Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 2-3/2005Array
Józef Jethon1, Mariusz Adam Szabela1, Małgorzata Migaj2, Bogdan Woźniewicz2
Zastosowanie własnych keratynocytów w leczeniu ran ziarninujących oraz ran po pobraniu przeszczepów skóry
The use of autologous keratinocytes in the treatment of granulationing wounds and donor sites after split-thickness skin grafts
1z Kliniki Chirurgii Plastycznej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Józef Jethon
2z Zakładu Patologii Instytutu Pomnika-Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Bogdan Woźniewicz
Streszczenie
Celem pracy jest opracowanie metody przyspieszenia naskórkowania ran po pobraniu przeszczepów skóry i pourazowych ran ziarninujących z zastosowaniem własnych keratynocytów pacjenta.
Do próby przyspieszenia zagojenia ran po pobraniu przeszczepów skóry i pourazowych ran ziarninujących zakwalifikowano 59 ran u 45 pacjentów Kliniki Chirurgii Plastycznej CMKP (18 kobiet w wieku 42-85 lat, 27 mężczyzn w wieku od 21 do 79 lat) po głębokim oparzeniu od 1% do 53% całkowitej powierzchni ciała bądź z ranami ziarninującymi innego pochodzenia niż pooparzeniowe i ranami po pobraniu przeszczepów skóry.
Rodzaj zabiegu operacyjnego wymagał pobrania dermatomem wolnego przeszczepu skóry pośredniej grubości (wielkości minimum 200 cm2, grubości 0,3-0,4 mm) i pacjenci wyrazili na proponowaną im próbę przyspieszenia gojenia rany po pobranym przeszczepie skóry bądź próbę przyspieszenia gojenia rany ziarninującej oddzielną zgodą na piśmie.
Z fragmentu naskórka po przetransportowaniu do laboratorium uzyskiwano komórki naskórka (gł. keratynocyty). Metodami immunohistochemicznymi oceniano uzyskane komórki i zawieszano w przygotowanym własnym osoczu. Ilość uzyskanych w ten sposób komórek (praktycznie gł. keratynocytów) wynosiła od 2,5×106 (początkowe wyniki) do 32×106 z próbki naskórka ok. 3 cm2 mikroskopowo. 30% tych komórek było z warstwy podstawnej (bądź przypodstawnej). 70% było komórek rogowaciejących. Żywotność komórek wynosiła zawsze powyżej 90%. Test cytokeratynowy dla 70-80% komórek był dodatni.
Postępy gojenia były określane oraz dokumentowane na drodze rejestracji fotograficznej. Zagojenie ran po pobraniu przeszczepów skóry i zastosowaniu nań zwiesiny własnych keratynocytów w ilości od 16 tys. do 50 tys. komórek naskórka/cm kwadratowy rany nastąpiło u sześciu pierwszych pacjentów bez uchwytnej różnicy w czasie w gojeniu pomiędzy miejscem, gdzie zastosowano zawiesinę własnych keratynocytów, a miejscem rany, gdzie takiej zawiesiny nie zastosowano.
Zagojenie ran po pobraniu przeszczepów skóry i zastosowaniu nań zawiesiny własnych keratynocytów u pozostałych 39 pacjentów w miejscach, gdzie zastosowano zawiesinę własnych keratynocytów w ilości od 67 tys. do 320 tys. / cm kwadratowy rany uzyskano w czasie od 2-4 dni szybciej od zagojenia takich ran, gdzie nie stosowano zawiesiny własnych keratynocytów. Liczba zastosowanych na ranę po pobraniu przeszczepu skóry pośredniej grubości własnych komórek naskórka determinuje przyspieszenie gojenia. Podobne przyspieszenie gojenia jak przy zastosowaniu zawiesiny keratynocytów uzyskano w grupie 19 pacjentów po zastosowaniu na rany po pobraniu przeszczepów skóry drobnych fragmentów własnego naskórka.
U 14 pacjentów z ranami ziarninującymi i poddanych działaniu na te rany ich własnych keratynocytów nie stwierdzono istotnej różnicy w czasie zagojenia ran ziarninujących po zastosowaniu nań zawiesiny własnych keratynocytów pacjentów, ani po zastosowaniu na rany ziarninujące drobnych fragmentów ich własnego naskórka.
Summary
Methods accelerating wound healing, published up to now and used in practice, are complicated and expensive. In the report, we present the use of autologous keratinocytes on standard wound in donor sites after split-thickness skin grafts and on granulationing wounds.
As a probe, a group of 45 patients of Dept. of Plastic Surgery Postgraduate Medical Centre with possibility of influencing wound healing, was qualified. For patients treatment split thicknes skin graft (0.3-0.4 mm) was needed, so patients qualified for suggested probe of acceleration wound healing had given a written consent. Before operation split-thickness skin graft (3-9 cm2) and 10 ml blood were taken from each qualified patient.
Autologous keratinocyte suspension was obtained by enzymatic digestion of taken skin graft, and washing by centrifugation. Finally cells were resuspended in 1 ml autologous blood serum. Before autotransplantation their density and vitality were defined and moreover cellular composition was investigated immunohostochemically. Densities of obtained epidermal cells suspensions were from 2.5 mln in the very beginning up to 32 mln. Vitality was always above 90%. Microscopic suspensions contained about 30% basal (and parabasal) cells, 70% squamous cells. Another elements were not found. About 70-80% of the cells were cytokeratin positive.
Next on wound square 100-200 cm2 (donor sites after skin split-thikness graft) the suspension of autologous keratinocytes was laid (45 patients).
Acceleration of wound healing when suspension of autologous keratinocytes with concetration above 67×103 per one square centimeter of wound was used reached 2-4 days (39 patients) in comparison with healing of wounds without use of suspension of autologous keratinocytes (donor sites after skin split-thickness graft) or wounds on which the suspension of lower keratinocytes concentration were applied (6 patients). Similar acceleration of wound healing in donor sites after split-thickness skin grafts was observed after use of small fragments of epidermis (19 patients). The acceleration was documented with a description and a photo.
The use of aotologous keratinocytes and small fragments of epidermis on granulationing wound (14 patients) did not have an effect in acceleration of healing.
Skóra pełni kluczową rolę w utrzymaniu stabilności wewnętrznego „milieu” organizmu i obronie ciała przed wrogim środowiskiem. Ten największy organ ludzkiego organizmu stanowi zewnętrzną powłokę ciała i składa się z dwóch warstw: 1) naskórka i 2) skóry właściwej. Skóra jako zewnętrzna powłoka ciała nie jest jednolitym uniformem pokrywającym ciało, lecz wysoce wyspecjalizowanym organem z licznymi odmianami w budowie i funkcjach zmieniającymi się w zależności od okolicy ciała. Jako pierwotny organ obrony i adaptacji skóra pozostaje także największym organem ciała wystawionym na działanie wszystkich składników środowiska zewnętrznego, których część, jak np. promieniowanie słoneczne, temperatura, wilgoć ulega sezonowej fluktacji. Zmienność parametrów anatomicznych skóry (np. liczba warstw komórek w warstwie ziarnistej skóry, rozmieszczenie przydatków skóry, odmienność struktury połączenia skórno-naskórkowego, zmiany w ukrwieniu) determinuje w pewnym zakresie zmienność funkcji skóry. Z kolei taki np. parametr jak grubość skóry waha się od 0,03 mm do 4 mm w zależności od okolicy ciała, wieku i płci oraz rasy.
Ze skórą związane są przydatki skóry tj. gruczoły łojowe i potowe, włosy i paznokcie.
Wygląd zewnętrzny skóry, jej unerwienie i zapach odgrywagrają ważną rolę w społeczno-seksualnej komunikacji.
Schorzenia bądź uszkodzenia skóry zaburzają normalną funkcję organizmu często prowadząc do defektów estetycznych.
Naskórek ( epidermis) jest nabłonkiem wielowarstwowym płaskim rogowaciejącym. Jego główną masę komórkową stanowią komórki nabłonkowe zwane keratynocytami ułożone w czterech wartswach: podstawnej, kolczystej, ziarnistej i zrogowaciałej (w tej warstwie keratynocyty to tzw. korneocyty) możliwych do zróżnicowania morfologicznego.
Komórki podstawne ustawione równolegle do błony podstawnej, do której przyłączone są hesmidesmosomami biorą udział w wytworzeniu połączenia skórno-naskórkowego. Z komórkami kolczystymi, zawierającymi tenofilamenty (ułożone wokół jądra komórkowego) związane są desmosomami.
W pokładach komórek ziarnistych pojawiają się nowe struktury: ziarna keratohialiny i keratynosomy. W górnych warstwach komórek kolczystych oraz w komórkach ziarnistych (keratynocyty warstwy ziarnistej) pojawiają się ciałka Odlanda.
Ze względu na potencjał wzrostu subpopulacje keratynocytów dzieli się na:
1) Holoklony – mają największy potencjał wzrostu.
2) Meroklony – potecjał wzrostu pośredni między holo- a paraklonami.
3) Paraklony – potencjał wzrostu najmniejszy (zaprogramowane do ostatecznego zróżnicowania w nie więcej niż 15 generacjach).
Proporcje tych trzech rodzajów keratynocytów są skorelowane z wiekiem (u noworodka holoklonów jest 28-32%, u osobników 65-letnich holoklonów jest ok. 3%).
W naskórku poza keratynocytami są jeszcze tzw. passenger cells, tj. komórki Merkla (receptory dotyku), komórki pochodzenia nerwowego – melanocyty (w prawidłowych warunkach proporcja keratynocytów do melanocytów wynosi 36:1) oraz komórki pochodzenia mezenchymatycznego – komórki Lengerhansa (stanowią 2-5% ogólnej ilości komórek naskórka). Naskórek jako tkanka stanowi barierę dla antygenów cząsteczkowych, wirusów, bakterii oraz innych komórek, a także dla rozmaitych związków chemicznych i czynników fizycznych stwarzając w ten sposób warunki miejscowej odporności.
Pełni także inne funkcje immunologiczne: keratynocyty i komórki Langerhansa mogą prezentować antygeny limfocytom T oraz wydzielać cytokiny (IL – 1, IL – 3, IL- 6, IL- 8, TNF-alfa, TGF-alfa, TGF-beta i in.) włączając inne komórki do odpowiedzi immunologicznej.
Ziarna melaniny pochłaniają promieniowanie UV zapobiegając uszkodzeniom DNA (mutacjom).
Naskórek stanowi także barierę dla wody (chroni przed jej utratą). W nim znajdują się termoreceptory, nocireceptory, a na pograniczu ze skórą właściwą mechanoreceptory.
Skóra właściwa ( cutis vera) jest zbudowana z tkanki łącznej właściwej zawierającej liczne naczynia krwionośne i limfatyczne, nerwy i gruczoły. Bogate unaczynienie skóry właściwej pozwala na odżywianie przez dyfuzję naskórka.
W skórze właściwej znajdują się takie komórki, jak makrofagi, mikrofagi, komórki plazmatyczne i tuczne, które biorą udział w obronie miejscowej.
Główną komponentą pozakomórkowej matrycy skóry właściwej jest kolagen (kolagen VIII, IV, VII) warunkujący jej wytrzymałość na rozciąganie, natomiast elastyna (mniejsza składowa) odpowiada za elastyczność skóry.
W skórze właściwej znajdują się też receptory czuciowe (ciałka Krausego, Ruffiniego, Meissnera, Vater-Paciniego, receptory mieszków włosowych).
Skóra jest ważnym narządem tremoregulacji, a także miejscem wydalania z organizmu z potem, wody oraz niektórych metabolitów np. mocznika. Skóra jest również miejscem syntezy witaminy D3-cholekalcyferolu.
Opublikowane dotąd w piśmiennictwie i stosowane w praktyce sposoby przyspieszenia gojenia ran związane z użyciem czynników wzrostu bądź hodowli komórek, takich jak keratynocyty są skomplikowane i drogie.
Celem pracy jest opracowanie metody przyspieszania naskórkowania ran po pobraniu przeszczepów skóry i pourazowych ran ziarninujących z zastosowaniem zawiesiny własnych keratynocytów pacjenta.
Materiał i metodyka
Do próby zakwalifikowano 59 ran 45 pacjentów Kliniki Chirurgii Plastycznej CMKP (18 kobiet w wieku od 42 do 85 lat, 27 mężczyzn w wieku od 21 do 79 lat) po głębokim oparzeniu od 1% do 53% całkowitej powierzchni ciała bądź z ranami ziarninującymi innego pochodzenia niż pooparzeniowe i ranami po pobraniu przeszczepów skóry. U wymienionych pacjentów w momencie pokrywania ran po pobraniu przeszczepów skóry bądź ran ziarninujących zawiesiną komórek własnych ich naskórka nie znajdowano uchwytnych zaburzeń mogących mieć wpływ na gojenie rany. Rodzaj zabiegu operacyjnego wymagał pobrania dermatomem wolnego przeszczepu skóry pośredniej grubości (wielkości minimum 200 cm2, grubości 0,3-0,4 mm) i pacjenci wyrazili na proponowaną im próbę przyspieszenia gojenia po pobranym przeszczepie skóry bądź próbę przyspieszenia gojenia rany ziarninującej oddzielną zgodę na piśmie.
Od każdego zakwalifikowanego pacjenta po uprzednim uzyskaniu oddzielnej zgody na piśmie na proponowaną próbę przyspieszenia gojenia rany po pobranym przeszczepie skóry bądź próbę przyspieszenia gojenia rany ziarninującej w znieczuleniu miejscowym 1% lignokainą z dodatkiem adrenaliny pobrany został sterylnie (rękawice chirurgiczne, narzędzia) tego samego dnia przed właściwym zabiegiem operacyjnym bardzo cienki przeszczep skóry – próbka naskórka. Od pierwszych w kolejności pobrań próbek naskórka 26 pacjentów (9 kobiet, 17 mężczyzn) pobrano próbkę naskórka wielkości ok. 3 cm2. Od 19 kolejnych pacjentów (8 kobiet, 11 mężczyzn) pobrano próbki naskórka wielkości po ok. 9 cm2 i ok. jedną trzecią takiej próbki drobiono nożyczkami na bardzo małe fragmenty naskórka – pozostałą część bardzo cienkiego przeszczepu skóry próbki naskórka poddano identycznej procedurze uzyskania keratynocytów jak w pierwszej grupie pacjentów. Poza tym wszystkim pacjentom przed właściwym zabiegiem operacyjnym pobrano 10 cm2 krwi z żyły obwodowej (odłokciowej) dla uzyskania osocza koniecznego w dalszej części badań do przygotowania zawiesiny keratynocytów.
Uzyskane (w warunkach komory z laminarnym przepływem powietrza) z pobranej sterylnie krwi po odwirowaniu osocze przechowywane było w warunkach sterylnych w temperaturze +4°C.
Pobrany fragment naskórka przechowywany był w sterylnym roztworze transportowym GIBCO w temperaturze +4°C do czasu dostarczenia do laboratorium.
Fragment naskórka po przetransportowaniu do laboratorium został w warunkach komory z laminarnym przepływem powietrza poddany przez 30 minut działaniu 3-5 ml Polodin R (Betadine) i następnie pięciokrotnie (po 10 ml) spłukany sterylnym roztworem PBS (wolnym od Mg2+ i Ca2+).
Wymieniony płatek skóry w warunkach komory z laminarnym przepływem powietrza został przeniesiony do sterylnego roztworu Dispase II (Boehringer Mannheim, numer katalogowy 165859) (2,5 mg/ml DMEM) bądź odpowiadającemu mu siłą enzymatyczną roztworu Dispase f-my Falcon (1,2 jm/ml) i pozostawiony w temperaturze + 37°C przez 15 minut.
W warunkach sterylnych (rękawice chirurgiczne, narzędzia) i komory laminarnego przepływu powietrza mechanicznie oddzielano pincetą naskórek od skóry właściwej, rozdrabniano mechanicznie naskórek końcówkami nożyczek i z kolei następowała trypsynizacja tak przygotowanego naskórka przez 4 minuty w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu i pipetowaniu roztworu w 4 ml roztworu 0,25% Trypsin/EDTA (Gibcobrl Nr kat. 45300-017).
Trypsynizacja była zahamowana podaniem 0,5 ml własnego osocza pacjenta.
Zawiesina komórek była poddana wirowaniu przez 5 minut z szybkością 1100 obrotów/minutę. Po odwirowaniu i zdekantowaniu (w warunkach komory z laminarnym przepływem powietrza) roztworu komórki naskórka (praktycznie gł. keratynocyty) były w określonym stężeniu zawieszone w zagęszczonym (odparowanym czterokrotnie) osoczu danego pacjenta i dodawano witaminę C, aby uzyskać jej stężenie 100 mg/ml (w warunkach in vitro obserwowano przy zastosowaniu w zawiesinie witaminy C w stężeniu 100 mg/ml wyraźnie większą przyczepialność keratynocytów do dna butelek hodowlanych).
Metodami immunohistochemicznymi oceniano uzyskane komórki.
Ilość uzyskanych w ten sposób komórek (praktycznie gł. keratynocytów) wynosiła od 2,5×106 (początkowe wyniki) do 32×106 z próbki naskórka ok. 3 cm2 – mikroskopowo 30% tych komórek było z warstwy podstawnej (bądź przypodstawnej), 70% było komórek rogowaciejących. Żywotność komórek (oceniana błękitem trypanu) wynosiła zawsze powyżej 90%. Test cytokeratynowy (cytokeratyna MNF 116) dla 70-80% tych komórek był dodatni.
Technika zastosowania zawiesiny keratynocytów i drobnych fragmentów naskórka
Przeszczep skóry pośredniej grubości (wielkości minimum 200 cm2, grubości 0,3-0,4 mm) był pobrany w warunkach sali operacyjnej z powierzchni uda i przeniesiony w zaplanowane miejsce.
Na ok.100 cm2 rany powstałej po pobraniu przeszczepu skóry została nakroplona ze strzykawki bądź pipety przygotowana zawiesina keratynocytów – pozostała część rany była bez zawiesiny keratynocytów.
Ranę u 5 pacjentów obserwowano poprzez opatrunek przezroczysty – w pozostałych przypadkach zastosowano na ranę opatrunek typu Kocha.
U 19 ostatnich pacjentów w kolejności pobrań próbek naskórka poza zawiesiną keratynocytów na część rany powstałej po pobraniu przeszczepu skóry (wynosiła ok. 100 cm2) stosowano jedynie drobne fragmenty naskórka.
U 14 pacjentów z tej grupy (6 kobiet, 8 mężczyzn) na istniejące u nich rany ziarninujące zastosowano oddzielnie drobne fragmenty naskórka i oddzielnie zawiesinę keratynocytów.
Postępy gojenia były określane opisowo oraz dokumentowane na drodze rejestracji fotograficznej.
Technika zastosowania opatrunku ze spongostanu połączonego z zawiesiną allogennych fibroblastów i allogennych keratynocytów pokrytego posiatkowanym przeszczepem skóry własnej
Po uprzednim uzyskaniu oddzielnej zgody u 2 pacjentów (niewchodzących w skład grupy opisywanych 45 pacjentów) zastosowano na rany ziarninujące (zakwalifikowano do tego postępowania po jednej ranie u każdego z 2 pacjentów – ranie wielkości ok. 100 cm2) opatrunek ze spongostanu połączonego z zawiesiną allogennych fibroblastów, na który z kolei nakroplono zawiesinę allogennych keratynocytów i następnie pokryto wymienioną kompozycję szeroko posiatkowanym przeszczepem skóry własnej tych pacjentów.
Zawiesinę allogennych keratynocytów uzyskiwano w sposób podany w części poświęconej technice uzyskiwania zawiesiny keratynocytów. Pacjenci – biorący byli badani na obecność zakażenia HCV, HBV, HIV i tylko negatywne wyniki testów (a takie były wszystkie wyniki testów) powodowały użycie zawiesiny.
Po uprzednim uzyskaniu oddzielnej zgody na 6 ran ziarninujących u 3 pacjentów (niewchodzących w skład grupy opisywanych 45 pacjentów) zastosowano opatrunek ze spongostanu z zawiesiną allogennych fibroblastów, który pokryto szeroko posiatkowanym przeszczepem skóry własnej tych pacjentów.
Zawiesinę allogennych fibroblastów uzyskiwano na drodze ich hodowli w butelkach hodowlanych, które następnie rozseparowywano i zawieszano w osoczu.

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Bilingham R.E., Reynolds J.: Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions. Brit J Plast Surg 1952, 5:25.
2. Brown R., Kinsty D. et al.: Strategies for cell engineering in tissue repair. Wound Rep Reg 1997, 5:212-221.
3. Grinnel F.: Fibronectin and wound healing. J Cell Biochem 1984, 26:107-116.
4. Haris P.A., di Francesco F. et al.: Use of hyalironic acid and cultured autologus keratinocytes and fibroblasts in extensive burns. Lancet 1999, 1:35-36.
5. Leibovich S., Ross R.:The role of the macrophage in wound repair. Am J Pathol 1975, 78:71-80.
6. O´Conor N.E., Mulliken J.B. Banks-Schlegel S. et al.: Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologus epidermal cells. Lancet 1981, 1:75-78.
7. Pruchniewski D., Kempińska B., Marczak B.: Leczenie miejscowe oparzeń przy pomocy hodowanych "in vitro" autologicznych komórek ludzkiego naskórka. Pol Przegl Chir 1988, 5:453-456.
8. Raghow R.: The role of extracellular matrix in post inflammatory wound healing and fibrosis. FASEB J 1994, 8:823-850.
9. Rheinwald J.G., Green H.: Serial cultivation of starins of human keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975, 6:331-335.
10. Rheinwald J.G., Green H.: Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes in defined clonal and serum-free culture. J Invest Dermatol 1975, 6:331-342.
11. Rheinwald J.G., Green H.: Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature 1977, 265:421-424.
12. Rennenkampf H.O., Kiessig V., Hansbrough J.F.: Current concepts in the development of cultured skin replacement. J Surg Res 1996, 62:288-295.
13. Simpson D., Ross R.: The neutrophilic leukocyte in wound repair. J Clin Invest 1972, 51:2009-2015.
14. Steenfas H.: Growth factors and wound healing. Scand J Plast Reconstr Hand Surg 1994, 28:95-102.
Postępy Nauk Medycznych 2-3/2005
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych