniczych, dietetycznych oraz w kosmetyce bardzo rzadko wykorzystuje się surowy propolis; standardowo stosowany jest jego etanolowy ekstrakt EEP (z ang. ethanolic extract of propolis). Sposób ekstrakcji został dokładnie opracowany w kilku ośrodkach krajowych (6, 7).
Do najistotniejszych związków chemicznych zawartych w EEP pozyskanym z krajowego propolisu należą flawonoidy (tylko aglikony, nie występują formy glikozydowe) oraz kwasy aromatyczne (8).
Propolis pozyskiwany przez pszczoły w różnych zakątkach świata wykazuje dużą różnorodność pod względem składu chemicznego. Jest to spowodowane strefą geograficzną, rasą pszczół, gatunkami i pochodzeniem roślin oraz zmianami klimatycznymi. Co istotne, pomimo odmienności składników, propolis zawsze odznacza się wysoką aktywnością biologiczną oraz wykazuje podobne właściwości przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, antyoksydacyjne, przeciwgrzybiczne, przeciwproliferacyjne, przeciwzapalne, immunomodulacyjne (9). Niektóre odmiany charakteryzują się zwiększoną aktywnością przeciwproliferacyjną, proapoptotyczną czy przeciwzapalną (4, 10, 11).
Ze względu na bogaty skład chemiczny, propolis wykazuje największą spośród wszystkich produktów pszczelich aktywność i skuteczność leczniczą (12). Aktywność taka jest spowodowana synergizmem substancji chemicznych zawartych w propolisie. Wpływ cytotoksyczny w badaniach z użyciem zielonego propolisu wykazali brazylijscy naukowcy w hodowlach linii komórkowej raka krtani HEp-2. Stwierdzono, że wysokie stężenia propolisu dodawane do hodowli komórkowych powodowały krótkotrwały efekt cytotoksyczny, w przeciwieństwie do niskich stężeń, gdzie aktywność ta wzrastała z czasem (2).
Przeciwproliferacyjne i proapoptotyczne działanie propolisu oraz jego składników polega m.in. na aktywacji kaspaz oraz inaktywacji genu AKT, kodującego enzymy biorące udział w procesach blokujących proces apoptozy (13).
Cel pracy
Celem prezentowanej pracy była ocena właściwości proapoptotycznych propolisu w zależności od użytych jego stężeń w stosunku do komórek raka okrężnicy oraz czerniaka złośliwego w hodowlach in vitro.
Materiał i metody
Otrzymywanie etanolowego ekstraktu z propolisu
Materiałem stosowanym do badań był etanolowy ekstrakt z propolisu. Surowy propolis (kit pszczeli) pochodził z pasieki w miejscowości Rożnowice (woj. małopolskie) w Polsce.
W celu przeprowadzenia ekstrakcji surowy propolis rozdrobniono mechanicznie. W kolbie płaskodennej umieszczono 10 g surowego propolisu oraz 100 g etanolu o stężeniu 96%. Następnie wykonano ekstrakcję surowego propolisu, polegającą na umieszczeniu zamkniętej kolby w łaźni wodnej z wytrząsarką o temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Proces ten prowadzono przez okres dwóch tygodni. Po umieszczeniu uzyskanego ekstraktu na 24 godz. w lodówce o temp. 4°C, przesączono go przez bibułę i następnie etanol odparowano w wyparce próżniowej w temp. 40°C. Otrzymaną w ten sposób ciągliwą, brunatną substancję o charakterystycznym zapachu, pozostawiono w cieplarce o temp. 37°C na okres 7 dni, w celu odparowania pozostałości etanolu. W ten sposób uzyskano suchy ekstrakt propolisu, który rozpuszczono w DMSO (dimetylosulfotlenku), tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 100 mg/ml (6).
Hodowla komórek
Doświadczenie wykonano przy użyciu następujących linii komórkowych: ludzkiego czerniaka złośliwego Me45 pochodzącego z kolekcji Centrum Onkologii w Gliwicach oraz ludzkiego raka okrężnicy Hct-116, pochodzącego z kolekcji ATCC: CCL-247.
Komórki hodowane były na podłożu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (FBS) oraz z dodatkiem odpowiedniej ilości antybiotyków i fungistatyków. Hodowla linii komórkowych odbywała się w temp. 37°C, w środowisku o wilgotności 95% przy stężeniu CO2 5%, co warunkuje utrzymanie prawidłowego pH pożywki hodowlanej. Pasażowanie wykonywano przy użyciu trypsyny w stężeniu 0,25% w PBS (phosphate buffered saline).
Na komórkach w logarytmicznej fazie wzrostu zostały wykonane dalsze doświadczenia z użyciem EEP, gdzie jako rozpuszczalnika użyto DMSO. Hodowle komórek nowotworowych prowadzono w podłożu hodowlanym, do którego dodawano EEP w warunkach sterylnych, do uzyskania końcowego stężenia propolisu: 50 lub 100 μg/ml. Równolegle wykonano hodowlę kontrolną z zastosowaniem DMSO na badane parametry. Nie wykazano istotnego statystycznie wpływu dimetylosulfotlenku na poziom kaspazy-8 oraz zmianę morfologii jąder komórkowych oraz cytoplazmy.
Ocena cytomorfologiczna komórek nowotworowych
Oznaczenia komórek apoptotycznych, nekrotycznych oraz komórek zdrowych dokonano metodą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu Apoptotic, Necrotic and Healthy Cells Quantification Kit (Biotium), zgodnie z protokołem producenta. Apoptozę oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym (Zeiss) przy użyciu odpowiedniego fluorochromu. Dla próbek inkubowanych z EEP o stężeniu 50 i 100 μg/ml oraz bez użycia EEP, wyznaczono wskaźnik apoptotyczny oraz nekrotyczny komórek, odpowiadający procentowi komórek o morfologii typowej dla komórek odpowiednio apoptotycznych oraz nekrotycznych, w stosunku do 100 ocenianych komórek w analizowanych polach widzenia (14).
Oznaczenie stężenia kaspazy-8
Do oceny stężenia kaspazy-8 wykorzystano test firmy BioVendor Research and Diagnostic Products. Wyznaczenie stężenia kaspazy-8 dokonano także zgodnie z protokołem producenta. W tym celu do hodowli komórkowych dodano EEP, którego końcowe stężenie w podłożu hodowlanym wynosiło 50 oraz 100 μg/ml. Komórki inkubowano z EEP przez 48 h, po tym czasie dokonano lizy komórek, stosując załączony do zestawu odczynnik i postępowano zgodnie z dalszymi częściami protokołu dołączonego do zestawu.
Oznaczenie białka całkowitego metodą Bradforda
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Epstein RJ. Human molecular biology: an introduction to the molecular basic of health and disease. Cambridge University Press, Cambridge 2005; 390-9. 2. Búfalo MC, Candeias JM, Sforcin JM. In vitro cytotoxic effect of Brazilian green propolis on human laryngeal epidermoid carcinoma (HEp-2) cells. Evid Based Complement Alternat Med 2007; 6:483-7. 3. Kędzia B. Pochodzenie propolisu w świetle teorii i badań naukowych. Herba Pol 2008; 54(5):179-86. 4. Bankova V. Recent trends and important developments in propolis research. Evid Based Complement Alternat Med 2005; 2(1):29-32. 5. Kędzia B, Hołderna- Kędzia E. Wykorzystanie miodu i propolisu w zakażeniach. Post Fitoter 2009; 4:202-6. 6. Kędzia B. Skład chemiczny propolisu polskiego. Cz. I. Początkowy okres badań. Post Fitoter 2009; 1:39-44. 7. Kędzia B. Skład chemiczny propolisu polskiego. Cz. II. Nowe badania. Post Fitoter 2009; 2:122-8. 8. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Produkty pszczół w medycynie. Spółdz Pszczel Apis, Lublin 2007; 25-38. 9. Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernandez-Lopes J i wsp. Functional properties of honey, propolis and royal jelly. J Food Sci 2008; 9(73):117-124. 10. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna propolisu pochodzącego z różnych rejonów świata. Post Fitoter 2006; 1:23-35. 11. Salantino A, Weinstein-Texeira E, Negri G i wsp. Origin and chemical variation of Brazilian propolis. Evid Based Complement Alternat Med 2005; 2(1):33-8. 12. Stojko A. Leczenie produktami pszczelimi (apiterapia). W: Medycyna naturalna (red. Janicki K, Rewerski A). Wyd Lek PZWL, Warszawa 2001; 105-13. 13. TramAnh P, Xiao-Min Y, Muthusamy K i wsp. Antiproliferative effect of chrysin on anaplastic thyroid cancer. J Surg Res 2011 (article in press). 14. Bednarek I, Sypniewski D, Solarz J i wsp. Zmiany w indukcji apoptozy komórek linii nowotworowej HeLa za pomocą etopozydu w obecności oligonukleotydu antysensownego dla mRNA geny Bcl-2. Wiad Lek 2008; 61:97-106. 15. Ang ES, Pavlos NJ, Chai LY i wsp. Caffeic acid phenethyl ester, an active component of honeybee propolis attenuates osteoclastogenesis and bone resorption via the suppression of RANKL-induced NF-kappaB and NFAT activity. J Cell Physiol 2009; 221(3):642. 16. Li F, Awale S, Tezuka Y i wsp. Study on the constituents of Mexican propolis and their cytotoxic activity against PANC-1 human pancreatic cancer cells. J Nat Prod 2010; 73(4):623-7. 17. Chen MJ, Chang WH, Lin CC i wsp. Caffeic acid phenethyl ester induces apoptosis of human pancreatic cancer cells involving caspase and mitochondrial dysfunction. Pancreatol 2008; 8(6):566-76. 18. Seda-Vatansever H. Propolis from Turkey induces apoptosis through activating caspases in human breast carcinoma cell lines. Acta Histochem 2010; 112:546-64. 19. Chen CN, Wu CL, Lin JK. Propolin C from propolis induces apoptosis through activating caspases, Bid and cytochrome c release in human melanoma cells. Biochem Pharmacol 2004; 67:53-66. 20. Szliszka E, Czuba ZP, Bronikowska J i wsp. Ethanolic extract of propolis augments TRAIL-induced apoptotic death in prostate cancer cells. Evid Based Complement Alternat Med 2009. 21. Szliszka E, Czuba ZP, Domino M i wsp. Ethanolic extract of propolis (EEP) enhances the apoptosis-inducing potential of TRAIL in cancer cells. Molecules 2009; 14,738-54. 22. Szliszka E, Czuba ZP, Mazur B i wsp. Chalcones enhance TRAIL-induced apoptosis in prostate cancer cells. Int J Mol Sci 2010; 11:1-13. 23. Bronikowska J, Szliszka E, Czuba ZP i wsp. The combination of TRAIL and isoflavones enhances apoptosis in cancer cells. Molecules 2010; 15, 2000-15. 24. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007; 35:495-516. 25. Zhang A, Wu Y, Lai HWL i wsp. Apoptosis – a brief review. Neurobiol 2004; 3:47-5.
