*Marcin Szymański, Justyna Staniszewska
Badania jakościowe i ilościowe wyciągów z Inonotus obliquus
Qualitative and quantitative studies of Inonotus obliquus extracts
Centrum Zaawansowanych Technologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Dyrektor Centrum: prof. dr hab. n. chem. Bronisław Marciniak
Streszczenie
Wstęp. Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát jest grzybem spotykanym na terenach Ameryki Północnej, Finlandii, Polski, Rosji, Chin, Japonii i Korei na korze drzew, najczęściej Betula pendula, B. pubescens, B. carpatica i Fagus sylvatica. Wyciągi z grzyba wykazują szereg aktywności biologicznych, uwarunkowanych obecnością: polisacharydów, związków fenolowych (kwasy fenolowe i flawonoidy), triterpenów, ergosterolu i jego nadtlenku.
Cel pracy. Oznaczenie zawartości sumy związków polifenolowych, w tym sumy kwasów fenolowych, flawonoidów i flawonoli w wyciągu wodnym, metanolowym i metanolowo-wodnym, oznaczenie aktywności antyoksydacyjnej oraz jakościowe oznaczenie składu wyciągu chloroformowym z owocnika Inonotus obliquus, zebranego ze stanowiska naturalnego.
Materiał i metody. Surowiec do badań zebrano w Puszczy Noteckiej w Sierakowskim Parku Krajobrazowym. Owocnik został wysuszony, a następnie zmielony na drobny proszek. Wykorzystując metody spektroskopowe, oznaczono sumę polifenoli z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, sumę kwasów fenolowych metodą Arnova, sumę flawonoli z chlorkiem glinu, sumę flawonoidów według metody opisanej w FP X, aktywność antyoksydacyjną za pomocą rodnika DPPH oraz skład wyciągu chloroformowego za pomocą GC-MS.
Wyniki. Najwyższą zawartość sumy polifenoli w przeliczeniu na kwas kawowy oznaczono w wyciągu wodnym (1,85%), a najniższą w wyciągu metanolowym (1,01%). Wyciąg metanolowy charakteryzował się najwyższą zawartością sumy kwasów fenolowych w przeliczeniu na kwas kawowy (0,127%), a najniższą wyciąg wodno-metanolowy (0,047%). Zawartość sumy flawonoidów i sumy flawonoli oznaczono wyłącznie w wyciągach metanolowych, gdyż wytrącający się osad uniemożliwił przeprowadzenie oznaczeń w pozostałych wyciągach. Najniższą wartość parametru IC50 wyznaczono dla wyciągu wodno-metanolowego. Analiza GC-MS pozwoliła zidentyfikować m.in.: izowanilinę, santalen, α-selinen, aldehyd syryngowy, kwas linolowy, tymol, α-bergamoten i lanosterol.
Wnioski. Najwyższą zawartość sumy polifenoli oznaczono w wyciągu wodnym z Inonotus obliquus, sumy kwasów fenolowych w wyciągu metanolowym; wyciąg wodno-metanolowy charakteryzował się najsilniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi. Analiza GC-MS wykazała obecność licznych związków o potwierdzonej aktywności biologicznej.
Summary
Introduction. Inonotus obliquus (Ach. Ex Pers.) Pilát is a fungus found in North America, Finland, Poland, Russia, China, Japan and Korea on the bark of trees, most often Betula pendula, B. pubescens, B. carpatica and Fagus sylvatica. Mushroom extracts show a number of biological activities, due to the presence of: polysaccharides, phenolic compounds (phenolic acids and flavonoids), triterpenes, ergosterol and its peroxide.
Aim. Determination of the content of the sum of polyphenolic compounds, including the sum of phenolic acids, flavonoids and flavonols in water, methanol and methanol-water extracts, determination of antioxidant activity and qualitative determination of the composition of the chloroform extract from the fruiting body of Inonotus obliquus, collected from a natural site.
Material and methods. The raw material for research was collected in the Noteć Forest in the Sieraków Landscape Park. The fruiting body was dried and then ground into a fine powder. Using spectroscopic methods, the sum of polyphenols with the Folin-Ciocalteu reagent, the sum of phenolic acids using the Arnov method, the sum of flavonols with aluminum chloride, the sum of flavonoids according to the method described in FP X, antioxidant activity with the DPPH radical and the composition of the chloroform extract using GC-MS were determined.
Results. The methanol extract was characterized by the highest content of the sum of phenolic acids per coffee acid (0.127%), and the lowest content of water-methanol extract (0.047%).
The highest content of the sum of polyphenols in terms of caffeic acid was determined in the aqueous extract (1.85%), and the lowest in the methanol extract (1.01%). The methanol extract was characterized by the highest content of the sum of phenolic acids expressed as coffee acid (0.127%), and the lowest content of water-methanol extract (0.047%). The content of total flavonoids and total flavonols was determined only in methanol extracts, because the precipitation made it impossible to perform the determinations in the remaining extracts. The lowest IC50 value was determined for the water-methanol extract. GC-MS analysis allowed to identify, among others: isovanillin, santalene, α-selinene, syringaldehyde, linoleic acid, thymol, α-bergamotene and lanosterol.
Conclusions. The highest content of the sum of polyphenols was determined in the water extract of Inonotus obliquus, the sum of phenolic acids in the methanol extract; the water-methanol extract was characterized by the strongest antioxidant properties. GC-MS analysis revealed the presence of numerous compounds with confirmed biological activity.
Wstęp
Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát występuje na terenach: Ameryki Północnej, Finlandii, Polski, Rosji (Wschodnia Syberia, częściowe regiony półwyspu Kamczatka), Chin – Prowincja Heilongjiang, obszar gór Changbai z prowincji Jilin, Japonii – Hokkaido i Korei (1).
Inonotus obliquus rośnie najczęściej na korze drzew, takich jak: Betula pendula, B. pubescens, B. carpatica, Fagus sylvatica, rzadziej na: Acer campestre, A. pseudoplatanus, Alnus glutinosa, A. incana, Fraxinus excelsior, Quercus cerris, Q. petraea, Q. robur, Q. delachampii, Ulmus sp. (2).
Najwięcej doniesień na temat aktywności farmakologicznej owocników tego grzyba pochodzi z Niemiec, Japonii, Korei i Chińskiej Republiki Ludowej. Wyciągi z Inonotus obliquus wykazują działanie przeciwzapalne (3), immunomodulujące i stymulujące (4-6), przeciwnowotworowe (6-10), przeciwwirusowe (11, 12), przeciwbólowe (3), antyagregacyjne (13), przeciwuczuleniowe (14), hipoglikemiczne i hipolipemiczne (15) oraz antyoksydacyjne (16). Owocniki tego grzyba są bogatym źródłem różnych związków biologicznie czynnych, takich jak: polisacharydy (15), związki fenolowe, w tym kwasy fenolowe i flawonoidy (17), triterpeny (18), ergosterol i nadtlenek ergosterolu (19) oraz melanina (20).
Cel pracy
Celem pracy było oznaczenie zawartości sumy związków polifenolowych, w tym sumy kwasów fenolowych, flawonoidów i flawonoli w wyciągu wodnym, metanolowym i metanolowo-wodnym, oznaczenie aktywności antyoksydacyjnej oraz jakościowe oznaczenie składu wyciągu chloroformowego z owocnika Inonotus obliquus, zebranego ze stanowiska naturalnego.
Materiał i metody
Materiał badawczy
Owocnik Inonotus obliquus, który wykorzystano do badań (ryc. 1a-c), zebrano z pnia żywej brzozy (Betula pendula Rorh.) w Puszczy Noteckiej (Sierakowski Park Krajobrazowy). Po wysuszeniu w cieniu i przewiewie w temp. pokojowej owocnik zmielono na drobny proszek.
Ryc. 1a-c. Błyskoporek podkorowy (Inonotus obliquus) (autor zdjęć: dr Marcin Szymański)
Sporządzono trzy rodzaje wyciągów: wodny, metanolowo-wodny i metanolowy. W tym celu odważano po 2,50 g sproszkowanego surowca. Wyciągi wykonywano w następujący sposób:
– wodny – sproszkowany surowiec zalano wodą destylowaną i ogrzewano 20 min na łaźni wodnej w temp. 94°C. Ekstrakcję w tych samych warunkach powtórzono czterokrotnie, łącząc otrzymane wyciągi,
– wodno-metanolowy: sproszkowany surowiec ekstrahowano 50% roztworem metanolu 20 min na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną, w temp. 90°C. Ekstrakcję w tych samych warunkach powtórzono czterokrotnie, łącząc otrzymane wyciągi,
– metanolowy – sproszkowany surowiec ekstrahowano na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną w temp. 74°C. Ekstrakcję w tych samych warunkach powtórzono czterokrotnie, łącząc otrzymane wyciągi.
Metody badawcze
Oznaczenie straty masy po suszeniu
Odważono na szalkę wagosuszarki 1000 ± 1 mg surowca i przeprowadzono proces suszenia w temp. 104°C. Na podstawie różnicy mas przed i po suszeniu obliczono % suchej masy. Czynność powtórzono trzykrotnie. Średnia z trzech pomiarów stanowiła wynik pomiaru.
Oznaczenie sumy polifenoli z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (FC)
Odczynnik FC jest heteropolifosforowolframianem molibdenu (powstaje z wolframianu sodu [Na2WO3] zmieszanego z molibdenianem sodu [Na2MoO4] i siarczanem litu [Li2SO4], wodą bromową oraz kwasami: fosforowym i solnym).
Jest to metoda kolorymetryczna oparta na proporcjonalnym wzroście natężenia barwy roztworu w stosunku do zawartości w próbie różnych związków fenolowych, reagujących z odczynnikiem FC w mieszaninie z 20% roztworem węglanu sodu. Pomiar wykonuje się przy długości fali λ = 760 nm.
Do 9 owiniętych w folię aluminiową probówek miarowych o pojemności 2 ml dodano 1,48 ml wody, destylowanej, 0,02 ml roztworu podstawowego, 0,1 ml FC, a po minucie 0,4 ml 20% roztworu węglanu sodu. Pomiar absorbancji przeprowadzono po 30 min przy długości fali λ = 760 nm wobec próby odniesienia, zawierającej powyższe odczynniki z pominięciem roztworu podstawowego.
Do obliczeń sumy polifenoli wykorzystano równanie krzywej y = ax + b (w przeliczeniu na kwas kawowy). W obliczeniach uwzględniono straty masy po suszeniu.
Oznaczenie sumy kwasów fenolowych metodą Arnova
Do ilościowego oznaczenia kwasów fenolowych w Inonotus obliquus zastosowano metodę kolorymetryczną Arnova. Polega ona na pomiarze absorbancji roztworu badanego po dodaniu odczynników: kwasu solnego, odczynnika Arnova i wodorotlenku sodu. Wartości absorbancji i intensywności zabarwienia badanej próby są proporcjonalne do zawartości kwasów fenolowych. Pomiaru dokonano przy długości fali λ = 490 nm, w kuwetach plastikowych o grubości 10 mm, przy użyciu spektrofotometru UV/VIS Lambda 35.
Do 7 probówek miarowych o pojemności 10 ml odmierzono po 5 ml wody. Przeniesiono kolejno podane objętości roztworu podstawowego kwasu kawowego: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 ml, co odpowiada 40, 80, 120, 160, 200, 240, 280 μg kwasu kawowego. Zawartość probówek wymieszano. Do każdej probówki dodano w następującej kolejności odczynniki:1 ml kwasu solnego 18 g/l, 1 ml odczynnika Arnova i 1 ml roztworu wodorotlenku sodu 40 g/l. Probówki uzupełniono wodą do współmierności i dokładnie wymieszano. Absorbancję mierzono natychmiast wobec próby odniesienia (przygotowana jak próba badana, ale z pominięciem roztworu podstawowego kwasu kawowego). Dla każdego stężenia roztworu wzorcowego przygotowano po 5 powtórzeń.
Do 10 probówek miarowych o pojemności 2 ml odmierzono po 1,2 ml wody i po 0,2 ml uzyskanego wyciągu. Po wymieszaniu do każdej probówki dodano kolejno: 0,2 ml kwasu solnego 18 g/l; 0,2 ml odczynnika Arnova; 0,2 ml roztworu wodorotlenku sodu 40 g/l. Probówki uzupełniono wodą do 2,0 ml, dokładnie wymieszano i natychmiast mierzono absorbancję wobec próby odniesienia (mieszanina odczynników bez wyciągu).
Z uwagi na intensywną barwę wyciągu zmierzono absorbancje tła. W dalszych obliczeniach odejmowano średnią wartość absorbancji tła od zmierzonej absorbancji określonej próbki.
Oznaczenie sumy flawonoli
Oznaczanie zawartości flawonoli przeprowadzono metodą spektrofotometryczną, która opiera się na pomiarze absorbancji badanych próbek po uprzednim dodaniu roztworów chlorku glinu i octanu sodu. Pomiary zabarwionych roztworów przeprowadzono przy długości fali λ = 440 nm i długości drogi optycznej 1 cm; próbką odniesienia był metanol. Uzyskane wyniki przeliczono na rutynę na podstawie przygotowanej uprzednio krzywej wzorcowej.
Do probówek miarowych o pojemności 5 ml dodano roztwór podstawowy wzorcowej rutyny (o stężeniu C = 0,5 mg/ml) kolejno w ilościach: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 ml. Probówki uzupełniono metanolem do objętości 5 ml. Uzyskano rozcieńczenia roztworu podstawowego wzorcowej rutyny o stężeniach odpowiednio 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10 mg/ml. Następnie do probówek o pojemności 10 ml dodano kolejno: 2 ml każdego z rozcieńczeń podstawowego roztworu rutyny, 2 ml roztworu chlorku glinu, 3 ml roztworu octanu sodu. Próbki dokładnie wymieszano i pozostawiono na 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dokonano pomiaru absorbancji, przy długości fali λ = 440 nm o długości drogi optycznej l = 1 cm, wobec próbki odniesienia – metanolu. Sporządzono wykres krzywej wzorcowej A = aC + b dla rutyny (A – absorbancja; C – stężenie).
Do analizy pobrano 2 ml badanego roztworu i dodano: 2 ml roztworu chlorku glinu, 3 ml roztworu octanu sodu. Dalsza część analizy przebiegała analogicznie jak przy pomiarze absorbancji dla roztworu wzorcowego. Przy pomocy równania krzywej wzorcowej, obliczono zawartość flawonoli w badanej próbce.
Oznaczanie sumy flawonoidów
Umieszczono 5,0 ml roztworu podstawowego w kolbie okrągłodennej i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość przeniesiono, używając 8 ml mieszaniny 10 objętości metanolu i 100 objętości bezwodnego kwasu octowego do kolby miarowej o objętości 25 ml. Przemyto kolbę okrągłodenną 3 ml mieszaniny: 10 objętości metanolu i 100 objętości bezwodnego kwasu octowego i przeniesiono do tej samej kolby miarowej pojemności 25 ml. Dodano 10 ml roztworu zawierającego 25 g/l kwasu borowego i 20,0 g/l kwasu szczawiowego w bezwodnym kwasie mrówkowym i uzupełniono bezwodnym kwasem octowym do 25,0 ml.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Zhong X-H, Ren K, Shi-jie L. Progress of research on Inonotus obliquus. Chin J Integr Med 2009; 15(2):156-60.
2. Lee MW, Hur H, Chang KC. Introduction to distribution and ecology of sterile conks of Inonotus obliquus. Mycobiol 2008; 36(4):199-202.
3. Park YM, Won JH, Kim YH i wsp. In vivo and in vitro anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of the methanol extract of Inonotus obliquus. J Ethnopharmacol 2005; 101:120-8.
4. Kim YR. Immunomodulatory activity of the water extract from medicinal mushroom Inonotus obliquus. Mycobiol 2005; 33(3):158-62.
5. Kim YO, Han SB, Lee HW i wsp. Immuno-stimulating effect of the endo-polysaccharide produced by submerged culture of Inonotus obliquus. Life Sci 2005; 77:2438-56.
6. Staniszewska J, Szymański M, Ignatowicz E. Antitumor and immunomodulatory effects of Inonotus obliquus. Herba Pol 2017; 63(2):48-58.
7. Youn MJ, Kim JK, Park SY i wsp. Chaga mushroom (Inonotus obliquus) induces Go/G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells. World J Gastroenterol 2008; 14(4):511-7.
8. Youn MJ, Kim JK, Park SY i wsp. Potential anticancer properties of the water extract of Inontus obliquus by induction of apoptosis in melanoma B16-F10 cells, J Ethnopharmacol 2009; 121:221-8.
9. Chen C, Zheng W, Gao X i wsp. Aqueous Extract of Inonotus obliquus (Fr.) Pilat (Hymenochaetaceae) significantly inhibits the growth of sarcoma 180 by inducing apoptosis. Am J Pharmacol Toxicol 2007; 2(1):10-7.
10. Duru KC, Kovaleva EG, Danilova IG i wsp. The pharmacological potential and possible molecular mechanisms of action of Inonotus obliquus from preclinical studies. Phytother Res 2019; 33:1966-80.
11. Ichimura T, Otake T, Mori H i wsp. HIV-1 protease inhibition and anti-HIV effect of natural and synthetic water-soluble ligninlike substance. Biosci Biotechnol Biochem 1999; 63(12):2202-4.
12. Brandt CR, Piraino F. Mushroom antivirals. Recent Res Dev Antimicrob Agents Chemother 2000; 4:11-26.
13. Hyun KW, Jeong SC, Lee DH i wsp. Isolation and characterization of a novel platelet aggregation inhibitory peptide from the medicinal muchroom, Inonotus obliquus. Peptides 2006; 27:1173-8.
14. Yoon TJ, Lee SJ, Kim EY i wsp. Inhibitory effect of chaga mushroom extract on compound 48/80-induced anaphylactic shock and IgE production in mice. International Immunopharmacology 2013; 15:666-70.
15. Mizuno T, Zhuang C, Kuniaki A i wsp. Antitumor and hypoglycemic activities of polysaccharides from the Sclerotia and Mycelia of Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pil. (Aphyllophoromycetideae). Int J Med Mushrooms 1999; 1(4):301-16.
16. Szychowski KA, Skóra B, Pomianek T i wsp. Inonotus obliquus – from folk medicine to clinical use. J Tradit Complement Med 2021; 11(4):293-302.
17. Lee IK, Kim YS, Jang YW i wsp. New antioxidant polyphenols from the medicinal mushroom Inonotus obliquus. Bioorg & Med Chem Lett 2007; 17:6678-81.
18. Zhao F, Mai Q, Ma J i wsp. Triterpenoids from Inonotus obliquus and their antitumor activities. Fitoter 2015; 101:34-40.
19. Kang J-H, Jang J-E, Mishra SK i wsp. Ergosterol peroxide from Chaga mushroom (Inonotus obliquus) exhibits anti-cancer activity by down-regulation of the β-catenin pathway in colorectal cancer. J Ethnopharmacol 2015; 173:303-12.
20. Babitskaia VG, Shcherba VV, Ikonnikova NV. Melanin complex of the fungus Inonotus obliquus. Prikl Biokhim Mikrobiol 2000; 36(4):439-44.
21. Tippman S, Scalcinati G, Siewers V i wsp. Production of farnesene and santalene by Saccharomyces cerevisiae using fed-betch cultivations with RQ- controlled feed, Biotechnol Bioengineer 2016; 113:72-81.
22. Akter K, Barnes EC, Loa Kum Cheung WL i wsp Antimicrobial and antioxidant activity and chemical characterization of Erythrina stricta Roxb. (Fabaceae). J Ethnopharmacol 2016; 185:171-81.
23. Zhong J, Huang CG, Yu YJ i wsp. Chemical constituents from Perovskia atriplicifolia. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2015; 40(6):1108-13.
24. Ransden CE, Zamora D, Majrzchak-Hong S i wsp. Re-evaluation of the traditional diet-heart hypothesis analysis of recovered data from Minnesota Coronary Experiment (1968-73) 2016; 353:1246.
25. Coccimiglio J, Alipour M, Jiang HZ i wsp. Antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of the ethanolic Origanum vulgare extract and it’s major constituents. Oxidative Med Cell Longev 2016; 9:1404505.
26. Lishuai M, Haixia C, Peng D i wsp. Anti-inflammatory and anticancer activities of extracts and compounds from the mushroom Inonotus obliquus. Food Chem 2013; 139:503-8.
