Adiuwanty – substancje stymulujące odpowiedź immunologiczną – część I

Termin „adiuwant” pochodzi od łacińskiego słowa adjuvare – pomagać, i jest używany do określania każdej substancji, która może zwiększać humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną na antygen (1). Adiuwanty były używane do stymulowania odpowiedzi immunologicznej na antygen od ponad 60 lat, zarówno w badaniach doświadczalnych jak i w rutynowo stosowanych szczepionkach. Pionierem w tej dziedzinie badań był Ramon, który w latach 20-tych ubiegłego stulecia wykazał, że dodanie do szczepionek tężcowej i błoniczej substancji takich jak agar, tapioka, lecytyna, olej krochmalowy, saponiny czy nawet okruchy chleba, powoduje wzrost miana antytoksyn tężcowych i błoniczych (1). Mniej więcej w tym samym czasie Glenny i współ. odkryli działanie adiuwancyjne związków glinu i opisali zastosowanie ich w szczepionkach przeciw błonicy (1). Od tej pory sole glinu stały się powszechnie używanym adiuwantem w różnych szczepionkach.

Różne właściwości fizyko-chemiczne różnych adiuwantów mogą powodować wzrost efektywności szczepień na wiele sposobów:

– wywołują efekt dépôt polegający na zatrzymaniu antygenu w miejscu podania, hamując jego zbyt szybką eliminację z ustroju i stopniowo go uwalniając, dzięki czemu następuje zwiększenie i wydłużenie czasu jego interakcji z komórkami prezentującymi antygen (APC) i limfocytami, powodując miejscowy odczyn zapalny (2, 3),

– posiadają zdolność modulowania odpowiedzi immunologicznej, poprzez indukcję humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi (3),

– zwiększają skuteczność działania słabych immunogenów, takich jak antygeny syntetyczne wysoko oczyszczone lub rekombinowane (4),

– poprawiają efektywność szczepienia i redukują związane z nim koszty, pozwalając na zmniejszenie dawki antygenu lub częstotliwości uodparniania (2),

– działają immunostymulująco poprzez m.in. aktywację dopełniacza, wzmożenie syntezy cytokin (IL-1, IL-4, IL-6, IFN) czy selekcję odpowiedzi subpopulacji limfocytów T pomocniczych Th1 i/lub Th2 (3),

– zwiększają reaktywność komórek układu odpornościowego u niedojrzałych immunologicznie osobników, takich jak noworodki, u osób w podeszłym wieku lub o obniżonej odporności na skutek niektórych chorób lub radio- czy chemioterapii (2, 4),

– w szczepionkach złożonych pomagają przełamać współzawodnictwo pomiędzy antygenami (2, 5).

Stosowanie adiuwantów umożliwia uzyskiwanie szybszej, silniejszej i dłużej trwającej odpowiedzi na antygen. Jednakże, dotychczas poznane adiuwanty nie są obojętne dla organizmu człowieka. Mogą powodować ryzyko wystąpienia m.in.:

– miejscowego ostrego lub przewlekłego odczynu zapalnego, bolesnego ropnia, guzka lub owrzodzenia,

– chorób z objawami grypo-podobnymi,

– obrzęku naczyniowo-ruchowego, pokrzywki i zapalenia naczyń,

– autoimmunologicznego zapalenia stawów, skrobiawicy i zapalenia błony naczyniowej przedniej komory oka,

– krzyżowych reakcji z antygenami człowieka doprowadzającymi do zapalenia kłębkowego nerek lub zapalenia opon mózgowych,

– immunosupresji, uczulenia na tuberkulinę i inne antygeny podawane drogą transdermalną lub reakcji anafilaktycznych (4, 6).

Generalnie, wybór odpowiednich adiuwantów szczepionkowych odzwierciedla kompromis pomiędzy wymogami adiuwancyjności, a akceptowalnie niskim poziomem niepożądanych reakcji organizmu (1).

Najpopularniejszym z adiuwantów używanych obecnie u ludzi są związki glinu takie jak wodorotlenek glinu, siarczan glinu, fosforan glinu lub fosforan wapnia (7). W badaniach nad aktywnością immunostymulacyjną brano również pod uwagę sole takich metali jak azotan ceru, siarczan cynku, koloidalny wodorotlenek żelaza oraz chlorek wapnia, które zwiększały aktywność toksoidów błoniczych czy tężcowych, jednakże w porównaniu do soli glinu efekt ich działania był słabszy (1). Fosforan wapnia jako adiuwant był używany w szczepionkach skojarzonych: przeciw błonicy, tężcowi i krztuścowi (DTP) oraz w szczepionce przeciw DTP + polio, a także w szczepionkach monowalentnych przeciw błonicy, tężcowi, polio, BCG, żółtej febrze, różyczce, w szczepionkach przeciw wzw B i w preparatach alergenowych (1). Fosforan wapnia jest naturalnym składnikiem organizmu, w związku z tym jest dobrze tolerowany i łatwo resorbowany. Ponadto skutecznie wiąże się z antygenemi i powoli go uwalnia oraz wywołuje wytworzenie wysokiego poziomu przeciwciał klasy IgG (1). Badania kliniczne wykazały skuteczność i bezpieczeństwo szczepionek zawierających adiuwant wapniowy (1).

Glinowe adiuwanty działają głównie przez tworzenie efektu dépôt, który pozwala na powolne uwalnianie antygenu, w ten sposób przedłużając czas interakcji pomiędzy antygenem a komórkami prezentującymi antygen (APC) i limfocytami (1). Wstrzyknięcie glinu i niezaadsorbowanego antygenu do organizmu doprowadza do powstania ogniska zapalnego, które z kolei przyciąga komórki immunokompetentne. Związki glinu aktywują również dopełniacz, co prowadzi do miejscowej odpowiedzi zapalnej i rozwoju komórek pamięci linii B (1). Adiuwanty glinowe zwiększają głównie odpowiedź humoralną i są mniej efektywne we wzbudzaniu odpowiedzi typu komórkowego. Są one szczególnie skutecznym adiuwantem dla toksoidów (3). Toksoidy błonicze i tężcowe adsorbowane na adiuwantach glinowych są bardziej immunogenne niż podawane osobno. Zaadsorbowany toksoid tężcowy stymuluje odporność szybciej, na wyższym poziomie oraz bardziej trwale niż sam toksoid, nawet po podaniu antytoksyny tężcowej (1). Preparaty glinu są powszechnie używanymi adiuwantami w szczepionkach przeciwko błonicy, teżcowi i krztuścowi. Wodorotlenek glinu jest również stosowany w szczepionkach przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu A, kleszczowemu zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu, w szczepionkach przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B drugiej i trzeciej generacji oraz w szczepionce przeciw Haemophilus influenzae typu b skoniugowanej z białkami meningokokowymi (3). Przez wiele lat adiuwanty glinowe były używane z satysfakcjonującymi rezultatami w preparatach alergenowych do odczulania pacjentów z alergią (1). Pomimo że odnotowywano przypadki miejscowych reakcji niepożądanych po podaniu szczepionki lub ekstraktu alergenowego z adiuwantem glinowym, preparaty takie uważane są za stosunkowo bezpieczne i corocznie podaje się miliony dawek szczepionek je zawierających, większość z nich dzieciom i niemowlętom (1). Preparaty zawierające związki glinu nie mogą być liofilizowane, nie mogą także ulec przypadkowemu zamrożeniu, dlatego ich dystrybucja i sposób przechowywania wymagają przestrzegania i monitorowania ściśle określonych warunków (3).

Odrębną grupą adiuwantów stanowią emulsje olejowe. Są to mieszaniny oleju i wody z dodatkiem tenzydów, czyli substancji powierzchniowo czynnych stabilizujących obie fazy (2, 8). Pierwsze doniesienia na ten temat sięgają początków XX wieku, kiedy to Le Moignic i Pinoy odkryli, że zawiesina zabitych bakterii Salmonelli typhimurium w emulsji olejowej spowodowała wzrost odpowiedzi immunologicznej (1). Emulsje olejowe jako adiuwanty nie cieszyły się większą uwagą dopóki w 1930 roku Freund nie zademonstrował, że nieżywe prątki Mycobacterium tuberculosis zawieszone w emulsji wodno-olejowej silnie wzmagają odpowiedź immunologiczną (2). Adiuwant ten, czyli kompletny adiuwant Freuda (FCA) jest jednym z silniejszych adiuwantów dotąd opisanych i jest stosowany w badaniach eksperymentalnych. Natomiast wodno-olejowa emulsja bez mykobakterii, znana jako niekompletny adiuwant Freuda (FIA) jest znacznie bezpieczniejsza i używana w wielu szczepionkach weterynaryjnych m.in. przeciwko wściekliźnie, nosówce psiej, grypie rzekomej czy chorobie Newcastle (1). Przez pewien czas FIA był stosowany również do wzmożenia odpowiedzi immunologicznej w szczepionkach stosowanych u ludzi, np. przeciwko grypie i poliomyelitis (1), jednakże wywoływał on miejscowe reakcje niepożądane, takie jak ziarniniaki czy ropnie jałowe.

Klasyczne formuły adiuwantów bazujące na oleju mineralnym i emulgatorze (Arlacel A – monooleinian mannitolu), mimo iż same nie są stosowane ze względu na zbyt dużą toksyczność i wywoływanie skutków ubocznych w organizmie człowieka, stanowią wyznacznik do którego przyrównywane są nowe systemy adiuwancyjne (1, 2).

Adiuwancyjne działanie emulsji polega na usprawnieniu transportu antygenu do APC, a także jego aktywacji. Emulsje chronią również antygeny przed rozkładem enzymatycznym, a przez zmianę ładunku elektrycznego mogą zwiększać ich immunogenność (2). Jednakże rodzaj oleju nie jest bez znaczenia, gdyż to on decyduje o stopniu pobudzenia komórek immunokompetentnych (8). Oleje mineralne, np. olej parafinowy pozostają w miejscu iniekcji o wiele dłużej niż oleje metabolizowane w organizmie, jak skwalen czy olej arachidonowy, które jednak działają bardziej drażniąco na tkanki i przyczyniają się do powstania bardziej nasilonego odczynu zapalnego (2). Decydująca jest tutaj długość łańcucha węglowodorowego w resztach kwasów tłuszczowych. Im krótszy łańcuch, tym lepsze właściwości solubilizujące i większe działanie drażniące (2). W zależności od sposobu uwalniania antygenu można rozróżnić emulsje O/W („olej w wodzie”), W/O („woda w oleju”) oraz W/O/W („woda w oleju w wodzie”). W pierwszym przypadku fazą ciągłą jest woda a fazą zdyspergowaną olej, antygen jest natomiast zatrzymywany na dość krótko. Odwrotnie jest w emulsji W/O, a antygen jest tu zatrzymywany dłużej (2). W emulsjach wielokrotnych typu W/O/W antygen znajduje się w wewnętrznej oraz w zewnętrznej fazie wodnej, co pozwala na dwuetapowe uwalnianie antygenu. Pierwsza porcja jest dostępna natychmiast po podaniu, druga jest uwalniana później jako dawka przypominająca. Układ W/O/W jest bardzo niestabilny, stąd nieodzowne jest użycie odpowiedniego stabilizatora (2).

Adiuwantami należącymi również do grupy emulsji zasługującymi na uwagę są SAF i MF59. SAF jest to syntetyczny kompleks ( Syntex adjuvant formulation) w formie emulsji O/W opartej na biodegradowalnych olejach skwalenu i detergencie Tween 80 (polioksymonooleinian sorbitanu) (2, 4). W jego skład wchodzi również kopolimer tlenku etylenu (POE) i tlenku propylenu (POP) o nazwie Pluronic L121oraz bufor fosforanowy o pH 7.4 (3, 4). Allison i Byars opisali wersję SAF-1, która zawiera jeszcze syntetyczną pochodną MDP (treonylo-muramylodipeptyd) (1,4). SAF swoją aktywność immunostymulującą zawdzięcza przede wszystkim adiuwancyjnym właściwościom kopolimerów. Mają one bowiem zdolność do wiązania antygenów białkowych z zachowaniem natywnej formy epitopu (3). Wykazano, że na tę aktywność znacząco wpływa długość łańcuchów POP i POE, co jednocześnie powoduje wzrost poziomu przeciwciał (3). Ponadto, kopolimery powodują wzrost ekspresji antygenu przy udziale cząsteczek MHC klasy II na makrofagach, zwiększając przez to ich zdolność do prezentacji antygenu limfocytom T (3). Badania kliniczne szczepionek przeciwko takim infekcjom jak wirus małpiego zespołu nabytego niedoboru odporności (SAIDS), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus Epsteina-Barr (EBV) oraz wirus opryszczki zwykłej (HSV) zawierającymi SAF, przyniosły zachęcające rezultaty (4, 9).

MF59 – mikropłynna emulsja O/W jest oparta na skwalenie, a detergentami stabilizującymi cały układ są Tween 80oraz Span 85 (trioleinian sorbitanu) (3, 4). Formuła tego adiuwantu była badana u wielu gatunków zwierząt doświadczalnych indukując znaczący wzrost odpowiedzi immunologicznej na różne antygeny takie jak cytomegalowirus, wirus opryszczki, wirus nabytego niedoboru odporności (HIV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu B, a także antygeny wirusa grypy (4). Badania kliniczne kilku szczepionek zawierających adiuwant MF59 wykonane w różnych grupach wiekowych, zarówno u noworodków, jak i u osób w wieku starszym, wykazały wysoką immunogenność szczepionek i potwierdziły bezpieczeństwo tych preparatów (10). MF59 był pierwszym adiuwantem zarejestrowanym do stosowania u ludzi obok adiuwantów glinowych (10, 11). Badania, którym poddano ponad milion ludzi w Europie, potwierdziły silną adiuwancyjną skuteczność MF59, w wyniku czego nastąpiła rejestracja szczepionki przeciw grypie z MF59 (2, 4).

W trakcie badań eksperymentalnych jest również emulsyjny system adiuwancyjny – AS02. Zawierająca MPL i QS-21 emulsja O/W, powoduje wzrost poziomu przeciwciał i znacząco uwydatnia odpowiedź Th1 i komórkową odpowiedź z udziałem cytotoksycznych limfocytów T (4). W przeprowadzonych badaniach nad użyciem AS02 w opracowywanej szczepionce przeciw malarii wykazano, że nowa formuła adiuwancyjna jest zdolna wywołać wysokie miano przeciwciał jednocześnie indukując silną odpowiedź komórkową, prowadząc w konsekwencji do ogólnej poprawy skuteczności preparatu (12). Jego dużą efektywność zaobserwowano też w szczepionce przeciw gruźlicy u świnek morskich (4). Badania kliniczne były prowadzone również w przypadku szczepionki przeciw wirusowi papilloma (HPV – wirus brodawczaka ludzkiego) (4). AS02 stosowany był także w połączeniu z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) oraz z antygenem wirusa HIV (4).

Saponiny są dobrze znane jako immunologiczne stymulatory, lecz ich przydatność jako adiuwanty szczepionkowe jest ograniczona ze względu na toksyczność (13).

Częściowo oczyszczona saponina, zwana Quil A, ekstrahowana jest z kory kwilaji ( Quillaja saponaria Molina), drzewa rosnącego w Ameryce Południowej (2,4). Sponiny są roślinnymi glikozydami, zawierającymi steroidowe aglikony (4). Glikozydy te składają się z hydrofobowych trójterpentynowych policyklicznych pierścieni z dwoma łańcuchami hydrofilnymi, co umożliwia im tworzenie z białkami micelli (4). Dokładny mechanizm działania adiuwancyjnego Quil-u A nie został jeszcze poznany. Glikozydy umożliwiają najprawdopodobniej wniknięcie antygenu do cytosolu i jego prezentację przez cząsteczki MHC klasy I, indukując w ten sposób odpowiedź komórkową (2). Quil A jest szeroko stosowany w szczepionkach weterynaryjnych, np. w końskiej szczepionce przeciw grypie (6, 14).

Saponiny odkryte w korzeniach krzyżownicy wirginijskiej ( Polygala senega L.) wykazują podobną aktywność do Quil-u A (2). Wyizolowane od niej frakcje PS-1 i PS-2, podane razem z antygenem, stymulowały wytwarzanie swoistych przeciwciał u myszy i kur (15). Na modelu mysim zaobserwowano preferencyjny wzrost podklasy przeciwciał IgG2a, a profil wydzielania cytokin odpowiadał odpowiedzi Th1 (16). Saponiny te są mniej toksyczne w porównaniu do Quil-u A (2).

Po oczyszczeniu frakcji saponinowych otrzymano QS-21 (Stimulon^TM), który wykazuje w stosunku do nich większą aktywność przy obniżonej toksyczności (2, 3). Rozpuszczalny w wodzie QS-21 może być stosowany z wodorotlenkiem glinu lub w bardziej złożonych formułach adiuwancyjnych (ISCOPREP^TM) (3). Adjuwant ten zwiększa immunogenność proteinowych, glikoproteinowych i polisacharydowych antygenów u psów i naczelnych (4). QS-21 pobudza m.in. komórki cytotoksyczne CD8+, powoduje syntezę przeciwciał IgG2a oraz IgG1 (2). W trakcie badań klinicznych są różne szczepionki zawierające QS-21 m.in. szczepionka przeciwko wirusowi grypy, Herpes simplex, HIV-1, przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B czy malarii (3). QS-21 wykorzystywano również w wielu badaniach nad szczepionkami przeciw nowotworom typu czerniaka, nowotworom odbytu i innym (2, 4). Badania przeprowadzone na około 3000 ochotnikach nie wykazały znaczących efektów ubocznych (4). Prowadzone są również badania toksykologiczne, które mają określić przydatność QS-21 w szczepionkach przeznaczonych dla dzieci (3, 4).

Po raz pierwszy kompleks immunostymulujący ISCOMs jako nowy system nośnikowy antygenu opisano w 1984 roku przez Moreina i wsp. (17, 18). ISCOM jest strukturą przestrzenną o średnicy 30-40 nm, pustą w środku i ujemnie naładowaną (1, 2, 19). ISCOM składa się z Quil-u A, cholesterolu i fosfolipidu (fosfatydylocholina lub fosfatydyloetanolamina) (2). Dodanie białka antygenu do tych struktur poprzez reakcję hydrofobową, prowadzi do powstania kompleksu ISCOMs (18,19), którego optymalny układ występuje w stosunku molowym 1:1:1:1 (3). Kompleksy ISCOMs indukują syntezę i uwalnianie IL-1 przez APC, a w zależności od dawki antygenu, zwiększają też u nich liczbę cząsteczek MHC klasy II na powierzchni błony komórkowej (2). Antygeny są również prezentowane na cząsteczkach MHC klasy I (2). Potraktowanie komórek dendrytycznych (DC) immunostymulującymi kompleksami ISCOMs powoduje wytwarzanie przez nie IFN-γ (2). ISCOMs indukuje również silną lokalną aktywację nieswoistych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej, angażując różnorodne komórki m.in. makrofagi, DC oraz limfocyty, które z kolei powodują wydzielanie licznych mediatorów zapalnych, jak IL-1, IL-6, IL-12, INF-γ (20). Jednakże spośród nich tylko IL-12 wydaje się być w głównej mierze odpowiedzialna za aktywność adiuwancyjną kompleksu ISCOMs (20). Immunogenne właściwości ISCOMs wykazano dla różnych antygenów otoczkowych wirusów, m.in. grypy, HCV, odry czy wścieklizny, a także dla antygenów nie wirusowych np. pierwotniaka Plasmodium falciparum (2, 3). Kompleksy ISCOMs są obecnie powszechnie używane w szczepionkach weterynaryjnych (1). Od czasu odkrycia kompleksu ISCOM, wiele szczepionek zawierających ten adiuwant było testowanych na modelu zwierzęcym wykazując indukcję zarówno humoralnej, jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej (18). Pearse i Drane opisali adiuwant ISCOMATRIX, który jest zasadniczo taką samą strukturą jak ISCOM, ale bez towarzyszącego mu antygenu (18). Antygeny mogą być łączone z adiuwantem ISCOMATRIX co prowadzi do powstania struktur, które mogą zapewnić taką samą prezentację antygenu oraz właściwości immunomodulacyjne co ISCOM, ale z o wiele szerszym zastosowaniem, ze względu na nieograniczoną liczbę hydrofobowych białek błonowych (18). Różne szczepionki zawierające ISCOMATRIX były badane w doświadczeniach na zwierzętach, a ostatnio przeprowadzano również liczne badania kliniczne na ludziach, które wykazały że adiuwant ISCOMATRIX jest bezpieczny i indukuje zarówno humoralną, jak i komórkową odpowiedź immunologiczną (18). Zdolność adiuwantu ISCOMATRIX do indukcji tych mechanizmów jest możliwa dzięki prezentacji antygenu przez oba szlaki MHC klasy I i klasy II, a także dzięki właściwościom immunostymulacyjnym saponin (18). Dodatkowo, adiuwant ISCOMATRIX jest łatwy w produkcji i może być w szerokim zakresie łączony z różnymi antygenami (18).