© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2017, s. 3-11
*Paweł Kwiatkowski1, Monika Sienkiewicz2, Małgorzata Dzięcioł3
Ocena wpływu olejku eterycznego z kopru włoskiego (Foeniculum vulgare Mill.) na aktywność przeciwbakteryjną maści Taconal wobec szczepów Staphylococcus aureus w warunkach in vitro
Evaluation of the effect of fennel essential oil (Foeniculum vulgare Mill.) on antibacterial activity of Taconal ointment against Staphylococcus aureus in in vitro conditions
1Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie
Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. med. Barbara Dołęgowska
2Zakład Alergologii i Rehabilitacji Oddechowej, II Katedra Otolaryngologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Hanna Zielińska-Bliźniewska, prof. nadzw.
3Zakład Syntezy Organicznej i Technologii Leków, Wydział Technologii i Inżynierii Chemicznej, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie
Kierownik Zakładu: dr hab. inż. Agnieszka Wróblewska, prof. ZUT
Streszczenie
Wstęp. Gronkowce złociste są najczęstszą przyczyną ciężkich do wyleczenia zakażeń skóry. Narastająca oporność szczepów klinicznych Staphylococcus aureus na syntetyczne leki przeciwdrobnoustrojowe, a także skutki uboczne ich stosowania uzasadniają podjęcie badań nad wpływem olejków eterycznych na zwiększenie aktywności przeciwbakteryjnej preparatów zawierających antybiotyki.
Cel pracy. Celem badań była ocena wpływu olejku z kopru włoskiego (OKW) na aktywność przeciwbakteryjną maści Taconal wobec szczepów S. aureus izolowanych od pacjentów z ropnymi zmianami skórnymi.
Materiał i metody. Materiał do badań stanowiło 11 szczepów S. aureus wyizolowanych z ran, ropni, owrzodzenia i zmiany trądzikowej oraz szczep referencyjny S. aureus ATCC 29213. Skład chemiczny OKW oznaczano metodą chromatografii gazowej z detektorem mas. Badanie wrażliwości szczepów S. aureus na antybiotyki i chemioterapeutyki przeprowadzono z wykorzystaniem metody dyfuzyjno-krążkowej. MIC (minimalne stężenie hamujące) dla mupirocyny wyznaczono metodą E-test. Wpływ OKW na aktywność przeciwbakteryjną maści Taconal wobec S. aureus oznaczano metodą dyfuzyjno-krążkową w podłożach zawierających wybrane stężenia OKW.
Wyniki. Dominującym składnikiem badanego OKW był trans-anetol (ok. 80%). Analiza lekowrażliwości wykazała, że 25% spośród badanych szczepów S. aureus było opornych na erytromycynę i klindamycynę oraz dysponowało mechanizmem oporności MLSB. Dodatek OKW w stężeniach 0,25; 0,5 i 1,0% do podłoża wzrostowego powodował znaczne zwiększenie stref zahamowania wzrostu wokół krążków nasączonych maścią Taconal.
Wnioski. W dobie narastania oporności szczepów bakteryjnych na antybiotyki, przeprowadzone badania, wskazujące na zwiększenie aktywności maści Taconal pod wpływem OKW, niosą możliwość stosowania tego połączenia w leczeniu ropnych zmian skórnych o etiologii gronkowcowej.
Summary
Introduction. Staphylococcus aureus strains are the commonest cause of the difficult to treat skin infections. Increasing the resistance of S. aureus clinical strains to synthetic antimicrobials, as well as side effects of their application justify a study on the effects of essential oils to enhance the antimicrobial activity of preparations containing antibiotics.
Aim. The aim of this work was evaluation of the effect of fennel essential oil on antibacterial activity of Taconal ointment against S. aureus isolated from patients with purulent skin lesions.
Material and methods. For the research works eleven S. aureus clinical strains isolated from wounds, abscesses, ulcers and acne skin and standard strain of S. aureus ATCC 29213 were used. Chemical composition of fennel essential oil was analyzed by gas chromatography with mass selective detector. The disc-diffusion method was used to the susceptibility testing to antibiotics and chemotherapeutics. The MIC (minimal inhibitory concentration) for mupirocin was carried out using the E-test method. The effect of fennel essential oil on antibacterial activity of Taconal ointment against S. aureus was tested with use of disc-diffusion method in the growth media with addition of selected concentrations of fennel oil.
Results. The main component of fennel essential oil was trans-anethole (content about 80%). The susceptibility testing to antimicrobials showed that 25% of tested S. aureus isolates were resistant to erythromycin, clindamycin and showed inducible or constitutive resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLSB resistance). The addition of fennel essential oil at a concentration of 0.25, 0.5 or 1.0% to the growth medium led to the significant increase of inhibition zones around the discs with Taconal ointment.
Conclusions. During the time of increasing resistance of bacterial strains to antibiotics, our studies connected with an effect of fennel essential oil on Taconal ointment activity showed that this combination can be used in the treatment of purulent skin lesions caused by staphylococci.
Wprowadzenie
Gronkowce złociste są jedną z najczęstszych przyczyn zakażeń zarówno u pacjentów hospitalizowanych, jak i leczonych ambulatoryjnie. Staphylococcus aureus są odpowiedzialne za zakażenia miejscowe, takie jak: czyraki, zapalenie mieszków włosowych, liszajec pęcherzowy; zakażenia narządowe, w tym głównie zapalenia płuc, wsierdzia, ropni narządowych, a także kości, stawów oraz postaci uogólnionych, jak bakteriemia, sepsa, choroba Rittera, wstrząs toksyczny (1, 2). Za chorobotwórczość gronkowców odpowiada szereg czynników zjadliwości. Wśród nich są: egzotoksyny – hemolizyny, leukocydyna Panton-Valentine; enterotoksyny gronkowcowe, toksyna wstrząsu toksycznego oraz eksfoliatyny, szereg egzoenzymów: proteazy, hydrolazy, nukleazy, hialuronidaza, koagulaza, a także białka powierzchniowe wiążące białka macierzy zewnątrzkomórkowej, m.in. fibronektyna, kolagen i elastyna (3).
Zakażenia skóry o etiologii gronkowcowej stanowią poważny problem w praktyce medycznej, szczególnie w leczeniu pacjentów z niedoborami odporności czy z chorobami współistniejącymi, jak np. cukrzyca. Bakterie te są najczęstszą przyczyną zakażeń miejsca operowanego. Bardzo istotnym aspektem w leczeniu jest narastanie oporności gronkowców na szereg leków przeciwbakteryjnych stosowanych w praktyce klinicznej. Rynek farmaceutyczny oferuje wiele leków do stosowania miejscowego w gronkowcowych zakażeniach skóry. Przykładem jest maść Taconal firmy Aflofarm, której główną substancją czynną jest mupirocyna (20 mg/g) – antybiotyk wytwarzany przez bakterie Pseudomonas fluorescens (4). Maść stosuje się do miejscowego leczenia bakteryjnych zakażeń skóry, wywoływanych przez S. aureus (w tym przez szczepy S. aureus oporne na metycylinę – MRSA), a także inne gronkowce i paciorkowce. Jednak ze względu na działania uboczne mupirocyny, maść nie jest polecana do leczenia np. rozległych ran czy oparzeń.
Pojawienie się opornych na antybiotyki szczepów bakteryjnych z gatunku S. aureus, będących przyczyną ciężkich do wyleczenia zakażeń skóry, a także skutki uboczne stosowania leków syntetycznych uzasadniają podjęcie badań nad wpływem olejków eterycznych na zwiększenie aktywności przeciwbakteryjnej preparatów zawierających antybiotyki. Zakażenia skóry o etiologii gronkowcowej pozostają nadal wyzwaniem dla lekarzy klinicystów, a zatem uzasadnione jest poszukiwanie alternatywnych metod leczenia tych zakażeń, np. na drodze wykorzystania olejków eterycznych, na które, jak wiadomo z dostępnego piśmiennictwa, bakterie nie wytworzyły mechanizmów oporności.
Cenną rośliną olejkodajną o właściwościach przeciwbakteryjnych jest koper włoski (Foeniculum vulgare Mill.) z rodziny Selerowatych (Apiaceae) pochodzący z Europy Południowej oraz regionu Morza Śródziemnego i szeroko uprawiany na całym świecie (5).
Głównymi składnikami olejku eterycznego z kopru włoskiego (OKW) są: trans-anetol, kamfen, fenchon, estragol, limonen, α-pinen, β-pinen, β-mircen, kamfora, 3-karen, α-felandren oraz cis-anetol (6). Zgodnie z piśmiennictwem, dwa najważniejsze chemotypy OKW pochodzą ze słodkiego kopru włoskiego (Foeniculum vulgare subsp. vulgare var. dulce), który zawiera nie mniej niż 2% olejku eterycznego oraz z gorzkiego kopru włoskiego (Foeniculum vulgare Mill. subsp. vulgare var. vulgare) zawierającego 14,5% olejku eterycznego. W pierwszym z nich dominuje anetol (około 80%), estragol (około 10%) oraz fenchon (około 7,5%), natomiast w drugim proporcje głównych składników są odmienne: trans-anetol (56,4-58,4%), fenchon (36,2-39,5%) oraz estragol (2,2-2,5%) (7).
Ze względu na swój niepowtarzalny smak, aromat i właściwości konserwujące, OKW stosowany jest głównie w produktach spożywczych (8). Poza przemysłem spożywczym ma on liczne zastosowania w kosmetyce. Ze względu na działanie łagodzące dolegliwości ze strony układu pokarmowego oraz oddechowego, w ostatnich latach rośnie zainteresowanie OKW pod kątem zastosowania medycznego (5). Wywary z kopru włoskiego stosowane są od dawana u niemowląt w celu zapobiegania kolkom oraz wzdęciom (7). Olejek z kopru włoskiego wykazuje poza tym właściwości regulujące i wywołujące menstruację, łagodzące bóle menstruacyjne oraz zwiększające libido (6). Ponadto z danych piśmiennictwa wynika, że OKW ma działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe, przeciwnowotworowe, przeciwcukrzycowe, roztoczobójcze, przeciwgrzybicze oraz przeciwbakteryjne (9-11). W wielu ośrodkach prowadzone są badania dotyczące wykorzystania olejku koprowego do leczenia chorób pasożytniczych (12).
Cel pracy
Badania miały na celu określenie wpływu OKW na aktywność przeciwbakteryjną maści Taconal wobec szczepów S. aureus izolowanych od pacjentów z ropnymi zmianami skórnymi.
Materiał i metody
Szczepy bakteryjne
Wykorzystane do badań szczepy Staphylococcus aureus zostały wyizolowane w latach 2015-2016 z materiałów pobranych z ropnych zmian skórnych od 11 pacjentów leczonych w Samodzielnym Publicznym Szpitalu Klinicznym nr 2 Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie. Do hodowli wyizolowanych bakterii używano podłoża Chapmana oraz Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (bioMèrieux). Inkubację prowadzono w temp. 37°C przez 24 godz. w warunkach tlenowych. W identyfikacji bakterii uwzględniano: barwienie metodą Grama, typ hemolizy na podłożu z krwią oraz zdolność do rozkładu mannitolu. Wykonywano test koagulazy probówkowej (Biomed) oraz test aglutynacyjny Slidex Staph-Kit (bioMèrieux). Szczep S. aureus ATCC 29213 został użyty jako szczep kontrolny.
Analiza olejku eterycznego
Do badań wykorzystano handlowy olejek z kopru włoskiego (OKW) firmy Pollena-Aroma. OKW przechowywano w temp. 4°C w butelce z ciemnego szkła.
Skład chemiczny olejku eterycznego oznaczono metodą chromatografii gazowej z detektorem mas (GC-MS). Analizę przeprowadzono z wykorzystaniem chromatografu gazowego Agilent Technologies 6890N z detektorem mas 5973 Network, wyposażonego w automatyczny dozownik próbek 7683 Series Injector. Rozdział substancji przeprowadzono na kolumnie chromatograficznej HP-5MSI (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm), z następującym programem temperaturowym: temperatura początkowa 50°C, przyrost 4°C/min do 290°C (całkowity czas analizy: 60 min). Pozostałe warunki analizy: jonizacja elektronowa EI (70 eV), gaz nośny: hel (1,2 ml/min), temperatura dozownika: 250°C, temperatura źródła jonów: 230°C, temperatura kwadrupola: 150°C. Chromatogramy całkowitego prądu jonowego rejestrowano w zakresie skanowania 20-500 m/z.
Do zbierania i obróbki danych wykorzystano program ChemStation. Identyfikację związków obecnych w badanym olejku eterycznym przeprowadzono na podstawie ich widm masowych, porównując je z widmami wzorców z biblioteki NIST02. Względną zawartość procentową zidentyfikowanych związków w badanym olejku określano, biorąc pod uwagę ich udział w całkowitym prądzie jonowym wszystkich związków obecnych w próbce.
Wrażliwość szczepów S. aureus na antybiotyki i chemioterapeutyki
Badanie wrażliwości szczepów gronkowców złocistych na gentamycynę – GE (10 μg), amikacynę – AN (30 μg), tobramycynę – TOB (10 μg), ciprofloksacynę – CIP (5 μg), lewofloksacynę – LVX (5 μg), trimetoprim/sulfametoksazol – SXT (1,25-23,75 μg), linezolid – LD (10 μg), rifampicynę – RA (5 μg) i mupirocynę – MUP (200 μg) (Becton Dickinson) przeprowadzono z wykorzystaniem metody dyfuzyjno-krążkowej. Oznaczenie oporności na metycylinę (fenotyp MRSA) przeprowadzono z wykorzystaniem krążka bibułowego nasączonego 30 μg cefoksytyny (FOX) (Becton Dickinson). Szczepy bakteryjne posiewano na podłoże Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej i inkubowano 24 godz. w temp. 37°C w warunkach tlenowych, a następnie sporządzano zawiesiny bakteryjne o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Tak przygotowane zawiesiny posiewano na podłożu Mueller-Hinton agar (MHA) (bioMèrieux), a następnie umieszczano na nich krążki z antybiotykami. Uzyskane wyniki interpretowano zgodnie z zaleceniami European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) (13).
Do określenia fenotypu oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B (MLSB) zastosowano metodę dyfuzyjno-krążkową zgodnie z rekomendacjami EUCAST (13) z zastosowaniem krążków z erytromycyną – E (15 μg) i klindamycyną – CC (2 μg) (Becton Dickinson) oraz podłoża MHA. Płytki inkubowano w warunkach tlenowych przez 18 godz. w temp. 37°C. Interpretacji wyników dokonywano według Leclercq (14). Oporność na oba antybiotyki (fenotyp konstytutywny) lub oporność na E i strefa zahamowania wzrostu w kształcie litery D wokół krążka z CC (fenotyp indukcyjny) świadczyła o obecności mechanizmu oporności MLSB.
Określenie minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla mupirocyny
MIC dla mupirocyny wyznaczono metodą E-test zgodnie z zaleceniami EUCAST (13). Paski z MUP (bioMèrieux) w gradiencie stężeń 0,064-1024 μg układano na podłożu MHA, na które uprzednio posiano zawiesiny szczepów S. aureus (0,5 w skali McFarlanda). Płytki inkubowano w warunkach tlenowych przez 18 godz. w temp. 37°C, po czym odczytywano wyniki badań.
Przygotowanie podłóż do badania wpływu OKW na aktywność bakteriobójczą maści Taconal
Podłoża mikrobiologiczne przygotowano według procedury opisanej przez Hammer i wsp. (15) w modyfikacji własnej. W tym celu do wysterylizowanego podłoża MHA o temp. 50°C dodawano OKW, tak aby uzyskać podłoża zawierające odpowiednio 0,25; 0,5 i 1,0% badanego olejku eterycznego. W celu równomiernej dyspersji olejku do mieszaniny dodawano Tween 80 (1%) (Sigma-Aldrich). Całość mieszano przy użyciu mieszadła mechanicznego do równomiernego rozprowadzenia olejku w całej objętości podłoża, a następnie przenoszono je za pomocą pipety serologicznej do sterylnych płytek Petriego (o średnicy 90 mm) i pozostawiano do zastygnięcia. Płytki umieszczano następnie na 1 godz. w cieplarce w temp. 37°C.
Określenie wpływu OKW na aktywność przeciwbakteryjną maści Taconal
Wpływ OKW na aktywność przeciwbakteryjną maści Taconal wobec szczepów S. aureus oznaczano metodą dyfuzyjno-krążkową. 24-godzinne hodowle S. aureus rozcieńczano w płynie fizjologicznym (0,9% NaCl) do gęstości 0,5 w skali McFarlanda i nanoszono na płytki z przygotowanymi podłożami MHA, następnie na płytkach układano krążki bibułowe (o średnicy 9 mm) nasączone 25 μl roztworem maści Taconal firmy Aflofarm (1 g/ml wody destylowanej). Czas nasączania wynosił 1 godz. Płytki wraz z ułożonymi na nich krążkami inkubowano przez 18 godz. w temperaturze 37°C. Po inkubacji odczytywano strefy zahamowania wzrostu w mm. Jako kontrolę użyto SXT (trimetoprim/sulfametoksazol) (1,25/23,75 μg) firmy Diag-Med (o średnicy 6 mm). Wszystkie doświadczenia wykonano w trzech powtórzeniach.
Wyniki
Skład chemiczny OKW
Analiza chemiczna olejku eterycznego z kopru włoskiego wykazała obecność 11 związków, wśród których dominującym składnikiem był trans-anetol (77,9%). W badanym olejku stwierdzono również znaczącą ilość fenchonu (12,8%), w mniejszych ilościach występowały: α-pinen (3,8%), estragol (2,3%) i limonen (2,1%) i inne związki. Wyniki szczegółowej analizy składu chemicznego OKW zostały przedstawione w tabeli 1.
Tab. 1. Skład olejku z kopru włoskiego (OKW) wyznaczony metodą GC-MS
| Związek | Czas retencji
RT (min) | Zawartość względna (%) |
| α-Pinen* | 5,52 | 3,8 |
| Kamfen | 5,89 | 0,1 |
| β-Pinen | 6,63 | 0,1 |
| Mircen | 7,03 | 0,2 |
| α-Felandren | 7,41 | 0,2 |
| Limonen* | 8,13 | 2,1 |
| γ-Terpinen | 9,07 | 0,2 |
| Fenchon* | 10,05 | 12,8 |
| Estragol* | 13,75 | 2,3 |
| Aldehyd anyżowy | 15,86 | 0,3 |
| trans-Anetol* | 16,96 | 77,9 |
*główne składniki OKW
Wrażliwość szczepów S. aureus na antybiotyki i chemioterapeutyki
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Dryden MS. Complicated skin and soft tissue infection. J Antimicrob Chemother 2010; 65:35-44.
2. van Belkum A, Melles DC, Snijders SV i wsp. Clonal distribution and differential occurrence of the enterotoxin gene cluster, egc, in carriage-versus bacteremia-associated isolates of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2006; 44:1555-7.
3. Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev 2000; 13:16-34.
4. El-Sayed AK, Hothersall J, Cooper SM i wsp. Characterization of the mupirocin biosynthesis gene cluster from Pseudomonas fluorescens NCIMB 10586. Chem Biol 2003; 10:419-30.
5. Esquivel-Ferriño PC, Favela-Hernández JM, Garza-González E i wsp. Antimycobacterial activity of constituents from Foeniculum vulgare var. dulce grown in Mexico. Molecules 2012; 17:8471-82.
6. Ozbek H, Uğraş S, Dülger H i wsp. Hepatoprotective effect of Foeniculum vulgare essential oil. Fitoter 2003; 74:317-9.
7. Gori L, Gallo E, Mascherini V i wsp. Can estragole in fennel seed decoctions really be considered a danger for human health? A fennel safety update. Evid Based Complement Alternat Med 2012; 2012:860542.
8. Shahat AA, Ibrahim AY, Hendawy SF i wsp. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of essential oils from organically cultivated fennel cultivars. Molecules 2011; 16:1366-77.
9. Diao WR, Hu QP, Zhang H i wsp. Chemical composition, antibacterial activity and mechanism of action of essential oil from seeds of fennel (Foeniculum vulgare Mill.). Food Control 2014; 35:109-16.
10. Badgujar SB, Patel VV, Bandivdekar AH. Foeniculum vulgare Mill: A review of its botany, phytochemistry, pharmacology, contemporary application, and toxicology. Biomed Res Int 2014; 2014:842674.
11. Tripathi P, Tripathi R, Patel RK i wsp. Investigation of antimutagenic potential of Foeniculum vulgare essential oil on cyclophosphamide induced genotoxicity and oxidative stress in mice. Drug Chem Toxicol 2013; 36:35-41.
12. Wakabayashi KA, de Melo NI, Aguiar DP i wsp. Anthelmintic effects of the essential oil of fennel (Foeniculum vulgare Mill., Apiaceae) against Schistosoma mansoni. Chem Biodivers 2015; 12:1105-14.
13. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Breakpoints tables for interpretation of MICs and zones diameters. Version 5.0, 2015. http://www.eucast.org.
14. Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin Infect Dis 2002; 34:482-92.
15. Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. J Appl Microbiol 1999; 86:985-90.
16. Aiyegoro OA, Okoh AI. Use of bioactive plant products in combination with standard antibiotics: implications in antimicrobial chemotherapy. J Med Plants Res 2009; 3:1147-52.
17. Stefanović O, Comic L. Synergistic antibacterial interaction between Melissa officinalis extracts and antibiotics. J Appl Pharm Sci 2012; (2):1-5.
18. Bassolè IH, Juliani HR. Essential oils in combination and their antimicrobial properties. Molecules 2012; 17:3989-4006.
19. Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Oznaczanie wrażliwości ziarniaków Gram-dodatnich z rodzaju Staphylococcus spp. Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów 2009.
20. Gradinaru AC, Miron A, Trifan A i wsp. Screening of antibacterial effects of anise essential oil alone and in combination with conventional antibiotics against Streptococcus pneumoniae clinical isolates. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 2014; 118:537-43.
21. Angioni A, Barra A, Coroneo V i wsp. Chemical composition, seasonal variability, and antifungal activity of Lavandula stoechas L. ssp. stoechas essential oils from stem/leaves and flowers. J Agric Food Chem 2006; 54:4364-70.
22. Shin S, Pyun MS. Anti-Candida effects of estragole in combination with ketoconazole or amphotericin B. Phytother Res 2004; 18:827-30.
23. Tserennadmid R, Takó M, Galgóczy L i wsp. Anti yeast activities of some essential oils in growth medium, fruit juices and milk. Int J Food Microbiol 2011; 144:480-6.
24. Sekar M, Rashid NA. Formulation, evaluation and antibacterial properties of herbal ointment containing methanolic extract of Clinacanthus nutans leaves. Int J Pharm Clin Res 2016; 8:1170-4.
25. Worthington T, Karpanen T. Use of chlorhexidine in combination with essential oil in manufacturing medicament useful for prevention and/or treatment of infection in the skin below stratum corneum, infection of the dermis, and infection of hair follicle. US20110117223 A1 (2011).
