Badania nad zachowaniem się rozpuszczalnych receptorów TNF p55 i p75 w doświadczalnym zapaleniu otrzewnej*

The aim of the study was to evaluate changes in the soluble TNF receptors type p55 and p75 serum concentrations in animals with diffuse peritonitis (DP). The study was carried out in 25 rats, in which DP was caused by ligation and puncture of the caecum.
Group I consisted of 15 rats, who died during the experiment. Ten rats of group II survived the 3-day period of observation. CRP, TNF-alpha and sTNFR p55 and p75 concentrations were taken at 6-12-24-48 and 72 hour intervals.
C-reactive protein concentration increased in time, especially in the group I. TNF-alpha was detected mainly during the first 12 hours of experiment. Mean TNF-alpha concentration in the group I was 372.3 pg ml^-1 after first 12 hours, then decreased, reaching undetectable levels at the 4th and 5th time intervals. In group II, TNF concentrations were changing in a similar manner. Animals, who died, had higher serum TNF concentrations than survivors. sTNFR p55 and p75 concentrations were also higher. The occurrence of sTNFR p55 and p75 was also higher, compared to the TNF-alpha. Concentration of sTNFR p55 in the group I remained higher over 24 hours and rapidly decreased after 48 hours. Changes were more obvious in group II.
Similar to p55, sTNFR p75 concentrations increased during progress of the inflammation process. Concentration of sTNFR p75 was significantly higher in survivors.
Conclusions:
1. Serum concentrations of soluble TNF-alpha receptors type I p55 and type II can be regarded as early markers of clinical condition;
2. Correlation between soluble TNF p55 and p75 receptor concentra- tions was visible in the early stage of the inflammation process only;
3. Serum concentrations of soluble TNF-alpha receptors type I p55 and type II p75, especially of the p75 form, correlated inversely with an animal survival rate.

Celem pracy jest ocena dynamiki zmian i korelacji stężeń rozpuszczalnych receptorów TNF typu I – p55 i typu II – p75 oraz TNF-alfa we krwi zwierząt z rozlanym zapaleniem otrzewnej (RZO). Badania przeprowadzono na 25 szczurach, którym wywołano RZO poprzez przewiązanie i nakłucie kątnicy. Grupę I tworzyło 15 szczurów, które zginęły w czasie doświadczenia. Do grupy II zaliczono 10 szczurów, które przeżyły trzydniowy okres obserwacji. Po 6, 12, 24, 48 i 72 godzinach od zabiegu mikrometodą ELISA oznaczano stężenia TNF-alfa i sTNFR p55 i p75. Stężenie białka C-reaktywnego narastało w miarę trwania zakażenia zwłaszcza w grupie I.
TNF-alfa identyfikowano głównie w pierwszych 12 godzinach trwania doświadczenia. Średnie stężenie TNF-alfa w grupie I po pierwszych 12 godzinach wynosiło 372,3 pg ml ^-1, następnie ulegało gwałtownemu zmniejszeniu, a w badaniu czwartym i piątym zbliżało się do wartości nieoznaczalnych. W grupie II stężenie TNF-alfa zachowywało się podobnie jak w grupie I. Zwierzęta, które zginęły miały wyższe stężenia TNF od tych, które przeżyły. W miarę narastania stężenia TNF-alfa w osoczu zwierząt narastało stężenie zarówno s-TNFR p55 jak i sTNFR p75. Częstość występowania sTNFR p55 i p75 również była wyższa niż TNF-alfa. Stężenie sTNFR p55 narastało w grupie I w czasie 24 godzin, by po 48 godzinach ulec gwałtownemu obniżeniu. W grupie II dynamika zmian była bardziej wyraźna. Stężenia sTNFR p75 podobnie do jego formy p55 wzrastały w miarę trwania zakażenia. Zwierzęta, które przeżyły doświadczenie wykazywały istotnie wyższe stężenie sTNFR p75 niż te, które zginęły.
Wnioski: 1) stężenia rozpuszczalnych receptorów TNF typu I – p55 i typu II – p75 w surowicy u zwierząt z RZO są wczesnymi markerami oceny ich stanu zdrowia; 2) stężenia rozpuszczalnych receptorów TNF p55 i p75 wykazują wzajemną korelację jedynie we wczesnym okresie RZO; 3) stężenie rozpuszczalnych receptorów TNF a zwłaszcza formy p75 w istotny sposób są związane z przeżywalnością zwierząt.

Poszukiwanie zależności pomiędzy wielkością stężenia w osoczu TNF ((kachektyny), a zwłaszcza jego rozpuszczalnych receptorów oraz przebiegiem posocznicy jest wciąż aktualne [1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12].

Celem pracy jest ocena dynamiki zmian stężeń rozpuszczalnych receptorów TNF (sTNFR) typu I – p55 i typu II – p75 w odniesieniu do stężenia TNF-alfa we krwi zwierząt z doświadczalnym rozlanym zapaleniem otrzewnej (RZO)

RZO wywołano poprzez przewiązanie i nakłucie brzegu przeciwkrezkowego kątnicy u 25 dorosłych szczurów, samców, szczepu Wistar [7]. Wszystkie badania otrzymały aprobatę Komisji Etyki i Nadzoru Nad Badaniami na Ludziach i Zwierzętach AM w Łodzi (zezwolenie nr 182/98).

Zwierzęta podzielono na dwie grupy. Grupę I stanowiło 15 szczurów, które zginęły w czasie trzydniowej obserwacji. Do grupy II zaliczono 10 zwierząt, które przeżyły założony czas trwania doświadczenia. U zwierząt, które padły oraz u uśpionych po 72 godzinach, przeprowadzono badanie sekcyjne. Badanie to było weryfikacją istnienia ropnego zapalenia otrzewnej. Za miernik przebiegu RZO przyjęto przeżywalność zwierząt oraz zachowanie się stężenia białka C-reaktywnego (CRP) w ich osoczu. Krew do badań pobierano w ilości 15 ml ze splotu naczyniowego w worku łzowym po 6, 12, 24, 48 i 72 godzinach od operacji, bądź do śmierci zwierzęcia. Stężenia TNF-alfa i receptorów TNF p55 i p75 oznaczano mikrometodą ELISA [13].

Wyniki badań poddano analizie statystycznej określając wartość przeciętną, medianę, standardowe odchylenie, przedział ufności i znamienność różnic w kolejnych przedziałach czasowych oraz wzajemne korelacje stężeń badanych cytokin.

Czas przeżycia zwierząt przedstawiono w tabeli I. Stężenie CRP narastało w czasie trwania obserwacji. W badaniu po 6 godzinach w grupie I wynosiło 11,498 mg dl ^-1, by w następnym badaniu osiągnąć wartość 16,65 mg dl ^-1 i różnica ta była znamienna statystycznie. Natomiast w kolejnych przedziałach czasowych stężenie wzrastało odpowiednio do 17,65, 18,32, 19,32 mg dl ^-1, ale różnice te w stosunku do wartości poprzedniego badania były nieistotne (a> 0,5).

W grupie II stężenie CRP w badaniu po 6 godzinach wynosiło 12,567 mg dl ^-1, a w kolejnych oznaczeniach wzrosło odpowiednio do 13,76, 14,43, 16,54 i 17,01 mg dl ^-1. W grupie tej po intensywnym narastaniu stężenia CRP do 12 godziny obserwacji dalszy jego przyrost był nieznamienny.

Obecność TNF (wykryto w grupie I u 12 (80%) zwierząt w badaniu po 6 godzinach, w kolejnym badaniu u 11 (73%), po 24 godzinach u 4 (26,6%), a w drugiej dobie już tylko u dwóch szczurów. W grupie II TNF-alfa wykryto po 6 godzinach od wywołania RZO również u 80% zwierząt, po 12 godzinach u 60 %, natomiast po 24 godzinach już tylko u 2 szczurów. Ze względu na małą liczebność wyników w badaniach 3, 4 i 5 odstąpiono od ich analizy statystycznej. U pięciu zwierząt z RZO w żadnym badaniu nie zidentyfikowano TNF-alfa.

Średnie stężenia TNF-alfa przedstawia ryc. 1. Porównanie kolejnych stężeń TNF-alfa w grupie I, w badaniach po 6, 12 i 24 godzinach wykazało różnice znamienne statystycznie. Podobnie w grupie II różnice były znamienne. Różnice stężeń pomiędzy I a II grupą w odpowiednich przedziałach czasowych również były istotne (a<0,05).

Rozpuszczalny receptor p55 powyżej progu wykrywalności stwierdzono w grupie I w pierwszych dwóch badaniach u 80% zwierząt. Natomiast po 24 godzinach zidentyfikowano go u 66% zwierząt, a w drugiej dobie odsetek ten obniżył się do 40%. W grupie II początkowo częstość występowania sTNFR p55 była zbliżona do grupy I, natomiast w badaniach po 24, 48 i 72 godzinach utrzymywała się na wysokości 70%.

Stężenie sTNFR p55 stopniowo narastało w grupie I w czasie 24 godzin, by po 48 godzinach ulec gwałtownemu obniżeniu. W grupie II dynamika zmian była jeszcze wyraźniejsza. Różnice stężeń w grupie I były znamienne przy porównaniu wartości wyjściowej ze stężeniem dopiero po 24 godzinach (a<0,05), a w badaniach po 48 i 72 godzinach wysoce znamienne (a<0,01). Porównując stężenia sTNFR p55 pomiędzy grupami I i II stwierdzono, że w pierwszych 12 godzinach różnice były nieistotne, ale stały się znamienne po 24 i 48 godzinach.

Obecność sTNFR p75 w grupie I stwierdzono w badaniu nr 1 u 53% zwierząt. W kolejnych próbach odsetek ten wynosił odpowiednio 60, 66, 80 i 80%. Natomiast w grupie II we wszystkich badaniach odsetek wynosił 80 do 90%. Stężenia rozpuszczalnego receptora p75 zachowywały się odmiennie w stosunku do sTNFR p55. Różnice stężeń były znamienne dopiero po 24 godzinach. W grupie I stężenia sTNFR p75 narastały wolniej niż w grupie II. Porównując stężenia sTNFR p75 pomiędzy grupami I a II stwierdzono znamienność różnic w pierwszych dwóch badaniach i brak tej znamienności w kolejnych przedziałach czasowych.

Analiza zachowania się stężeń sTNFR p55 w odniesieniu do TNF-alfa w grupie I, w pierwszej dobie doświadczenia wykazała istnienie korelacji przy poziomie istotności a<0,05, współczynniku korelacji r= 0,6543 i wartości statystyki testowej t = 1,9643. W badaniu nr 2 korelacja była jeszcze bardziej wyraźna. Wykazywała ona zależność przy poziomie istotności a<0,01, współczynniku korelacji 0,4987 i wartości statystycznej t = 1,7530. Natomiast w badaniu nr 3 nie wykazano istnienia korelacji stężeń ocenianych cytokin (a> 0,5). Mała liczba wyników nie pozwoliła na określenie współczynnika korelacji w kolejnych dobach obserwacji. W grupie II korelacja istniała jedynie w badaniach nr 1 i nr 2.

Stężenie sTNFR p75 w odniesieniu do TNF-alfa nie wykazało korelacji w grupie I, natomiast w grupie II była ona widoczna w badaniach nr 1 i nr 2.

Stężenia sTNFR p55 i p75 wykazały wzajemną korelację w grupie I w pierwszych trzech badaniach; w badaniu nr 4 a> 0,5. W grupie II zależności te wyglądały podobnie.

Zachowanie się CRP dowodzi aktywności toczącego się procesu zapalnego. TNF-alfa jest cytokiną, która rzadko występuje powyżej progu wykrywalności u zdrowych osobników [5,7,13,14]. Natomiast krótki czas możliwej identyfikacji TNF-alfa w osoczu zwierząt z RZO w obu grupach dowodzi, że TNF-alfa nie jest czynnikiem determinującym los zwierzęcia. Z drugiej strony zauważono, że wśród zwierząt ginących w posocznicy stężenie TNF-alfa było istotnie wyższe niż u zwierząt, które przeżyły doświadczenie. Jednocześnie wykazano, że obniżenie stężenia TNF-alfa nie gwarantuje przeżycia zwierząt doświadczalnych. Tym nie mniej dominująca rola tej cytokiny w rozwoju zaburzeń reakcji ostrej fazy jest niepodważalna. Pomimo krótkotrwałej obecności TNF-alfa w osoczu posiada on własności uwalniania mediatorów reakcji zapalnej, a przede wszystkim skutecznej aktywacji kaskady cytokin z wydzielaniem ich rozpuszczalnych receptorów zarówno w formie p55 jak i p75. Toteż można przyjąć, że o losie zwierzęcia decyduje nie tyle bezwzględna wysokość stężenia TNF-alfa co jego oddziaływanie na inne cytokiny, a zwłaszcza zdolność wzbudzenia sekrecji naturalnych inhibitorów: sTNFR p55 i p75 [5,6,7].

Ocena aktywności cytotoksycznej TNF-alfa na podstawie określenia tylko jego stężenia może być błędna. Wykazano częstszą możliwość identyfikacji sTNFR w krwi zakażonych zwierząt niż samej kachektyny. Korelacja stężeń, która jest widoczna początkowo pomiędzy TNF-alfa a sTNFR p55 pozwala na uznanie sTNFR p55 jako wczesnego inhibitora TNF-alfa. Ponadto uważa się, że wysokie stężenie p55 we wczesnym okresie zakażenia, podobnie do TNF-alfa, wzmacnia zdolności obronne ustroju i mobilizuje naturalną odporność nieswoistą. sTNFR p55 w przeciwieństwie do kachektyny jest uznawany przez wielu badaczy za wysoce swoisty wskaźnik pomagający w ocenie stanu zdrowia i rokowania (1,5,6). Nie wszyscy jednak zgadzają się z tym poglądem. Być może obserwacja ta dotyczy bardziej ludzi niż warunków eksperymentu.

Wysokie stężenia p75 w grupie zwierząt, które przeżyły mogą świadczyć, że jest on silnym inaktywatorem TNF-alfa. U zwierząt, które ginęły stężenie rozpuszczalnych receptorów, a zwłaszcza sTNFR p75 było wyraźnie niższe niż u szczurów, które przeżyły. Dynamika przyrostu stężenia sTNFR p75 w grupie tej również była niższa. W tym miejscu doszukuje się roli i znaczenia obu rozpuszczalnych receptorów TNF w determinowaniu rozwoju zakażenia i rokowaniu [1,5,6].

Uważa się, że czynność biologiczna TNF-alfa warunkowana jest ekspresją receptorów powierzchniowych p55 i p75 na komórce efektorowej. Zatem na jego cytotoksyczność wpływa możliwość uwalniania pozakomórkowych domen tych receptorów. Wynika z tego, że związanie wolnego monomeru TNF-alfa przez sTNFR p55 czy sTNFR p75 utrudnia mu połączenie się z receptorem powierzchniowym. Wydzielanie obu postaci sTNFR redukuje więc prozapalny potencjał TNF-alfa, zmniejsza ekspresję powierzchniowego receptora dla TNF-alfa. Dowodzi to pozareceptorowej fazy regulowania cytotoksyczności kachektyny. Jednocześnie powstające kompleksy immunologiczne sTNFR / TNF p55 i p75 odgrywają swego rodzaju rolę biologicznego buforu TNF. Zjawiska te tłumaczą własności ochronne rozpuszczalnych receptorów TNF (przeciw szkodliwym reakcjom wywoływanym przez czynniki toksyczne w stosunku do własnych tkanek [5,10].

Przedstawiane badania potwierdzają regulującą rolę sTNFR we wzajemnym współdziałaniu sieci cytokin prozapalnych [5,6,7,9] Wysokie stężenie sTNFR p75 w grupie zwierząt, które przeżyły RZO dowodzi silniejszych własności inaktywujących cytotoksyczność TNF-alfa drogą blokowania jego ligandowych wiązań z receptorem powierzchniowym komórki efektorowej w porównaniu z postacią p55. Natomiast wysokie relacje stężeń TNF-alfa do obu form sTNFR, a zwłaszcza jego postaci p75 są dowodem zaburzeń równowagi pomiędzy ilością wiązań ligandowych cytokin a stężeniem inhibitorów i wskazują zazwyczaj na złe rokowanie w ZS i brak skutecznego leczenia. Hamujące działanie sTNFR p55 i p75 w stosunku do kachektyny można przyrównać pod względem efektu działania do czynności naturalnych przeciwciał monoklonalnych antyTNF. Z rozważań tych wynika, że ilościowy stosunek TNF-alfa do jego rozpuszczalnych receptorów ma szczególnie ważne znaczenie dla oceny rokowania.

Nasza wiedza o patogenezie posocznicy i zespołu septycznego nadal nie jest pełna, a badania nad jej dalszym poznaniem przyczyniają się do poszukiwania nowych strategii leczenia.

1. Stężenia rozpuszczalnych receptorów TNF typu I – p55 i typu II – p75 w surowicy u zwierząt z zapaleniem otrzewnej są wczesnymi wskaźnikami oceny ich stanu zdrowia.

2. Stężenia rozpuszczalnych receptorów TNF – p55 i p75 wykazują wzajemną korelację jedynie we wczesnym okresie RZO.

3. Stężenia rozpuszczalnych receptorów TNF a zwłaszcza formy p75 są w istotny sposób związane z przeżywalnością zwierząt.