Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Postępy Fitoterapii 3/2016, s. 200-207
*Elżbieta Studzińska-Sroka1, Daria Zarabska-Bożejewicz2
Pustułka pęcherzykowata (Hypogymnia physodes (L.) Nyl.) – charakterystyka porostu i jego właściwości biologiczne
Hypogymnia physodes (L.) Nyl. – characteristic of the lichen and its biological properties
1Katedra i Zakład Farmakognozji, Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. farm. Wiesława Bylka
2Instytut Środowiska Rolniczego i Leśnego, Polska Akademia Nauk w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. n. farm. Lech W. Szajdak
Streszczenie
Pustułka pęcherzykowata (Hypogymnia physodes (L.) Nyl.) jest porostem z rodziny tarczownicowatych (Parmeliaceae), powszechnie występującym w różnych częściach Europy, w tym w Polsce oraz na innych kontynentach. Jako epifit porasta pnie i gałęzie drzew liściastych oraz iglastych. W wyniku swoistych relacji pomiędzy cudzożywnym grzybem a samożywnym fotobiontem – glonem lub sinicą, dochodzi do wytwarzania przez pierwszego z wymienionych wyżej partnerów metabolitów wtórnych, niespotykanych w świecie roślin, o interesujących, słabo poznanych właściwościach biologicznych. Związki, których obecność w plechach pustułki pęcherzykowatej potwierdzono, to: atranoryna, chloroatranoryna, kwas fyzodowy, kwas 3-hydroksyfyzodowy, kwas 2'-O-metylofyzodowy, kwas fyzodalowy, kwas protocetrarowy oraz kwas izofyzodowy. Prowadzone badania o charakterze in vitro wykazały, że związki i wyciągi z H. physodes wykazują wielokierunkowe właściwości biologiczne. Rezultaty eksperymentów świadczą o ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej, antyoksydacyjnej, cytotoksycznej wobec komórek nowotworowych oraz hamującej aktywność enzymatyczną. Depsydony izolowane z pustułki pęcherzykowatej wpływały również na komórki układu odpornościowego. Ponadto porost ten jest często wykorzystywany w badaniach bioindykacyjnych i biomonitoringowych na potrzeby oceny stanu środowiska, w tym zanieczyszczenia powietrza m.in. metalami ciężkimi.
Summary
Hypogymnia physodes (L.) Nyl. is the lichenized fungus within the Parmeliaceae family, that commonly occurs both in Poland, and other parts of Europe as well as in many other parts of the world. It is the epiphytic lichen growing on trunks and branches of deciduous and coniferous trees. As a result of the specific relationship between a heterotrophic fungus and an autotrophic photobiont – algae or cyanobacteria among others some secondary compounds are produced by mycobiont, not found among plants and with interesting and little-known biological properties. Till now, the presence of: atranorin, chloroatranorin, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, 2'-O-methylphysodic acid, physodalic acid, protocetraric acid and isophysodic acid, was confirmed in thallus of H. physodes. In vitro studies revealed interesting biological properties of compounds and extracts from H. physodes. Results of experiments proved their antibacterial and antioxidant activities, as well as cancer cell cytotoxicity and inhibitory effects on enzymes. Depsidones isolated from H. physodes also influenced on cells of the immune system. Moreover, this lichen is often used in bioindicator and biomonitoring studies that allow for assessment of environmental conditions, also air pollution with i.a. heavy metals.
Wstęp
Porosty (grzyby zlichenizowane) to organizmy, których plecha zbudowana jest z komórek autotroficznego komponentu zielonego (glonu lub sinicy) oraz cudzożywnego grzyba lichenizującego zwanego mikobiontem. Obaj partnerzy wchodzą w swoisty typ wzajemnej zależności o charakterze symbiozy. To dzięki zdolnościom fotosyntetycznym fotobionta możliwe jest wytwarzanie potrzebnych do wzrostu składników odżywczych, natomiast przemiany biochemiczne zachodzące w strzępkach mikobionta pozwalają na produkcję metabolitów wtórnych. Związki te zapewniają porostom m.in. ochronę przed wpływem niekorzystnych czynników zewnętrznych.
Do tej pory na terenie Polski stwierdzono występowanie ok. 1500 gatunków grzybów zlichenizowanych (1). Jednym z nich jest pospolita na obszarze całego kraju pustułka pęcherzykowata (Hypogymnia physodes (L.) Nyl.). Dotąd niewykorzystywana w lecznictwie, wzbudziła zainteresowanie naukowców, a rezultaty prowadzonych eksperymentów świadczą o interesujących właściwościach badanego porostu, w tym o jego aktywności biologicznej. Praca stanowi przegląd informacji na temat porostu H. physodes i obejmuje jego charakterystykę, opis właściwości biologicznych ekstraktów otrzymanych z plechy pustułki oraz obecnych w niej związków o charakterze metabolitów wtórnych, a także omówienie roli gatunku w analizach bioindykacyjnych.
Opis gatunku
Hypogymnia physodes jest gatunkiem powszechnie występującym w różnych częściach Europy, Ameryce Północnej, Afryce Wschodniej, a nawet w Himalajach (2, 3). Jako epifit porasta pnie i gałęzie drzew liściastych oraz iglastych. Jest gatunkiem kwasolubnym, dlatego szczególnie korzystne warunki dla swojego rozwoju znajduje na podłożach o niższym odczynie, np. na korze sosny, brzozy, świerka, dębu. Ponadto porost ten stwierdzany jest również na drewnie, słomianych dachach, rzadziej na piaszczystej glebie, humusie oraz na podłożu skalnym (3, 4).
Pustułka pęcherzykowata ma listkowatą, luźno przyczepioną do podłoża plechę o kształcie rozetkowatym lub nieregularnym, silnie podzieloną na odcinki, o rozmiarze dochodzącym najczęściej do 5 cm (5). Górna powierzchnia plechy jest gładka, szara lub szarozielona, na końcach odcinków brunatnawo nabiegła, natomiast dolna część jest silnie pomarszczona i ma kolor czarny, przechodzący na obwodzie w odcień jasnobrązowy. Pustułka pęcherzykowata nie ma chwytników, natomiast do podłoża przyczepiona jest za pomocą zmarszczek dolnej kory. Soralia, które stanowią skupienia sorediów (czyli wytworów na plesze składających się zwykle z kilku lub kilkunastu komórek glonów oplecionych strzępkami grzyba, służących namnażaniu się porostów), są typu paszczowatego i powstają wskutek pęknięcia plechy na granicy dolnej i górnej warstwy korowej na końcach odcinków (4). Owocniki, osiągające średnicę 2-8 mm, są bardzo rzadko obserwowane, natomiast zarodniki są jednokomórkowe, bezbarwne, elipsoidalne o wymiarach 6-9 x 4-5 μm (5).
Związki chemiczne
H. physodes wytwarza substancje chemiczne o charakterze depsydów i depsydonów. Do pierwszej grupy należą atranoryna i chloroatranoryna (obecne w części korowej plechy). Do grupy depsydonów zaliczane są: kwas fyzodowy, kwas 3-hydroksyfyzodowy, kwas 2'-O-metylofyzodowy, kwas fyzodalowy oraz kwas protocetrarowy (w części rdzeniowej). Ponadto z plechy wyizolowano kwas izofyzodowy (2, 6-10) (ryc. 1).
Ryc. 1. Wzory związków obecnych w H. physodes
Wykonane analizy HPLC określające zawartość związków w plesze H. physodes zebranej na terenie Skandynawii (Norwegia) wykazały, że wśród obecnych w poroście metabolitów wtórnych, najwyższe stężenie charakteryzowało kwas fyzodalowy (2,7-8,4% suchej masy) i fyzodowy (3,3-5,0%), natomiast kwas protocetrarowy, a także substancje zawarte w części korowej: atranoryna i chloroatranoryna były obecne w znacznie mniejszej ilości (odpowiednio 0,26-0,52%; 0,14-0,43%; 0,03-0,18%) (8).
Badano również całkowitą zawartość polifenoli oraz flawonoidów w ekstraktach otrzymanych z plech H. physodes. Wyciąg metanolowy, uzyskany drogą 24-godzinnej maceracji w temp. pokojowej, charakteryzowała wysoka zawartość polifenoli (141,59 mg kwasu galusowego/g wyciągu) oraz znacznie niższa flawonoidów (20,14 mg rutyny/g wyciągu) (10). W innym badaniu zawartość polifenoli dla ekstraktów acetonowego, metanolowego oraz wodnego wynosiła odpowiednio 30,1; 86,8 i 6,3 μg równoważnika pirokatecholu. Ilość flawonoidów była porównywalna dla ekstraktów acetonowego i metanolowego (30,1 i 32,1 μg równoważnika rutyny) oraz znacznie niższa dla ekstraktu wodnego (11,3 μg równoważnika rutyny) (11).
Metabolity wtórne a czynniki środowiskowe
Ilość metabolitów wtórnych, obecnych w plesze pustułki pęcherzykowatej, może ulegać zmianom wskutek działania różnorodnych czynników środowiskowych, w tym powiązanych z działalnością antropogeniczną. Zmiany te mogą przejawiać się wzrostem lub obniżeniem zawartości substancji porostowych (12). Solhaug i wsp. (8) przeprowadzili ilościową analizę stężenia metabolitów wtórnych w plechach H. physodes rosnących na stanowiskach o odmiennym stopniu nasłonecznienia. Zwiększenie całkowitej zawartości metabolitów wtórnych w badanym poroście powiązane było ze wzrostem nasłonecznienia. Ponadto wykazano dodatnie zależności pomiędzy ilością atranoryny i chloroatranoryny a bezpośrednim i rozproszonym promieniowaniem. W przypadku kwasów: fyzodowego, fyzodalowego i protocetrarowego wykryto lepsze korelacje ich zawartości z promieniowaniem słonecznym w porównaniu z promieniowaniem bezpośrednim (8).
Wpływ metali ciężkich na wytwarzanie metabolitów wtórnych u H. physodes oceniano u transplantów eksponowanych przez 6 mies. na stanowiskach zlokalizowanych na terenie Krakowskiego Okręgu Przemysłowego (12). Największą zawartość Cd, Pb i Zn stwierdzono w plechach zebranych w pobliżu huty cynku i ołowiu, podczas gdy Cr i Ni – w sąsiedztwie zakładu chemicznego produkującego związki chromu, fosforu i siarki. Bliskość zakładu przemysłowego wpłynęła na zmniejszenie ilości kwasów fyzodowego i hydroksyfyzodowego oraz atranoryny u transplantów. Podobne wyniki uzyskali Hauck i wsp. (13), którzy wykryli m.in. dodatnie korelacje pomiędzy zawartością kwasu fyzodalowego u H. physodes a wzrostem Cu2+ i Mn2+ w substracie, przy zmniejszaniu się ilości kwasu 3-hydroksyfyzodowego. Udowodniono, że związki o charakterze depsydonów, występujące w plesze H. physodes, mogą wykazywać zdolność wiązania kationów niektórych metali (14). Według danych piśmiennictwa kwas fyzodalowy wykazywał niezwykle silną (95%) zdolność adsorbowania jonów metali Fe3+. Właściwość tę miały również kwasy fyzodowe i protocetrarowy, jednak w stopniu znacznie niższym od wymienionego wyżej związku (odpowiednio ok. 44 i 43%). Zjawiska nie zaobserwowano dla jonów Fe2+. Zdolność adsorpcji kationów metali, jednak już w dużo mniejszym stopniu, dotyczyła także jonów Ca2+ i Mg2+.
Zwiększoną ilość kwasu fyzodalowego w plechach wskutek ekspozycji na metale ciężkie można traktować jako przejaw funkcji tego związku w kształtowaniu strategii obronnej u H. physodes względem kumulujących się zanieczyszczeń (12-14). Wskazana wyżej właściwość może posłużyć wyjaśnieniu procesu wolniejszego ustępowania pustułki pęcherzykowatej wskutek zanieczyszczenia środowiska w porównaniu z innymi przedstawicielami tego rodzaju, tj. H. farinacea, H. tubulosa i H. vittata, czyli gatunkami, które nie mają w swojej plesze kwasu fyzodalowego (14). Dane prezentowane w piśmiennictwie przedmiotu przemawiają za możliwością wykorzystania metabolitów wtórnych jako biomarkerów w badaniach środowiskowych (12).
Znane jest także oddziaływanie substancji porostowych na inne elementy biotyczne obecne w ekosystemach. Zdaniem Latkowskiej i wsp. (15) metabolity wtórne u pustułki pęcherzykowatej przyczyniły się do obniżenia żywotności świerku Picea abies i usychania jego gałęzi porośniętych obficie plechami porostu. Stwierdzenie to oparto na wynikach wskazujących na obecność kwasu fyzodalowego, 3-hydroksyfyzodowego oraz atranoryny w korze drzewa w miejscach bezpośrednio zasiedlonych przez porost (16). Ekstrakt acetonowy z H. physodes hamował rozwój grzybów chorobotwórczych tj. Pythium ultimum, Ustilago maydis i Phytophthora infestans (17). Sugeruje to, że metabolity wtórne inne niż atranoryna, znajdujące się u pustułki pęcherzykowatej, także hamują wzrost wymienionych powyżej grzybów (17).
Aktywność biologiczna
Działanie przeciwdrobnoustrojowe
Przeciwbakteryjne działanie ekstraktów otrzymanych z porostów oraz izolowanych z nich tzw. kwasów porostowych jest testowane od dawna. Mitrović i wsp. (10) badali ekstrakt metanolowy z H. physodes na 29 szczepach drobnoustrojów. W zależności od grupy testowanych drobnoustrojów aktywność znacznie różniła się. Ekstrakt wykazywał zróżnicowaną aktywność wobec Bacillus sp. (MIC = 0,04-0,08 mg/ml), Enterococcus faecalis (MIC = 0,08-5,0 mg/ml), Staphylococcus aureus (MIC = 0,04-0,3 mg/ml) i Pseudomonas aeruginosa (MIC = 6,3 mg/ml). Ekstrakty metanolowe z H. physodes działały również przeciwgrzybiczo. Ekstrakt metanolowy z H. physodes wykazywał dość wysoką aktywność wobec szczepu wzorcowego Aspergillus niger (MIC = 0,01 mg/ml), przy czym aktywność wobec szczepu klinicznego A. niger była znacznie niższa (MIC = 5,0 mg/ml). Wykazane w badaniach minimalne stężenie hamujące rozwój innych grzybów pleśniowych i drożdżoidalnych wahało się dla omawianych wyciągów od 0,63 do 10 mg/ml. Aktywność flukonazolu wahała się w odniesieniu do badanych grzybów w granicach MIC = 0,03-0,5 mg/ml.
Aktywność przeciwbakteryjną wykazywał także obecny w H. physodes kwas fyzodowy. Antybiotyczne działanie tego związku badano na różnych gatunkach drobnoustrojów. Okazało się, że testowany depsydon hamował rozwój bakterii Gram-dodatnich: S. aureus (MIC = 25 μg/ml) oraz Mycobacterium smegmatis (MIC = 100 μg/ml). Substancją wzorcową był siarczan streptomycyny, który wzrost wymienionych mikroorganizmów hamował w stężeniu 5 i 1,25 μg/ml. Kwas fyzodowy nie wpływał w badanych stężeniach na rozwój bakterii: Escherichia coli, Salmonella gallinarum, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa oraz grzyba drożdżoidalnego Candida albicans (MIC > 100 μg/ml) (18).
Türk i wsp. (19) wykazali, że kwas fyzodowy słabiej od chloroatranoryny i kwasu oliwetorowego hamował rozwój Proteus vulgaris, S. aureus, Streptococcus faecalis (MIC = 53,1 mmol), nie działał natomiast na bakterie Aeromonas hydrophila, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. syringae, Salmonella typhimurium oraz na wszystkie testowane grzyby pleśniowe. Ponadto kwas fyzodowy działał silniej od chloroatranoryny, lecz słabiej od kwasu oliwetorowego na szczepy Bacillus cereus, Bacillus subtilis i Listeria monocytogenes (MIC = 6,6-13,3 mmol). Stwierdzono, że badany depsydon, na skutek obecności wiązania eterowego w cząsteczce, nie ma możliwości rotacji wokół wiązania estrowego. Depsydy (np. kwas oliwetorowy) pozbawione są blokady przestrzennej i zmieniając położenie w przestrzeni, mogą działać na centrum inhibicji zlokalizowane w komórkach grzyba (19).
W innych badaniach aktywność przeciwdrobnoustrojowa kwasu fyzodowego była niższa niż testowanych równolegle substancji: atranoryny, kwasu gyroforowego i usninowego (MIC = 0,5-1 mg/ml dla kwasu fyzodowego; MIC = 0,0075-0,5 mg/ml dla pozostałych związków). Opisywany depsydon działał najsilniej na Botrytis cinerea i Paecilomyces variotti (MIC = 0,5 mg/ml) (20).
Występujący w plechach pustułki pęcherzykowatej kwas 3-hydroksyfyzodowy został przebadany na 13 szczepach bakterii, 2 szczepach grzybów drożdżoidalnych i 10 szczepach grzybów pleśniowych. Pochodna kwasu fyzodowego była aktywna wobec 9 spośród wszystkich badanych drobnoustrojów (B. cereus, B. subtilis, E. coli, L. monocytogenes, P. vulgaris, S. typhimurium, S. aureus, S. faecalis, C. albicans). Wyznaczona doświadczalnie wartość MIC wahała się między 0,08-2,57 mmol. Uwagę zwraca silna aktywność związku wobec C. albicans (MIC= 0,08 mmol) (21).
Interesującym jest fakt, iż kwas fyzodowy oraz fyzodalowy wraz z kwasem usninowym (związkiem izolowanym z porostów o silnym działaniu przeciwbakteryjnym) wchodziły w skład preparatu Evosin II, popularnego w II połowie XX wieku, głównie w Niemczech, jako środka do stosowania zewnętrznego w przypadku ropiejących i trudno gojących się ran (22).
Działanie antyoksydacyjne
Zdolność zmiatania wolnych rodników przez wyciągi z H. physodes była określana w kilku badaniach z wykorzystaniem odczynnika DPPH. Aktywność przeciwutleniająca ekstraktów metanolowych otrzymanych metodą 24-godzinnej maceracji oceniono, wyznaczając współczynnik EC50. Okazało się, że stężenie ekstraktu w badanej próbie wymagane do zmniejszenia pierwotnego stężenia DPPH o 50% wynosiło 79,7 μg/ml, podczas gdy EC50 dla zastosowanego jako wzorca BHT było równe 19,2 μg/ml (23).
Mitrović i wsp. (10) badali metanolowy ekstrakt przygotowany w analogiczny sposób. Eksperymentalnie wyznaczona wartość IC50 wynosiła 45,6 μg/ml. Następnie badano ekstrakty acetonowe, metanolowe i wodne z H. physodes, otrzymane metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta. Otrzymane wyniki wskazują, że wszystkie badane ekstrakty w stężeniu 1 mg/ml wykazywały zdolność zmiatania rodnika odpowiednio w: 60,2; 73,2 i 31,0%. W przypadku zastosowanych w tym samym stężeniu wzorców, poziom rodnika DPPH zmniejszał się odpowiednio dla witaminy C o 86,6%, BHA o 79,8% i α-tokoferolu o 64,0% (11).
Badano również redukujące właściwości acetonowych, metanolowych i wodnych ekstraktów z H. physodes metodą z heksacyjanożelazianem (III) potasu (11). Wyciągi, otrzymane metodą ekstrakcji w aparacie Soxhleta i zastosowane w stężeniu 1 mg/ml, wykazywały silniejszą zdolność redukowania jonów Fe3+, w porównaniu do badanych równocześnie ekstraktów uzyskanych z innych gatunków porostów (Cladonia furcata, Parmelia caperata i Parmelia sulcata). Odnotowane działanie było jednak słabsze od stosowanych jako wzorce: BHA, α-tokoferolu i witaminy C (11).
Właściwości przeciwutleniające kwasu fyzodowego zostały zbadane metodą z odczynnikiem DPPH oraz metodą oceniającą zdolność zmiatania anionorodnika ponadtlenkowego (24). Otrzymane wyniki świadczyły o działaniu przeciwwolnorodnikowym blisko 11 razy słabszym od witaminy C (odpowiednio IC50 = 69,10 μg/ml oraz 6,42 μg/ml). Natomiast zdolność zmiatania anionu ponadtlenkowego była jedynie o ok. 46% niższa od działania witaminy C, uważanej za substancję o niezwykle silnym działaniu przeciwutleniającym (odpowiednio IC50 = 169,65 μg/ml oraz 115,61 μg/ml) (24).
Türkez i wsp. (25) w plazmie pozyskanej z hodowli komórek krwi określali całkowitą pojemność antyoksydacyjną (TAC) i całkowity status oksydacyjny (TOS). Stwierdzono, że wodny ekstrakt z pustułki pęcherzykowatej (50 mg/l) powodował znaczący wzrost TAC, natomiast w wyższych stężeniach (1000 i 2000 mg/l) obserwowano spadek poziomu tego wskaźnika. Dla badanego ekstraktu TOS wzrastał wraz z testowanym stężeniem (250, 500, 1000 i 2000 mg/l) (25).
Hamowanie aktywności enzymów
Badania wykazały, że obecny w plesze porostu H. physodes kwas fyzodowy wykazuje zdolność blokowania integrazy HIV-1 – enzymu spełniającego ważną rolę w procesie uaktywniania replikacji wirusa HIV (26, 27). Ponadto kwas fyzodowy hamuje aktywność elastazy trzustkowej oraz trypsyny. Stopień inhibicji enzymatycznej wynosił około 20% wobec elastazy (w stężeniu 100 μmol) i trypsyny (w stężeniu 500 μmol). Aktywność kwasu hydroksyfyzodowego była wyższa. Poziom hamowania elastazy trzustkowej wynosił 74,3% przy stężeniu 100 μmol badanego związku. Wykazano ponadto, że hydroksylowa pochodna kwasu fyzodowego w stężeniu 500 μmol obniżała działanie trypsyny o 29,7% (28).
Wpływ na komórki układu odpornościowego
Pavlovic i wsp. (9) prowadzili badania na komórkach układu odpornościowego wyizolowanych z H. physodes kwasów: fyzodalowego, fyzodowego, 3-hydroksyfyzodowego oraz izofyzodowego. Związki te poddano badaniu na szczurzych tymocytach. Oceniano wpływ wymienionych wyżej metabolitów wtórnych na proliferację, żywotność, produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) i potencjał błony mitochondrialnej (MMP) badanych komórek. Uzyskane wyniki wykazały, że najsilniej na komórki te działał kwas fyzodalowy. Spadek proliferacji tymocytów obserwowano w stężeniach 1 i 10 μg (kwas fyzodalowy) lub 10 μg (kwas fyzodowy i 3-hydroksyfyzodowy). Kwas izofyzodowy powodował nieistotny statystycznie spadek proliferacji badanych komórek.
W celu oceny żywotności tymocytów przeprowadzono test z syntetycznym oktapeptydem CCK-8. Wzrost działania cytotoksycznego odnotowano dla różnych stężeń kwasu fyzodalowgo (1 i 10 μg). Kwasy fyzodowy i 3-hydroksyfyzodowy działały słabiej (10 μg). Kwas izofyzodowy nie zmieniał żywotności tymocytów (9).
Badania wpływu substancji porostowych na produkcję reaktywnych form tlenu oraz potencjał błony mitochondrialnej wykazały, że w obu przypadkach kwas fyzodalowy najsilniej zmieniał badane parametry (0,1; 1 i 10 μg), słabsze działanie wykazano dla kwasu fyzodowego (10 μg). Dla pozostałych związków nie zaobserwowano istotnego statystycznie działania. W tym samym badaniu zauważono, że wzrost produkcji ROS powodował spadek potencjału MMP. Ekspozycja tymocytów na wzrastające stężenia kwasu 3-hydroksyfyzodowego i izofyzodowego nie wpływała na potencjał MMP (9).
Na podstawie wyników przeprowadzonych badań stwierdzono, że toksyczny wpływ na badane komórki miał, obserwowany w przypadku poddania tymocytów działaniu kwasu fyzodalowego i fyzodowego, wzrastający poziom reaktywnych form tlenu i spadek mitochondrialnego potencjału błonowego (9).
Działanie cytotoksyczne
Wpływ metanolowego wyciągu z H. physodes na żywotność komórek nowotworu piersi linii MCF-7 i MDA-MB-231 oraz wpływ tego ekstraktu na występowanie w komórkach zjawiska apoptozy oceniano w badaniach prowadzonych przez Ari i wsp. (29). Otrzymane wyniki wskazywały na właściwości cytotoksyczne ekstraktu wobec badanych linii komórkowych (IC50 = 50 i 44 μg/ml; test MTT po 72 godz. inkubacji). Zjawisko apoptozy badano, mierząc w komórkach poziom markera programowanej śmierci komórki – antygenu M30. Rezultaty wykazały, że ekstrakt metanolowy w stężeniu 100 μg/ml po 72-godzinnej inkubacji wywoływał apoptozę komórek MCF-7, natomiast nie wpływał na komórki MDA-MB-231. Analiza z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego wykazała, że ekstrakt metanolowy spowodował fragmentację jądra w komórkach MCF-7, natomiast w komórkach MDA-MB-231 nie wywołał podobnych zmian, co świadczy o tym, że zjawisko apoptozy dotyczyło linii MCF-7. Rezultaty eksperymentu wskazują, że H. physodes może być źródłem substancji o właściwościach przeciwnowotworowych (29).
Kosanić i wsp. (30) badali wpływ acetonowego ekstraktu z H. physodes na komórki ludzkiego czerniaka (FemX) oraz ludzkiego nowotworu okrężnicy (LS 174). Otrzymane wyniki potwierdzały aktywność badanego ekstraktu, jednak w stężeniach wyższych niż cisplatyna, którą zastosowano jako substancję odniesienia. IC50 dla FemX wynosiła 43,45 μg/ml, a dla LS 174 – 38,1 μg/ml. Dla cisplatyny wartości te kształtowały się odpowiednio na poziomie 0,9 i 2,3 μg/ml.
Właściwości mutagenne i genotoksyczne
Badania mutagennych właściwości kwasu fyzodowego i fyzodalowego prowadzono w latach 80.-90. XX wieku. Test Amesa przeprowadzono na dwóch szczepach Salmonella typhimurium (TA98 i TA100). Okazało się, że kwas fyzodalowy wykazywał zależną od dawki mutagenność dla szczepu TA100 (31, 32).
Zbadano także właściwości genotoksyczne ekstraktu metanolowego z pustułki pęcherzykowatej na komórkach limfocytów ludzkich, stosując test aberracji chromosomowych oraz test mikrojądrowy. Uzyskane wyniki dowiodły, że genotoksyczne działanie ekstraktu występowało przy relatywnie wysokich stężeniach (> 125 μg/ml), w porównaniu z jego aktywnością cytotoksyczną (29).
W innych badaniach prowadzonych z użyciem hodowli ludzkich limfocytów krwi obwodowej stwierdzono, że ekstrakt z pustułki pęcherzykowatej w zastosowanych stężeniach (0-2000 mg/l) nie wykazywał działania, gdyż nie indukował istotnego statystycznie wzrostu liczby aberracji chromosomowych oraz ilości mikrojąder w badanych komórkach w porównaniu z próbą kontrolną (25).
Pustułka pęcherzykowata jako biowskaźnik
Pustułka pęcherzykowata jest często proponowana jako gatunek biotestowy w badaniach oceniających stan środowiska z wykorzystaniem porostów (3, 33, 34). Wynika to głównie z jej rozpowszechnienia i tym samym dostępności, szybkiej reakcji na stres, łatwej identyfikacji zmian pojawiających się na jej plesze, umiarkowanej wrażliwości na SO2 i metale ciężkie, względnej tolerancji i wykazywanej dobrej zdolności do akumulacji zanieczyszczeń powietrza (4, 14, 33). Istnieje szereg metod badawczych stosowanych przy lichenoindykacji, w których zaleca się prowadzenie obserwacji z wykorzystaniem H. physodes (33). Jedna z nich, zwana metodą gatunków wskaźnikowych, wyróżnia omawiany porost jako wskaźnik wybranych stref porostowych o określonym stopniu zanieczyszczenia powietrza. W tym samym celu może być przeprowadzona analiza udziału form morfologicznych, w tym porostów o plesze listkowatej, do której to grupy należy również opisywany epifit (33). Metoda testu płytkowego (metoda transplantacji) pozwala określić stopień zamierania plech pustułki pęcherzykowatej przeniesionych ze stanowisk naturalnych na obszary znajdujące się pod znaczącym wpływem obiektów emitujących duże ilości zanieczyszczeń, tj. emitora punktowego (np. komin fabryczny, zakład przemysłowy) lub pasmowego (np. ruchliwa szosa) (4).
Piśmiennictwo zawiera wiele przykładów świadczących o dobrej zdolności do akumulacji zanieczyszczeń w plesze opisywanego porostu (12, 33, 35-37). Jednym z nich są analizy, w ramach których dokonano oceny zawartości mikroelementów (Pb, Ni, Cr, Cu, Zn, Fe) u H. physodes (33). Stwierdzono, że ich średnie stężenia były większe u transplantów eksponowanych w obrębie Białegostoku w porównaniu z próbą kontrolną na terenie Puszczy Knyszyńskiej. Ponadto niższe wartości uzyskiwano w pobliżu kompleksów leśnych niż terenów zabudowanych i otwartych. Szczególnie okres jesienny i zimowy zdaje się sprzyjać kumulacji zwiększonej ilości zanieczyszczeń, co jest związane z trwającym wówczas sezonem grzewczym oraz zwiększonym zużyciem i niepełnym spalaniem paliwa przez silniki pojazdów.
W ramach badań nad różnorodnością porostów nadrzewnych w zamierających lasach świerkowych porastających góry Harzu w Niemczech dowiedziono, iż stopień pokrycia plechami pni drzew przez pustułkę pęcherzykowatą zmniejszał się wraz ze wzrostem koncentracji wielu pierwiastków w korze (K, Fe, Cu) i w wodzie spływającej po pniu (NH4+, NO3, S, K, Mg, Fe). Natomiast bezpośredni wpływ stwierdzono w odniesieniu do stężenia S w wodzie spływającej po pniu (38).
Podsumowanie
H. physodes to występujący pospolicie gatunek porostu, wytwarzający metabolity wtórne o interesujących właściwościach biologicznych. Produkowane przez tego grzyba związki chemiczne należą głównie do depsydów i depsydonów, z których w największej ilości w poroście występują kwasy: fyzodowy i fyzodalowy. Wyniki prowadzonych na przestrzeni ostatnich lat eksperymentów in vitro wykazały, że niestosowana dotychczas w lecznictwie pustułka pęcherzykowata wykazuje interesujące działanie biologiczne. Oprócz opisywanego od dawna w piśmiennictwie przeciwdrobnoustrojowego działania porostu wykazano, że aktywność przeciwutleniająca i cytotoksyczna ekstraktów otrzymanych z badanego grzyba była wysoka. Wyniki zaprezentowanych w pracy badań wskazują, że zarówno ekstrakty, jak i same związki izolowane z pustułki pęcherzykowatej mają potencjał leczniczy, jednak brak eksperymentów in vivo i prac klinicznych uniemożliwia ich zastosowanie w medycynie. Oprócz aspektu działania biologicznego istotna jest też możliwość wykorzystania H. physodes w bioindykacji i biomonitoringu, pozwalających na dokonanie oceny stanu środowiska, w tym zanieczyszczenia powietrza dwutlenkiem siarki czy metalami ciężkimi.
Piśmiennictwo
1. Fałtynowicz W. The lichens, lichenicolous and allied fungi of Poland. An annotated checklist. Krytyczna lista porostów i grzybów naporostowych Polski. W Szafer Institute of Botany, Polish Academy of Sciences, Kraków 2003. 2. Purvis OW, Coppins BJ, Hawksworth DL i wsp. (eds.). The lichen flora of Great Britain and Ireland. Natural History Publications, London 1992. 3. Fałtynowicz W. Porosty w lasach. Przewodnik terenowy dla leśników i taksatorów. Cent Inform Lasów Państw, Warszawa 2012. 4. Fałtynowicz W. Porosty jako biowskaźniki zmian w środowisku Karkonoszy. Materiały edukacyjne Karkonoskiego Parku Narodowego. Karkonoski Park Narodowy, Jelenia Góra 2014. 5. Tobolewski Z. Porosty. Klucz do oznaczania gatunków krajowych. PWN, Warszawa 1972. 6. Culberson CF. Chemical and botanical guide to lichen products. The University of North Carolina Press, Chapel Hill 1969. 7. Huneck S, Yoshimura I. Identification of lichen substances. Springer-Verlag Berlin-Heidelberg 1996. 8. Solhaug KA, Lind M, Nybakken L i wsp. Possible functional roles of cortical depsides and medullary depsidones in the foliose lichen Hypogymnia physodes. Flora 2009; 204:40-8. 9. Pavlovic V, Stojanovic I, Jadranin M i wsp. Effect of four lichen acids isolated from Hypogymnia physodes on viability of rat thymocytes. Food Chem Toxicol 2013; 51:160-4. 10. Mitrović T, Stamenković S, Cvetković V i wsp. Antioxidant, antimicrobial and antiproliferative activities of five lichen species. Int J Mol Sci 2011; 12(8):5428-48. 11. Kosanić M, Ranković B, Vukojević J. Antioxidant properties of some lichen species. J Food Sci Technol 2011; 48(5):584-90. 12. Białońska D, Dayan FE. Chemistry of the lichen Hypogymnia physodes transplanted to an industrial region. J Chem Ecol 2005; 31:2975-91. 13. Hauck M, Böning J, Jacob M i wsp. Lichen substance concentrations in the lichen Hypogymnia physodes are correlated with heavy metal concentrations in the substratum. Environ Exper Bot 2013; 85:58-63. 14. Hauck M, Huneck S. Lichen substances affect metal adsorption in Hypogymnia physodes. J Chem Ecol 2007; 33:219-23. 15. Latkowska E, Chrapusta E, Bober B i wsp. Allelopathic effects of epiphytic lichen Hypogymnia physodes (L.) Nyl. colonization on the spruce (Picea abies (L.) Karst.) bark. Allelopathy J 2015; 35(1):129-38. 16. Latkowska E, Bober B, Chrapusta E i wsp. Secondary metabolites of the lichens Hypogymnia physodes (L.) Nyl. and their presence in spruce (Picea abies (L.) H. Karst.) bark. Phytochem 2015; 118:116-23. 17. Halama P, Van Haluwin Ch. Antifungal activity of lichen extracts and lichenic acids. BioControl 2004; 49:95-107. 18. Gollapudi SR, Telikepalli H, Jampani HB i wsp. Alectosarmentin, a new antimicrobial dibenzofuranoid lactol from the lichen, Alectoria sarmentosa. J Nat Prod 1994; 57(7):934-8. 19. Türk H, Yilmaz M, Tay T i wsp. Antimicrobial activity of extracts of chemical races of the lichen Pseudevernia furfuracea and their physodic acid, chloroatranorin, atranorin and olivetoric acid constituents. Z Naturforsch [C] 2006; 61c:499-507. 20. Ranković B, Mišić M, Sukdolak S. The antimicrobial activity of substances derived from the lichens Physcia aipola, Umbilicaria polyphylla, Parmelia caperata and Hypogymnia physodes. World J Microbiol Biotechnol 2008; 24:1239-42. 21. Yilmaz M, Tay T, Kivanç M i wsp. The antimicrobial activity of extracts of the lichen Hypogymnia tubulosa and its 3-hydroxyphysodic acid constituent. Z Naturforsch [C] 2005; 60(1-2):35-8. 22. Ahmadjian V, Hale ME (eds.). The Lichens. Academic Press. New York, San Francisco, London 1973. 23. Stojanović G, Stojanović I, Stankov-Jovanović V i wsp. Reducing power and radical scavenging activity of four Parmeliaceae species. Centr Eur J Biol 2010; 5(6):808-13. 24. Ranković B, Kosanić M, Manojlović N i wsp. Chemical composition of Hypogymnia physodes lichen and biological activities of some its major metabolites. Med Chem Res 2014; 23(1):408-16. 25. Türkez H, Aydin E, Aslan A. Effects of lichenic extracts (Hypogymnia physodes, Ramalina polymorpha and Usnea florida) on human blood cells: cytogenetic and biochemical study. Iran J Pharm Res 2012; 11(3):889-96. 26. Müller K. Pharmaceutically relevant metabolites from lichens. Appl Microbiol Biotechnol 2001; 56:9-16. 27. Neamati N, Hong H, Mazumder A i wsp. Depsides and depsidones as inhibitors of HIV-1 integrase: Discovery of Novel Inhibitors through 3D Database Searching. J Med Chem 1997; 40:942-51. 28. Proksa B, Adamcová J, Sturdíková M i wsp. Metabolites of Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf. and their inhibition potential of proteolytic enzymes. Pharmazie 1994; 49(4):282-3. 29. Ari F, Celikler S, Oran S i wsp. Genotoxic, cytotoxic, and apoptotic effects of Hypogymnia physodes (L.) Nyl. on breast cancer cells. Environ Toxicol 2014; 29(7):804-13. 30. Kosanić M, Ranković B, Stanojković T. Investigation of selected Serbian lichens for antioxidant, antimicrobial and anticancer properties. JAPS 2013; 23(6):1628-33. 31. Shibamoto T, Wei CI. Mutagenicity of lichen constituents. Environ Mutagen 1984; 6(5):757-62. 32. Osawa T, Kumon H, Reece CA i wsp. Inhibitory effect of lichen constituents on mutagenicity induced by heterocyclic amines. Environ Mol Mutagen 1991; 18(1):35-40. 33. Matwiejuk A. Porosty Białegostoku jako wskaźniki zanieczyszczenia atmosfery. T. II. Wyd Ekonomia i Środowisko, Białystok 2007. 34. Jóźwiak MA, Jóźwiak M, Szwed M. Metody transplantacji porostów stosowane w biomonitoringu powietrza atmosferycznego. NEM 2010; 11:15-23. 35. Jóźwiak M. Kumulacja metali ciężkich i zmiany morfologiczne w plechach porostu Hypogymnia physodes (L.) Nyl. NEM 2007; 8:51-6. 36. Jóźwiak MA, Jóźwiak M. Influence of cement industry on accumulation of heavy metals in bioindicators. Ecol Chem Eng S 2009; 16(3):323-34. 37. Kłos A. Porosty w biomonitoringu środowiska. Uniwersytet Opolski, Studia i Monografie nr 420, Opole 2009. 38. Hauck M, Runge M. Stemflow chemistry and epiphytic lichen diversity in dieback-affected spruce forest of the Harz Mountains, Germany. Flora 2002; 197:250-61.
otrzymano: 2016-02-22
zaakceptowano do druku: 2016-05-16

Adres do korespondencji:
*dr n. farm. Elżbieta Studzińska-Sroka
Katedra i Zakład Farmakognozji Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu
ul. Święcickiego 4, 60-781 Poznań
tel.: +48 (61) 854-67-09, fax: +48 (61) 854-67-01
e-mail: ela_studzinska@op.pl

Postępy Fitoterapii 3/2016
Strona internetowa czasopisma Postępy Fitoterapii