Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Medycyna Rodzinna 2/2020, s. 65-71 | DOI: 10.25121/MR.2020.23.2.65
Angelika Dominikowska, Robert Kubina, Anna Kleczka, Magdalena Wyszyńska, Agata Kabała-Dzik
Ocena wpływu resweratrolu oraz kwasu α-liponowego na cytotoksyczność jonów fluorkowych w stosunku do ludzkich fibroblastów płucnych IMR-90
The effect of resveratrol and α-lipoic acid on the cytotoxicity of fluoride ions to human lung fibroblasts IMR-90
Katedra i Zakład Patologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Summary
Introduction. Fluorine belongs to xenobiotics that cause disorders in the oxidative-reducting system. Recent studies with fluoride concern the use of natural products containing vitamins or antioxidant to prevent the oxidative stress generated by exposure to fluoride.
Aim. The aim of the research was to evaluate the impact of resveratrol and α-lipoic acid on the cytotoxicity of fluoride relative to human lung fibroblasts IMR-90.
Material and methods. In order to determine cytotoxicity of fluorine on human lung fibroblasts IMR-90, the cells were cultured with different NaF concentrations: 30, 60, 90, 120 and 150 μg/ml. Cytotoxicity of the examined cells was also determined in cultures incubated with the resveratrol (RV) and α-lipoic acid (LA) in various combination of concentration: RV 3 μM and LA 25 μg/ml; RV 10 μM and LA 25 μg/ml. MTT test was used to evaluate the viability of the cells. The cytotoxicity assessment was carried out in three time intervals: after 24, 48 and 72 h.
Results. It has been observed that NaF is cytotoxic in relation to the examined cell line, depending on its concentration and exposure time of cells. No significant changes have been observed in relation to the viability of the examined cells in cultures with combinations of different concentrations of the examined antioxidants. Preincubation of fibroblasts with RV and LA positively affected viability of cells cultured with NaF. The beneficial effect of the tested compounds was dependent on its concentrations, level of NaF and exposure time.
Conclusions. The results indicate that a diet containing α-lipoic acid and resveratrol can play a protective role in exposed to fluoride.
Wprowadzenie
Wiedza zarówno na temat korzystnego, jak i negatywnego działania fluoru jest bardzo duża. Wielu naukowców udowodniło, że jest on niezbędnym pierwiastkiem biorącym udział w prawidłowym rozwoju kości i zębów. Niestety, jest też „druga twarz” fluoru ? ta negatywna. Ujawnia się ona w przypadku masowego narażenia na duże stężenie fluoru w wodzie pitnej czy żywności, co prowadzi nie tylko do fluorozy, ale także do zaburzenia czynności wielu narządów, w tym neurologicznych.
Fluor jest najlżejszym pierwiastkiem wśród fluorowców. To żółtozielony gaz o mocnym zapachu, który przypomina kwas chlorowy (I) (1). Jest pierwiastkiem bardzo reaktywnym (2) i w przyrodzie nigdy nie występuje w stanie wolnym. Można go jedynie spotkać w postaci związków z innymi pierwiastkami. Fluor został opisany jako istotny składnik odżywczy organizmu, jak również należy do listy 14 elementów uznanych za niezbędne dla prawidłowego wzrostu i rozwoju człowieka (3). Jest on podstawowym komponentem budulcowym kości i zębów, w których występuje 99% jego ilości znajdującej się w organizmie. Instytut Medycyny Amerykańskiej Akademii Nauk opracował zalecane normy żywieniowe dla spożycia fluoru (4). Narażenie na fluor może występować w miejscach endemicznego występowania fluoru, w zakładach przemysłowych i ich otoczeniu, jak również ze strony pożywienia.
Endemiczna fluoroza jest chorobą występującą na całym świecie, spowodowaną głównie spożyciem nadmiernej ilości fluoru w trzech formach: z wodą i herbatą o zwiększonej zawartości fluoru oraz pieczoną żywnością, zanieczyszczoną fluorem pochodzącym z węgla, na którym była przygotowywana.
Fluor może prowadzić do zakłócenia funkcji mózgu, obniża IQ, pobudza wytwarzanie wolnych rodników, a co za tym idzie zwiększa ryzyko rozwoju choroby Alzheimera. Upośledza funkcjonowanie układu hormonalnego. Wpływa również na szyszynkę, co objawia się zmianami w produkcji melatoniny oraz w dojrzewaniu płciowym (przyspiesza pojawienie się pierwszej miesiączki). Przypuszcza się także, że fluor może inicjować procesy nowotworzenia, szczególnie w kościach. Przykładem takiego nowotworu jest kostniakomięsak, spowodowany działaniem mutagennym fluoru na komórki kostne. Kolejnym nowotworem, który może być zapoczątkowywany ekspozycją na fluor w miejscach pracy, jest rak pęcherza moczowego (5). Fluor powoduje zmiany hematologiczne: niedokrwistość, zmiany w kształcie i wielkości erytrocytów, obecność ciałek Heinza w erytrocytach, eozynofilię i limfopenię, zwiększenie ilości methemoglobiny oraz zmiany wartości hematokrytu (6). Fluor powoduje także zmiany w układzie krążenia, które objawiają się zmniejszeniem sprężystości aorty oraz rozwojem nadciśnienia tętniczego (7). Fluor wykazuje toksyczne działanie w badaniach przeprowadzonych na hodowlach komórkowych. W ludzkich fibroblastach dziąsłowych efekty wywoływane przez fluor zależą od dawki i czasu ekspozycji na jego związki. Fluor powoduje zmniejszenie potencjału błonowego mitochondriów, trudności w syntezie DNA oraz wyczerpanie komórkowego GSH (8).
Kwas α-liponowy jest antyoksydantem pełniącym wiele funkcji. Wykazuje aktywność przeciwzapalną, a także jest pomocny w zaburzeniach mitochondrialnych. Jest kofaktorem enzymów, w tym kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej oraz kompleksu dehydrogenazy α-ketoglutaranu. Są to dwa mitochondrialne enzymy uczestniczące w metabolizmie glukozy i produkcji energii (9). LA jest również zdolny do zmiatania ROS, w tym rodnika hydroksylowego i tlenu singletowego. Bezpośrednio reaguje z nadtlenoazotynem ? wysoce reaktywnym oksydantem, uważanym za głównego sprawcę wszystkich cytotoksycznych działań tlenku azotu. Zmniejszenie stresu oksydacyjnego za pośrednictwem LA odbywa się również poprzez odtwarzanie innych przeciwutleniaczy, a także hamowanie peroksydacji lipidów. LA oprócz zdolności do bezpośredniego zmiatania ROS wywiera działanie przeciwutleniające poprzez chelatowanie metali przejściowych, głównie dwuwartościowych. Tworzy trwałe związki z dwuwartościowymi jonami metali, takimi jak: mangan, miedź, żelazo i cynk (10). Endogenny selen organiczny nie działa bezpośrednio na wolne rodniki, ale pośrednio pełni rolę kofaktora GPX, a tym samym uczestniczy w reakcji redukcji H2O2 i ponadtlenku.
Resweratrol będący przedstawicielem przeciwutleniaczy fenolowych występuje w największych ilościach w czerwonych winogronach. Wykazuje działanie antyoksydacyjne, przeciwnowotworowe i przeciwzapalne. Chroni przed powstawaniem nadtlenków lipoprotein o niskiej gęstości i liposomów, jest silnym inhibitorem lipooksygenazy. Jego właściwości antyoksydacyjne są związane z obecnością grup hydroksylowych w jego cząsteczce (11). RV jest w stanie zwiększyć aktywność enzymów antyoksydacyjnych układu odpornościowego: SOD, CAT i GPX. Ponadto zarówno w warunkach normalnych, jak i stresu oksydacyjnego zwiększa poziom zredukowanego GSH. RV hamuje produkcję ROS poprzez ich bezpośrednie wychwytywanie, czyli zjawisko zmiatania (12).
Cel pracy
Celem pracy była ocena wpływu resweratrolu oraz kwasu α-liponowego na żywotność ludzkich fibroblastów płucnych linii IMR-90 hodowanych w obecności różnych stężeń jonów fluorkowych wywołujących działanie cytotoksyczne na badane komórki.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiła linia komórkowa ludzkich fibroblastów płucnych IMR-90. W doświadczeniu użyto fluorku sodu (NaF) firmy Avantor Performance Materials Poland SA oraz antyoksydantów: kwasu alfa-liponowego (LA) firmy Sigma-Aldrich oraz resweratrolu (RV) firmy Sigma-Aldrich. Badania in vitro prowadzono w butelkach hodowlanych o powierzchni 75 cm2, w określonym środowisku składającym się z podłoża Eagle’a (MEM) zawierającego dodatkowo: 2 mM L-glutaminy, 4,5 g/l glukozy, 1 mM pirogronianu sodowego, 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% roztwór niezbędnych aminokwasów (MEM Non-essential Amino Acid Solution) oraz antybiotyki: 100 IU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny oraz 0,25 μg/ml amfoterycyny B. Komórki hodowano w inkubatorze z dopływem CO2 w temperaturze 37?°C oraz atmosferze nasyconej parą wodną z dodatkiem 5% CO2.
W celu oceny cytotoksyczności fluoru badano żywotność komórek w obecności różnych stężeń NaF w podłożach: 30, 60, 90, 120 i 150 μg/ml. Podobną hodowlę przeprowadzono w obecności różnych kombinacji stężeń LA i RV: RV 3 μM i LA 25 μg/ml; RV 10 μM i LA 25 μg/ml dodanych do podłoża łącznie z fluorkiem sodu w 4 wybranych stężeniach (30, 60, 90, 120 μg/ml). Oznaczenie cytotoksyczności wykonano po 24, 48 i 72 godz. W celu określenia cytotoksyczności fluoru zastosowano test MTT firmy Sigma-Aldrich.
Analiza statystyczna
Do utworzenia bazy danych wykorzystano program Excel 2010 firmy Microsoft. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu Statistica 12.0 firmy StatSoft Polska. Podobieństwo rozkładu zmiennych do rozkładu normalnego sprawdzano testem Shapiro-Wilka. Do oceny istotności statystycznej uzyskanych wyników wykorzystano test t-Studenta oraz analizę wariancji ANOVĘ. Za istotne statystycznie zmiany uznano wartości p < 0,05.
Badania finansowane były z umowy nr KNW-1-025/N/5/0.
Wyniki
Ocena aktywności cytotoksycznej fluoru w stosunku do fibroblastów płucnych linii IMR-90
Na rycinie 1 przedstawiono wpływ różnych stężeń NaF na żywotność ludzkich fibroblastów płucnych linii IMR-90 wyrażoną w (%) po 24, 48 i 72 godz. inkubacji komórek. Zaobserwowano istotne statystycznie obniżenie żywotności fibroblastów płucnych w zależności od stężenia NaF i czasu inkubacji w stosunku do żywotności obserwowanej w grupie kontrolnej. Obniżenie znamienne statystycznie cytotoksyczności w stosunku do hodowli kontrolnej wykazano przy stężeniach NaF 60, 90, 120 i 150 μg/ml w każdym analizowanym czasie.
Ryc. 1. Żywotność ludzkich fibroblastów płucnych linii IMR-90 wyrażona w (%) w hodowlach prowadzonych w obecności różnych stężeń NaF (μg/ml) po 24, 48 i 72 godz. inkubacji
** istotność statystyczna na poziomie p < 0,01
*** istotność statystyczna na poziomie p < 0,001
W tabeli 1 przedstawiono wartości IC50 w zależności od czasu inkubacji, które wyrażają stężenie NaF (μg/ml) hamujące w 50% żywotność komórek. Uzyskane wartości IC50, wraz ze wzrostem czasu inkubacji ludzkich fibroblastów płucnych linii IMR-90 z NaF maleją.
Tab. 1. Stężenie NaF (μg/ml) hamujące w 50% żywotność ludzkich fibroblastów płucnych linii IMR-90 w zależności od czasu inkubacji (godz.)
Czas inkubacji (godz.)Wartość IC50 NaF [μg/ml]
24276,84
48183,43
7290,62
Wpływ resweratrolu oraz kwasu α-liponowego na aktywność cytotoksyczną fluoru w badaniach in vitro
Na rycinie 2 zobrazowano wpływ 3 μM RV i 25 μg/ml LA na cytotoksyczność wywołaną przez różne stężenia NaF. Podanie antyoksydantów spowodowało podwyższenie żywotności ludzkich fibroblastów płucnych po 24, 48 i 72 godz. w obecności 30 μg/ml NaF.
Ryc. 2. Wpływ antyoksydantów w stężeniach 3 μM RV i 25 μg/ml LA na żywotność ludzkich fibroblastów płucnych linii IMR-90 wyrażona w (%) w hodowlach narażonych na różne stężenia NaF po 24, 48 i 72 godz. inkubacji
* istotność statystyczna na poziomie p < 0,05
** istotność statystyczna na poziomie p < 0,01
*** istotność statystyczna na poziomie p < 0,001

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2020-04-10
zaakceptowano do druku: 2020-05-04

Adres do korespondencji:
Robert Kubina
Katedra i Zakład Patologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Ostrogórska 30, Katowice
tel.: +48 (32) 364-13-54
rkubina@sum.edu.pl

Medycyna Rodzinna 2/2020
Strona internetowa czasopisma Medycyna Rodzinna