Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografię? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis – wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 10/2013, s. 743-747
*Arkadiusz Macheta, Katarzyna Radko, Agnieszka Szymczyk, Piotr Klimek, Sylwia Chocholska, Monika Podhorecka
Ocena spontanicznej apoptozy komórek nowotworowych w odniesieniu do czynników prognostycznych przewlekłej białaczki limfocytowej
Assessment of spontaneous apoptosis of neoplastic cells in relation to prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia
Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku, Uniwersytet Medyczny, Lublin
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. Anna Dmoszyńska
Streszczenie
Wstęp. Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) jest najczęstszym typem białaczki u dorosłych z charakterystyczną akumulacją niedojrzałych funkcjonalnie klonalnych limfocytów B, wykazujących zaburzenia apoptozy.
Cel pracy. Głównym celem badań jest ocena spontanicznej apoptozy komórek białaczkowych otrzymanych z krwi obwodowej pacjentów z CLL i określenie zależności między otrzymanymi wynikami a czynnikami rokowniczymi choroby.
Materiał i metody. Techniką cytometrii przepływowej w grupie 22 pacjentów określono odsetek nowotworowych komórek ulegających spontanicznej apoptozie poprzez ocenę ekspresji aktywnej kaspazy-3. Mierzony był także poziom ekspresji białek BAX i BCL-2. Zmiany cytogenetyczne określono metodą FISH. Do poszukiwania zależności między parametrami apoptozy i czynnikami rokowniczymi zastosowane zostały testy statystyczne.
Wyniki. Istnieje korelacja między parametrami spontanicznej apoptozy a limfocytozą we krwi obwodowej pacjentów.
Wnioski. Wzrost limfocytozy koreluje ze spadkiem intensywności apoptozy spontanicznej.
Summary
Introduction. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common type of adult leukemias which is characterized by the accumulation of growth arrested clonal B lymphocytes with disorders of apoptosis.
Aim. The main objective of this study is to assess the spontaneous apoptosis of leukemia cells obtained from peripheral blood of CLL patients and to determine the relationship between the results and disease prognostic factors.
Material and methods. In this study, the rate of spontaneous cell death of leukemic cells from 22 patients was examined by active caspase-3 expression using flow cytometry. The levels of BAX and BCL-2 protein expression was also measured. Cytogenetic changes were analyzed by FISH method. To explore the relationship between the parameters of apoptosis and prognostic factors statistical tests were applied.
Results. We detected a significant correlation between parameters of apoptosis and number of lymphocytes in peripheral blood.
Conclusions. The increase of lymphocytosis correlates with decreased intensity of spontaneous apoptosis.
WSTĘP
Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) jest chorobą układu chłonnego, charakteryzującą się akumulacją dojrzałych, aczkolwiek niekompetentnych limfocytów o immunofenotypie CD5+/CD19+/CD23+ z wyraźnie niskim potencjałem apoptotycznym (1, 2). Nowotwór ten występuje głównie u ludzi dorosłych, z częstością zachorowań wzrastającą wraz z wiekiem (3). Etiologia choroby nie została dotąd w pełni wyjaśniona, mimo wielu badań prowadzonych w tym kierunku (4). Przyczyn oporności na obumieranie doszukuje się m.in. w zaburzeniach ekspresji białek rodziny BCL-2. Uwagę zwraca również fakt, że nowotworowe limfocyty w środowisku in vitro, odmiennie niż in vivo, wykazują charakterystyczną zdolność spontanicznej apoptozy (5).
CEL PRACY
Celem pracy jest ocena spontanicznej apoptozy nowotworowych limfocytów u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową oraz analiza zależności uzyskanych wyników do czynników prognostycznych o uznanym znaczeniu klinicznym w tej chorobie.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono w grupie 22 pacjentów z nowo zdiagnozowaną PBL. Wyizolowane z próbek krwi obwodowej w gradiencie stężeń komórki jednojądrzaste poddano 24-godzinnej hodowli w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Zarówno komórki świeżo wyizolowane z krwi (0 h), jak i po hodowli (24 h) inkubowano według protokołu producenta z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanym przeciwko badanym strukturom (CD19, CD5, CD23, CD38, ZAP-70, BAX, BCL-2 i kaspaza-3). Analizę i akwizycję danych przeprowadzono z użyciem czterokolorowego cytometru przepływowego FACSCalibur, zliczając 10 tysięcy komórek w każdej próbce. Ustalano bramkę limfocytarną i dalsze badania prowadzono w populacji komórek o immunofenotypie CD19+/CD5+/CD23+. Oceny spontanicznej apoptozy dokonano na podstawie wartości odsetka limfocytów PBL wykazujących ekspresję aktywnej kaspazy-3 po hodowli (w 24 h) oraz stosunku wartości ekspresji białek BCL-2 i BAX (wyrażonych jako MFI – średnia wartość fluorescencji) zaraz po pobraniu materiału (0 h), jak również po dobowej inkubacji komórek (24 h).
W celu określenia nieprawidłowości cytogenetycznych komórek PBL zastosowano technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Wykorzystane zostały sondy wyznaczające regiony zmian cytogenetycznych charakterystyczne dla PBL, tj.: 17p13.1, 11q22.3, 13q13.3+13q34 oraz 12p11.1-q11.1. W wykonanych preparatach, przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, ocenie podlegało 200 jąder komórkowych.
Następnie z wykorzystaniem metod statystycznych i programu Statistica 7.0 poszukiwano współzależności pomiędzy wartościami oznaczonych białek czy ich stosunków a niektórymi czynnikami o uznanym znaczeniu rokowniczym w PBL, tj. stadium zaawansowania klinicznego według Raia, stężeniem dehydrogenazy mleczanowej i β2-mikroglobuliny, limfocytozą, ekspresją CD38 i ZAP-70 oraz charakterystycznymi zmianami cytogenetycznymi. Do określenia siły korelacji wykorzystano współczynnik rang Spearmana. Analizę porównawczą dwóch prób zmiennych niezależnych wykonano przy pomocy testu U Manna-Whitneya.
WYNIKI
Ocena procesu apoptozy spontanicznej
W przypadku odsetka komórek z ekspresją aktywnej kaspazy-3, który w komórkach wyizolowanych ze świeżo uzyskanego materiału jest bliski zeru, po 24-godzinnej inkubacji dowiedziono wyraźnie istotny wzrost odsetka limfocytów CD19+/CD5+/CD23+ wykazujących aktywność tego enzymu, determinującego nieodwracalnie wprowadzenie komórki na szlak śmierci zaprogramowanej. Badania wykazały istotne statystycznie obniżenie w populacji białaczkowych limfocytów wartości stosunku białek BCL-2/BAX (MFI) po dobowej hodowli, w porównaniu z wartością ww. stosunku oznaczonego w świeżych próbkach krwi obwodowej pacjentów. Mediana tego stosunku obniżyła się po 24-godzinnej hodowli ponad dwukrotnie, co jest prawdopodobnie efektem w szczególności obniżenia ekspresji białka o działaniu antyapoptotycznym BCL-2.
Ocena korelacji między wyznacznikami apoptozy spontanicznej a wybranymi czynnikami rokowniczymi PBL
W celu określenia wzajemnych zależności pomiędzy poszczególnymi zmiennymi przeprowadzono analizę korelacji wymierników apoptozy białaczkowych limfocytów CD19+/CD5+ z czynnikami rokowniczymi w PBL:
– stadium według Rai,
– stężeniem B2-mikroglobuliny,
– stężeniem dehydrogenazy mleczanowej,
– wartością limfocytozy.
Do opisu siły korelacji dwóch cech wykorzystano współczynnik korelacji rang Spearmana. Za istotne statystycznie przyjmowano wyniki, w przypadku których prawdopodobieństwo popełnienia błędu wynosi mniej niż 5%, a więc wtedy, gdy istotność wynosi p < 0,05.
Przeprowadzona analiza statystyczna wykazała występowanie istotnej, odwrotnej zależności między odsetkiem komórek z ekspresją kaspazy-3 w 24. godzinie hodowli a limfocytozą. Świadczy o tym oznaczony współczynnik korelacji r-Spearmana, który wyniósł -0,595709, przy współczynniku prawdopodobieństwa p < 0,05 (tab. 1, ryc. 1).
Tabela 1. Korelacja odsetka komórek z ekspresją aktywnej kaspazy-3 oraz stosunku ekspresji białek BCL-2/BAX z czynnikami rokowniczymi.
Porównywane parametryN-ważnychR-SpearmanaPoziom p
Kaspaza-3 24 h i β2-mikroglobulina
Kaspaza-3 24 h i limfocytoza
Kaspaza-3 24 h i LDH
Kaspaza-3 24 h i stadium wg Rai
21
22
21
22
-0,232543
-0,595709
-0,181877
-0,135433
NS
0,003441
NS
NS
BCL-2/BAX 0 h i β2-mikroglobulina
BCL-2/BAX 0 h i limfocytoza
BCL-2/BAX 0 h i LDH
BCL-2/BAX 0 h i stadium wg Rai
21
22
21
22
0,175496
0,449153
0,284693
0,382235
NS
0,035996
NS
NS*
BCL-2/BAX 24 h i β2-mikroglobulina
BCL-2/BAX 24 h i limfocytoza
BCL-2/BAX 24 h i LDH
BCL-2/BAX 24 h i stadium wg Rai
21
22
21
22
-0,134503
0,092064
-0,040936
0,029829
NS
NS
NS
NS
*współczynnik r-Spearmana nie był istotny statystycznie w żadnym przypadku oprócz limfocytozy, chociaż w odniesieniu do stadiów klinicznych według Raia znajdował się na granicy istotności
Ryc. 1. Wykres rozrzutu: ekspresja kaspazy-3 24 h vs. limfocytoza (0,95 Prz. Ufn.).
Analiza korelacji wykazała istnienie istotnej korelacji między stosunkiem ekspresji białek BCL-2/BAX w 0. godzinie hodowli a liczbą limfocytów we krwi obwodowej u pacjentów chorych na PBL (ryc. 2). Nie wykazano korelacji między stosunkiem BCL-2/BAX 0 h z innymi czynnikami rokowniczymi (tab. 1, ryc. 3).
Ryc. 2. Wykres rozrzutu: stosunek BCL-2/BAX 0 h vs. limfocytoza (0,95 Prz. Ufn.).
Ryc. 3. Wykres rozrzutu: stosunek BCL-2/BAX 0 h vs. stadium Rai (0,95 Prz. Ufn.).
Nie stwierdzono natomiast występowania żadnych korelacji między poziomem białek BCL-2/BAX w 24. godzinie hodowli białaczkowych limfocytów CD19+/CD5+ a czynnikami prognostycznymi uznanymi w PBL.
Ocena zależności między wyznacznikami apoptozy spontanicznej a niezależnymi grupami chorych
Ocena porównawcza dwóch niezależnych prób polegała na wykorzystaniu nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya, w celu określenia różnic poszczególnych cech pomiędzy dwoma populacjami. Z wartościami współczynników BCL-2/BAX 0 h i BCL-2 BAX 24 h oraz procentowymi wartościami ekspresji aktywnej kaspazy-3 24 h, na komórkach nowotworowych CD19+/CD5+, porównywano dwie niezależne populacje chorych na PBL, tj.:
– ZAP-70+ i ZAP-70-,

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 30 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Juszczyński P, Warzocha K: Biologia i klinika przewlekłej białaczki limfatycznej. Onkol Pol 2001; 4(2): 77-84.
2. Wołowiec D: Czynniki rokownicze i predykcyjne w przewlekłej białaczce limfocytowej. Acta Haematol Pol 2009; 40(2): 209-223.
3. Montserrat E, Moreno C: Chronic lymphocytic leukemia: a short overview. Annals of Oncology 2008; 19(17): 320-325.
4. Crowther-Swanepoel D, Houlston R: The molecular basis of familial chronic lymphocytic leukemia. Haematologica 2009; 94(5): 606-609.
5. Podhorecka M: Apoptosis in pathogenesis of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Post Hig 2004; 58: 236-242.
6. Enjuanes A, Benavente Y, Bosch F: Genetic variants in apoptosis and immunoregulation-related genes are associated with risk of chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res 2008; 68: 10178-1086.
7. Warzocha K: Optymalizacja strategii leczenia pierwszej linii przewlekłej białaczki limfocytowej. Onkologia w Praktyce Klinicznej 2007; 3: 2.
8. Dempsey NC, Leoni F, Ireland HE et al.: Differential heat shock protein localization in chronic lymphocytic leukemia. J Leukoc Biol 2010; 87(3): 467-476.
9. Goolsby Ch, Paniagua M, Tallman M et al.: Bcl-2 regulatory pathway is functional in chronic lymphocytic leukemia. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2005; 63: 36-46.
10. Pepper C, Hoy T, Bentley DP: Elevated Bcl-2/Bax are a consistent feature of apoptosis resistance in B-CLL and are correlated with in vivo chemorsistance. Leuk Lymphoma 1998; 28: 355-361.
11. Joks M, Lewandowski K: Prognostyczne znaczenie polimorfizmów genów białek rodziny BCL-2 u chorych na PBL. Współcz Onkol 2008; 12(4): 162-167.
12. Pepper C, Hoy T, Bentley DP: Bcl-2/Bax ratios in chronic lymphocytic leukaemia and their correlation with in vitro apoptosis ad clinical resistance. Br J Cancer 1998; 78(4): 553-554.
13. Kitada S, Andersen J, Akar S, et al.: Expression of apoposis-regulating proteins in chronic lymphocytic leukemia: correlations with in vitro and iv vivo chemoresponses. Blood 1998; 91(9): 3379-3389.
otrzymano: 2013-07-17
zaakceptowano do druku: 2013-09-04

Adres do korespondencji:
*Arkadiusz Macheta
Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku SPSK nr 1
ul. Staszica 11, 20-081 Lublin
tel.: +48 (81) 534-02-14
e-mail: arek.macheta@gmail.com

Postępy Nauk Medycznych 10/2013
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych