Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Stomatologia 3/2008, s. 103-107
Ewa Jankowska-Antczak, *Andrzej Wojtowicz
Ocena poziomu wybranych metaloproteinaz i ich tkankowego inhibitora w ziarniniakach okołowierzchołkowych u pacjentów leczonych immunosupresyjnie
The expression of the level of metalloproteinases and their tissue inhibitor in immunosuppression treated patients
Zakład Chirurgii Stomatologicznej Instytutu Stomatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Andrzej Wojtowicz
Wstęp
Patologia tkanek okołowierzchołkowych jest jednym z częstszych problemów klinicznych, z którym spotyka się lekarz stomatolog. Ze względu na swe powszechne występowanie poświecono temu zagadnieniu wiele opracowań.
Powstała teoria tłumacząca powstawanie ziarniniaków okołowierzchołkowych z komórek nabłonkowych Malasseza, które to pozostają w okolicy korzenia zęba na skutek niepełnego zaniku narządu szkliwotwórczego. Funkcjonują one w formie nieaktywnej nawet przez wiele lat. Dopiero stymulowane czynnikiem zakaźnym lub urazem ulegają licznym podziałom i biorą aktywny udział w tworzeniu ziarniniaka okołowierzchołkowego i następnie zapalnej torbieli korzeniowej. Zmienna częstość występowania oraz dynamika tworzenia i narastania zmian o tym charakterze wskazuje jednak na rolę jeszcze innych czynników w etiopatogenezie ziarniniaków okołowierzchołkowych (1-3).
Obecnie znane i stosowane są zarówno zachowawcze jak i chirurgiczne procedury kliniczne mające na celu wyleczenie okołowierzchołkowego procesu zapalnego. Niestety pomimo starannego postępowania ze strony lekarza oraz zastosowania wskazań ze strony pacjenta, leczenie to nie zawsze kończy się powodzeniem. Ponadto szczególną trudność może sprawiać leczenie pacjentów z upośledzonym układem odpornościowym, np. na skutek przyjmowanych leków (4-7).
Czas regresji zmian leczonych metodą zachowawczą, jak również proces naprawczy obserwowany po zabiegach resekcji wierzchołka korzenia zęba z jednoczasowym wyłuszczeniem zmian okołowierzchołkowych są osobniczo zmienne, co sugeruje wpływ dodatkowych, nieopisanych dotychczas czynników regulacyjnych w tym procesie (3, 8). W ostatnich latach wiele miejsca w literaturze poświęca się grupie enzymów proteolitycznych, zwanych metaloproteinazami, zaangażowanych zarówno w proces przebudowy tkanek jak i ich degradacji.
Metaloproteinazy są rodziną genetycznie zróżnicowanych, ale strukturalnie podobnych proteaz, biorących udział w degradacji niemal wszystkich komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, extracellular matrix) i błony podstawnej. MMPs biorą udział zarówno w procesach fizjologicznych, związanych z rozwojem i przebudową tkanek, np. wyrzynaniem zębów, jak i procesach patologicznych, np. zapalenie przyzębia, reumatoidalne zapalenie stawów (9-15). Do ich zwiększonej ekspresji dochodzi w ścianach torbieli zębopochodnych i ziarninie okołowierzchołkowej (16-18). Oprócz metaloproteinaz w tkankach występują również ich naturalne inhibitory. Tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMPs) są zdolne do hamowania wszystkich aktywnych metaloproteinaz poprzez blokowanie aktywnej domeny MMP. Mogą również zapobiegać aktywacji latentnych form MMPs (9-11, 19, 20).
Cel pracy
Celem pracy była ocena poziomu ekspresji metaloproteinaz: MMP-1, MMP-2 i MMP-3 oraz tkankowego inhibitora metaloproteinaz TIMP-1 w ziarniniakach okołowierzchołkowych u pacjentów poddanych długotrwałej terapii immunosupresyjnej, po przeszczepieniu nerki w porównaniu z pacjentami bez chorób ogólnoustrojowych, nigdy nie leczonych lekami immunosupresyjnymi.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono wśród pacjentów leczonych w Zakładzie Chirurgii Stomatologicznej IS WUM. Do badania kwalifikowano osoby, u których potwierdzono badaniem radiologicznym obecność ognisk przewlekłego zapalenia tkanek okołowierzchołkowych o charakterze ziarniniaka. Pacjenci byli poddawani leczeniu chirurgicznemu w postaci ekstrakcji zęba przyczynowego lub resekcji wierzchołka korzenia zęba z wyłuszczeniem ziarniniaka w zależności od wskazań klinicznych. Materiał pobierano do badań histologicznych oraz immunohistochemicznych. Opieka około- i pozabiegowa prowadzona była według standardów klinicznych zgodnie z rozpoznaniem.
Ogółem badaniu poddano 27 osób, w tym 18 mężczyzn i 9 kobiet w wieku od 23 do 67 lat. Średnia wieku wynosiła 47,3 lat. Stworzono dwie grupy badanych pacjentów.
Grupa I to osoby bez chorób ogólnoustrojowych.
Grupa II to pacjenci leczeni przewlekle immunosupresyjnie, po przeszczepieniu nerki. Czas leczenia immunosupresyjnego wahał się od 6 do 55 miesięcy, średnio wynosząc 19,5 miesiąca. Pacjenci ci otrzymywali leczenie skojarzone: cyklosporyna, mykofenolan mofetylu (MMF), glikokortykosteroidy lub cyklosporyna, azatiopryna, glikokortykosteroidy.
Grupa I liczyła 18, zaś grupa II 9 pacjentów.
Wielkość zdiagnozowanych ziarniniaków mierzona ich średnicą wahała się od 2,8 do 4,9 mm. Pomiarów dokonano na zębowych zdjęciach radiologicznych wykonanych metodą kąta prostego. Pobrane po ekstrakcji zęba lub resekcji wierzchołka tkanki ziarniniaków okołowierzchołkowych utrwalono w 10% roztworze paraformaldehydu, a następnie zatopiono w bloczkach parafinowych. Na skrawkach seryjnych parafinowych o grubości 7 mm w celu uwidocznienia ekspresji metaloproteinaz (MMPs) i TIMP użyto króliczych przeciwciał poliklonalnych Chemicon Starter Kits: anty TIMP-1, MMP-1, anty MMP-2 oraz anty MMP-3. Preparaty immunohistochemiczne oceniono w mikroskopie NIKON – ECLIPSE E-400 i rejestrowano przy wykorzystaniu cyfrowego systemu NIKON – COOLPIX.
Badania immunohistochemiczne są badaniami jakościowymi, natomiast różnice w intensywności barwienia stanowią ogólną informację dotyczącą stężenia (ekspresji) badanych białek, a więc pośrednio mówią o ilości wyżej wymienionych czynników w tkance. Wszystkie barwienia zostały wykonane jednoczasowo z zachowaniem tych samych, precyzyjnych warunków reakcji, celem ograniczenia błędu metody.
Ekspresja poziomu metaloproteinaz jak i ich tkankowego inhibitora oceniana była w czterostopniowej skali:
0 – brak ekspresji,
1 – niski poziom ekspresji,
2 – średni poziom ekspresji,
3 – wysoki poziom ekspresji.
Wyniki badań zestawiono w tabelach i poddano ocenie statystycznej, stosując test Wilcoxona oraz test t-Studenta.
Wyniki
W badanym materiale stwierdzono ekspresję zarówno metaloproteinaz: MMP-1, MMP-2, MMP-3 jak i ich tkankowego inhibitora TIMP-1.
W obydwu grupach stwierdzono znaczące różnice w intensywności reakcji badanych metaloproteinaz i ich tkankowego inhibitora. Zwłaszcza poziom MMP-1 znacznie przewyższał oznaczaną ekspresję TIMP-1. Różnice w ekspresji tych enzymów korelowały z wielkością ziarniniaków. Większe rozmiary zmiany okołowierzchołkowej niosły ze sobą wzrost dysproporcji ekspresji MMP-1 nad TIMP-1. Poziom ekspresji badanych metaloproteinaz i TIMP-1 oraz rozmiary badanych ziarniniaków dla pacjentów z grupy bez immunosupresji zestawiono w tabeli 1 i analogicznie dla pacjentów z grupy z immunosupresją zestawiono w tabeli 2.
Tabela 1. Poziom ekspresji MMP-1,-2,-3 i TIMP-1 w ziarniniakach okołowierzchołkowych wg czterostopniowej skali 0-3 oraz średnia wielkość zmian (mm) mierzonych na zdjęciach rtg, u pacjentów ogólnie zdrowych.
MMP-1MMP-2MMP-3TIMP-1Rozmiar w mm
132224,9
233124,9
321113,5
432224,0
531214,5
621113,0
732333,2
822213,1
932233,2
1032213,5
1133214,5
1222224,0
1331224,1
1421112,8
1532224,8
1633114,7
1722113,5
1823333,5
Średnio2,611,941,781,503,87
SD0,50,70,60,60,7
Tabela 2. Poziom ekspresji MMP-1,-2,-3 i TIMP-1 w ziarniniakach okołowierzchołkowych wg czterostopniowej skali 0-3 oraz wielkość zmian (mm) mierzonych na zdjęciach rtg podany w milimetrach u pacjentów po przeszczepieniu narządu.
MMP-1MMP-2MMP-3TIMP-1Rozmiar w mm
112224,9
222314,3
312223,0
421113,0
512223,0
622314,5
722213,0
832223,2
932124,9
Średnio1,891,892,001,563,76
SD0,80,30,70,50,9
Analiza porównawcza aktywności metaloproteinaz i ich tkankowego inhibitora w grupie osób ogólnie zdrowych i leczonych immunosupresyjnie wykazała istotne statystycznie różnice. Występowały one w zakresie mniejszej ekspresji MMP-1 u pacjentów z blokowanym układem odpornościowym na skutek przyjmowanych leków w porównaniu z osobami bez tej dysfunkcji. Nie stwierdzono natomiast różnic w ekspresji TIMP-1 w obydwu badanych grupach. Porównanie ekspresji metaloproteinaz i ich tkankowego inhibitora u pacjentów leczonych immunosupresyjnie przedstawione zostało na ryc. 1. Różnica w poziomie ekspresji MMP-1 w obu grupach była istotna statystycznie. Rycina 2 i 3 przedstawia przykład obrazów mikroskopowych ekspresji MMP-1 i MMP-2 w tkankach ziarniniaków okołowierzchołkowych pacjenta z grupy bez immunosupresji i z immunosupresją.
Ryc. 1. Porównanie ekspresji MMP-1,-2,-3 i TIMP-1 u pacjentów ogólnie zdrowych i leczonych immunosupresyjnie wg czterostopniowej skali 0-3.
Ryc. 2. Ekspresja MMP-1 w tkance ziarniniaka okołowierzchołkowego u pacjenta z grupy z immunosupresją i grupy kontrolnej.
Ryc. 3. Ekspresja MMP-2 w tkance ziarniniaka okołowierzchołkowego u pacjenta z grupy z immunosupresją i grupy kontrolnej.
Dyskusja
MMP-1,-2,-3 są enzymami biorącymi udział w procesie degradacji włókien kolagenowych, m.in. tkanki kostnej, w określonej jak się zdaje sekwancji. Najpierw stromielizyna (MMP-3) usuwa proteoglikany i fragmenty fibronektyny z macierzy, „odczepiając” komórki osiadłe na macierzy kolagenowej i odsłaniając włókna kolagenowe na proteolityczne działanie kolagenazy (MMP-1). Odszczepione włókna kolagenu są dalej degradowane przez gelatynazę (MMP-2). W procesie tym biorą również udział inne enzymy z grupy metaloproteinaz, np. uwalniana przez neutrofile MMP-8, czy wydzielane przez komórki plazmatyczne MMP-9 i MMP-13 (9-11, 19). Jak wskazują badania autorów ziarniniaki okołowierzchołkowe o dużych rozmiarach charakteryzuje duże nasilenie intensywności reakcji immunohistochemicznej dla MMPs, zwłaszcza MMP-1 oraz wyraźnie niższe nasilenie reakcji dla TIMP-1. Natomiast w przypadku niewielkich ziarniniaków, młodych lub o mniej agresywnym wzroście stwierdza się niską intensywność reakcji immunohistochemicznej dla TIMP i średnią dla MMPs. Wielkość ziarniniaka okołowierzchołkowego i szybkość jego rozwoju może być związana ze znacznymi różnicami w ekspresji MMPs i TIMP (1).
Wyniki badań autorów potwierdzają ekspresję zarówno MMP-1,-2,-3 jak i TIMP-1 w ziarniniakach okołowierzchołkowych zarówno w grupie pacjentów ogólnie zdrowych jak i pacjentów po przeszczepieniu. Istotne statystycznie różnice w intensywności reakcji w grupie z immunosupresją i bez immunosupresji stwierdzono w przypadku MMP-1. Niższa ekspresja tej metaloproteinazy u pacjentów leczonych immunosupresyjnie, koreluje z mniejszymi rozmiarami zmian okołowierzchołkowych i może świadczyć o tłumionej odpowiedzi na czynnik zapalny u tej grupy pacjentów. Hipotezę tę ilustruje rycina 4. Leki immunosupresyjne stosowane po przeszczepieniu narządowym zmieniają obraz okołowierzchowego procesu zapalnego. Dochodzi do wyraźnego upośledzenia proliferacji komórek nacieku zapalnego i zmniejszenia wydzielania mediatorów reakcji zapalnej. Mikroskopowy obraz ziarniniaka okołowierzchołkowego u pacjentów leczonych immunosupresyjnie charakteryzuje się wyraźnym zwłóknieniem tkanek, mniejszą liczbą komórek nacieku zapalnego w polu widzenia i mniej uporządkowana strukturą. Mniejsza liczba komórek nacieku zapalnego, upośledzenie ich funkcji oraz mniejsza ekspresja mediatorów zapalenia u pacjentów leczonych immunosupresyjnie prowadzi do spadku aktywności metaloproteinaz.
Ryc. 4. Schemat ilustrujący poziom ekspresji MMP-1 i TIMP w ziarniniakach okołowierzchołkowych u pacjentów leczonych immunosupresyjnie i nieleczonych immunosupresyjnie.
Wnioski:
1. Rozwój ziarniniaków okołowierzchołkowych u pacjentów leczonych immunosupresyjnie jest znacznie ograniczony.
2. Leczenie immunosupresyjne hamuje proliferację komórek nacieku zapalnego i powoduje włóknienie zmiany okołowierzchołkowej.
3. Ograniczenie okołowierzchołkowej reakcji zapalnej u pacjentów z immunosupresją potwierdza również niższa ekspresja MMPs, zwłaszcza MMP-1.
4. Niedopełnienie kanału korzeniowego i niewielkie zmiany okołowierzchołkowe nie muszą być bezwzględnym wskazaniem do ekstrakcji zęba u pacjentów po przeszczepieniu i w niektórych przypadkach może być ona zastąpiona resekcją wierzchołka.
Piśmiennictwo
1. Jankowska-Antczak E., Wojtowicz A.: Aktualne poglądy na temat patogenezy zapalenia tkanek okołowierzchołkowych. Nowa Stomatologia, 2005; 32: 2: 94-97. 2. Torabinejad M., Linda L.: Mediators of acute and chronic periradicular lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 1994; 78: 511-21. 3. Walker K., Lappin D., Takahashi K., Hope J., Macdonald D., Kinane D.: Cytokine expression in periapical granulation tissue as assessed by immunohistochemistry., Eur. J. Oral Sci., 2000; 108: 195-201. 5. Mirowski G.W., Bettencourt J.D., Hood A.F.: Oral infections in the immunocompromised host. Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery, 1997; 16: 249-256. 6. Osharain HI., Telsey B., Mandel ID.: A longitudinal study of periodontal disease in patients with reduced immunocapacity. J Periodon, 1983, 54(3): 151-4. 7. Seymour RL., Thomason JM., Nolan A.: Oral lesions in organ transplant patients, J Oral Pathol Med, 1997; 26: 297-304. 8. Yamalik N., Delibasi L., Gulay H., Caglayan F., Haberal M., Caglayan G.: The histological investigation of gingiva from patients with chronic renal failure, renal transplant, and periodontitis: a light and electron microscopic study J Periodontol, 1991; 62: 737-74. 8. Waterman PA., Torabinejad M., McMillan PJ., Kettering JD.: "Development of periradicular lesions in immunosuppressed rats" Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1998; 85 (6): 720-5. 9. Been V., Engel D.: The effects of immunosuppressive drugs on periodontal inflammation in renal allograft patients J Periodon, 1982; 53: 245-8. 10. Birkedal-Hansen H., Moore W., Bodden M., Windsor LJ., Birkedal-Hansen B., DeCarlo A., Engler JA.: Matrix metalloproteinases: a review. Crit Rev Oral Biol Med, 1993; 4: 197-250. 11. Birkedal-Hansen H.: Role of matix metalloproteinases in human periodontal diseases. J Periodontol, 1993; 64: 474-484. 12. Golub L., Wolff M., Roberts S., Lee H-M., Leung M., Payonk G.: Treating periodontal diseases by blocking tissue-destructive enzymes. J Am Dent Assoc, 1994; 125: 163-169. 13. Golub L., Ramamurthy N., McNamara T., Greenwald R., Rifkin B.: Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown: new therapeutic implications for an old family of drugs. Crit Rev Oral Biol Med, 1991; 2: 297-322. 14. Shin S., Lee J., Beak S., Lim S.: Tissue levels of matrix metalloproteinases in pulps and periapical lesions. J Endod, 2002; 28: 313-315 Apr. 15. Wahlgren J., Maisi P., Sorsa T., Sutinen M., Tervahartiala T., Pirilä E., Teronen O., Hietanen J., Tjäderhane L., Salo T.: Expresion and induction of collagenases (MMP-8 and MMP-13) in plasma cells associated with bone-destrutive lesions. J Pathol, 2001; 194: 217-224. 16. Jankowska-Antczak E., Wojtowicz A.: Ekspresja metaloproteinaz (MMP-1,-2,-3) i ich tkankowego inhibitora (TIMP-1) w ziarniniakach okołowierzchołkowych Czasopismo Stomatologiczne, 2003; LVI, 6: 393-398. 17. Kozarzewska M., Wojtowicz A., Siemińska J.: Rola metaloproteinaz w etiopatogenezie zębopochodnych torbieli kości szczęk. Nowa Stomatologia, 2005; 32, 2: 81-88. 18. Lin SK., Chiang CP., Hong CY., Lin CP., Lan WH., Hsieh CC., Kuo MYP.: Immunolocalization of interstitial collagenase (MMP-1) and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) in radicular cysts. J Oral Pathol Med, 1997; 26: 458-463. 19. Reynolds J.J., Meikle M.C.: The functional balance of metalloproteinases and inhibitors in tissue degradation: relevance to oral pathologies J R Coll Surg Eding, 1997; Jun, 42: 3, 154-160. 20. Ryan M., Ramamurthy N., Golub L.: Matrix matalloproteinases and their inhibition in periodontal treatment. Curr Opin Periodontol, 1996; 3: 85-96.
otrzymano: 2008-08-15
zaakceptowano do druku: 2008-09-02

Adres do korespondencji:
*Andrzej Wojtowicz
Zakład Chirurgii Stomatologicznej IS WUM
ul. Nowogrodzka 59, 02-006 Warszawa
e-mail: awojt@kcs.amwaw.edu.pl

Nowa Stomatologia 3/2008
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia