Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Nowa Stomatologia 1/2007, s. 31-35
*Agnieszka Mielczarek1, Mirosław Kwaśny2, Maksymilian Włodarski2
Wykorzystanie fluorescencji różnicowej w diagnostyce próchnicy – doniesienie wstępne
The application of the differential fluorescence method in caries diagnosis – preliminary study
1Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytut Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Elżbieta Jodkowska
2Zakład Technologii Optoelektronicznych Instytut Optoelektroniki WAT w Warszawie
Kierownik Zakładu: płk. dr inż. Mirosław Kwaśny
Metoda fluorescencji wzbudzanej laserami (LIF) od kilku lat znajduje zastosowanie w diagnostyce ogólno- medycznej. Wykorzystywana jest do wykrywania wczesnych faz nowotworów, miażdżycy, kamicy nerkowej i moczowej (1). „Optyczne biopsje”, jak nazywa się wspom- niane procedury diagnostyczne, w przeciwieństwie do badań histopatologicznych są nieinwazyjne, nie wymagają pobierania materiału, a analizowana ilość materiału jest nielimitowana. Promieniowanie indukujące i wzbudzone transmitowane są systemem światłowodowym, sygnały mierzone są w czasie rzeczywistym, a rejestrowane obszary można analizować wielokrotnie.
Detekcja metodą LIF polega na rejestracji fluorescencji obszaru tkanki pod wpływem padającego promieniowania. Promieniowanie wzbudzające indukuje odpowiednie barwniki fluoryzujące (fluorofory) zawarte w materiale biologicznym.
Fluorescencja wzbudzana laserami stosowana jest z wykorzystaniem endogennych fluoroforów (tzw. „autofluorescencja”) lub z wprowadzeniem egzogennych fluoroforów akumulujących się lepiej w tkankach nowotworowych niż zdrowych. Barwniki egzogenne spełniają jednocześnie rolę fotosensybilizatorów w leczeniu nowotworów metodą fotodynamiczną (2, 3). Fluorescencja indukowana w tkankach pochodzi od takich związków, jak m.in.: endogenne porfiryny, melanina, beta-karoten, dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD), białka zawarte w elastynie i kolagenie i pochodne pirydoksyny (4). Widma wzbudzenia i emisji wymienionych związków pokazano na rycinie 1.
Ryc. 1. Charakterystyka spektralna fluoroforów występujących w organizmie a) widma wzbudzenia b) widma emisji: 1 – kolagen, 2 – tryptofan, 3 – elastyna, 4 – pirydoksamino-5-fosforan, 5 – pirydoksyna, 6 – kwas 4-pirydoksylowy, 7 – NADH, 8 – protoporfiryna IX, 9 – FAD (wg. Bottiroli i wsp. 1995).
Końcowa forma widma indukowanej fluorescencji zależy od długości fali wzbudzenia, wzajemnych stosunków ilościowych pomiędzy fluoroforami, całkowitej ich ilości, poziomu pH badanego obszaru, formy redox oraz głębokości położenia obszaru fluoryzującego. Wymienione czynniki wskazują na dużą skalę trudności przy interpretacji widm spektralnych. Podstawowy problem to wybór odpowiedniej długości fali wzbudzenia i normalizacja natężenia emisji, której poziom zależy od natężenia promieniowania dochodzącego do tkanki i warunków geometrycznych pomiaru (prostopadłe ustawienie końcówki światłowodowej w stosunku do badanej tkanki).
Dotychczas jedynie dla kilku rodzajów tkanki łącznej, głównie płuc, udało się dobrać odpowiednią długość fali wzbudzenia fluorescencji (5, 6, 7). W lokalizacji wczesnych faz nowotworów płuc najlepszym rozwiązaniem było wykorzystanie lasera helowo-kadmowego (He-Cd), pracującego w zakresie długości fali 442 nm, do wzbudzenia bioflawonoidów (8, 9). Całkowita fluorescencja wzbudzana w tkankach zdrowych w warunkach in vivo, jest znacznie większa od fluorescencji tkanek nowotworowych, ponadto różne są stosunki intensywności w pasmach zielonym i czerwonym widma.
W pracach własnych autorzy badali wpływ długości fali promieniowania laserowego na zmiany w widmach fluorescencji szkliwa (10, 11). Poziom autofluorescencji szkliwa prawidłowego w porównaniu do zmienionego próchnicowo w warunkach in vitro jak i in vivo jest większy, przy wzbudzeniu laserami o długościach fali 442 nm i 532 nm. Przy wzbudzeniu promieniowaniem o długości fali 633 nm zależność ta jest identyczna dla zmian w warunkach in vitro, natomiast zmiany próchnicowe powstałe w warunkach in vivo generują pojawienie się dodatkowych struktur, dających wzrost poziomu autofluorescencji zmian próchnicowych w porównaniu ze szkliwem zdrowym. Zastosowanie źródła laserowego o długości fali około 400 nm umożliwia uzyskanie silnego poziomu sygnałów emisji szkliwa, dużego kontrastu między prawidłową i uszkodzoną powierzchnią szkliwa oraz jednoczesną wyraźną detekcję porfiryn.
Ryc. 2. Wykres zależności natężenia fluorescencji od długości fali wzbudzenia (1 – światło zielone, 2 – światło czerwone).
Ryc. 3. Przykładowe obrazy powierzchni badanych zębów zarejestrowane w świetle dziennym.
W prezentowanych badaniach, znając charakterystykę wzbudzeniowo-emisyjną szkliwa, podjęto próbę wykorzystania zmodyfikowanej metody LIF. Wzmocnienie kontrastu świecenia pomiędzy obszarem zdrowym i zmienionym próchnicowo uzyskano stosując metodę fluorescencji różnicowej.
Materiał i metody
Jako materiał do badań in vitro wykorzystano 40 ludzkich zębów usuniętych z różnych wskazań stomatologicznych, w tym również zęby zatrzymane. Zęby po ekstrakcji płukano pod bieżącą wodą, oczyszczano mechanicznie i przechowywano w roztworze wody destylowanej z dodatkiem kryształków tymolu. Oczyszczone i utrwalone zęby wykorzystywano do dalszych badań w postaci próbek szkliwa prawidłowego, odwapnionego w warunkach in vitro, oraz szkliwa z naturalnymi zmianami próchnicy wczesnej. Ocenie poddano styczne powierzchnie badanych zębów.
We wstępnej fazie badań do wizualizacji ocenianych obszarów zaadoptowano system LIFE firmy Xillix (ryc. 4). Układ ten przeznaczony jest do badań autofluorenscencji płuc. Obraz fluorescencji szkliwa obserwowanej po wzbudzeniu promieniowaniem lasera helowo-kadmowego, o mocy 15 mW na wyjściu obrazowodu, rejestrowany jest jednocześnie przez dwie kamery wyposażone – jedna w filtr zielony (520-530 nm) i druga w czerwony (630-640 nm).
Ryc. 4. Schemat zaadaptowanego dla potrzeb badań systemu fluorescencji różnicowej LIFE.
Własny układ obrazowania fluorescencji różnicowej wzbudzonej na powierzchni badanych tkanek przedstawiono na rycinie 5. Omawiany system wyposażony był w końcówkę endoskopową, co umożliwi w przyszłości prowadzenie badań w warunkach in vivo. Źródło wzbudzenia w tego typu układach stanowią zwykle lasery o różnej mocy (20-50 mW), w zależności od długości stosowanych fal, lub ksenonowa lampa o mocy 300 W wyposażona w układ filtrów. W prezentowanym układzie wykorzystano laser półprzewodnikowy generujący promieniowanie o długości fali 407 nm i mocy ciągłej 25 mW (powierzchniowa gęstość mocy około 10 mW/cm2). Promieniowanie ze źródła transmitowane było cieczowym światłowodem o średnicy 5 mm do zewnętrznego toru giętkiego endoskopu. Promieniowanie odbite od tkanki i promieniowanie fluorescencji dochodziło torem centralnym endoskopu do czarno-białej kamery typu SIT o czułości 1x10-6 lux, wyposażonej w system filtrów. Układ optyczny rejestrował równolegle obrazy w paśmie czerwonym i zielonym. Specjalnie opracowany dla potrzeb badań program graficzny umożliwiał analizę obu otrzymanych obrazów.
Ryc. 5. Schemat laboratoryjnego układu obrazowania fluorescencji wzbudzanej laserami: źródło laserowe ze światłowodem (1), kamera CCD (2), dzielnik wiązki promieniowania (3), powierzchnia zęba (4), moduł kontroli kamery (5) komputer PC z frame-graberem (6), koło filtrów (7).
Wyniki badań
Obrazy zarejestrowane przy użyciu systemu LIFE przedstawiono na rycinie 6. Zdjęcia 1-4 ukazują obrazy zmian próchnicowych o charakterze białej plamy. Zdjęcia 5-6 prezentują obrazy fragmentów szkliwa zdemineralizowanych w warunkach in vitro. Prezentowane wizualizacje powstawały przez podzielenie intensywności obrazów zarejestrowanych przez obie kamery. Przy obniżonym stosunku intensywności luminescencji pasma zielonego do czerwonego na obrazie końcowym obszary odwapnione widoczne są jako strefy zabarwione na kolor brązowo-czerwony.
Ryc. 6. Obrazy fluorescencyjne zębów z naturalnymi zmianami próchnicowymi (1-4) i zębów demineralizowanych w warunkach in vitro (5-6), zarejestrowane za pomocą systemu LIFE.
Rycina 7 przedstawia zdjęcia zębów z widocznymi plamami próchnicowymi, wykonane z użyciem własnego systemu fluorescencji różnicowej. W obrazie fluorescencyjnym widoczne są ciemne plamy zmian próchnicowych na jasnym tle zdrowego szkliwa. W świetle białym zmiany typu biała plama są słabo widoczne na jasnym podłożu ze względu na refleksy promieniowania odbijanego od powierzchni szkliwa. Zastosowanie technik fluorescencyjnych umożliwia zwiększenie kontrastu pomiędzy tkanką zdrową i zmienioną próchnicowo (8).
Ryc. 7. Obrazy ilustrujące zmiany próchnicowe o charakterze białej plamy zarejestrowane przy użyciu własnego systemu fluorescencji różnicowej.
Ryc. 8. Obraz szkliwa z widoczną plamą próchnicową diagnozowaną metodą indukowanej fluorescencji: (A), obraz powierzchni szkliwa w świetle dziennym (B).
Dyskusja
W prezentowanych badaniach po raz pierwszy zastosowano metodę DF do wizualizacji zmian próchnicowych. Jedyny dostępny na rynku system rejestrujący obrazy badanych powierzchni zębów – system QLF wykorzystuje tradycyjną metodę LIF. Układ ten nie jest jednak powszechnie stosowany w praktyce klinicznej. Dotychczasowe doniesienia opisują jego zastosowanie w naukowych badaniach eksperymentalnych. Wysoka cena urządzenia oraz konieczność stosowania specyficznego oprogramowania do ilościowej analizy obrazu znacznie ogranicza jego dostępność.
Przy wzbudzeniu fluorescencji długością fali około 400 nm, wygodnym wskaźnikiem zmian obserwowanych w strukturze szkliwa jest stosunek emisji pasm np. przy 520 i 630 nm. Zmniejszenie fluorescencji szkliwa odwapnionego w zakresie niebiesko-zielonym i jednoczesny wzrost natężenia w zakresie czerwieni stwarzają możliwość zastosowania fluorymetrii różnicowej przy obrazowaniu fluorescencji powierzchni szkliwa bez względu na geometrię pomiaru, zmiany natężenia światła wzbudzającego i inne czynniki. Obserwacje te potwierdzają obrazy fluorescencyjne zębów zarejestrowane za pomocą systemu LIFE. Widoczne w zakresie 600-650 nm, przy wzbudzeniu promieniowaniem niebieskim 400-450 nm, obniżenie natężenia fluorescencji szkliwa demineralizowanego w warunkach in vitro rejestrowane jest w postaci brązowo-czerwonych plam.
W pracy przedstawiono przykładowe obrazy zmian próchnicowych o charakterze białej plamy zarejestrowane przy użyciu własnego systemu fluorescencji różnicowej. Po wzbudzeniu szkliwa promieniowaniem o długości fali około 400 nm maksimum widma emisji położone jest w okolicy długości fali 500 nm. Dla szkliwa zmienionego w warunkach in vivo widoczne jest obniżenie maksymalnego poziomu fluorescencji, przesunięcie maksimum w stronę czerwieni i pojawienie się dodatkowych pasm emisyjnych przy 630 i 670 nm typowych dla porfiryn. W badanym materiale podobną charakterystykę uzyskano dla około 70% przypadków, w pozostałych nie dało się wykryć porfiryn. Obserwowano jedynie typowy spadek poziomu luminescencji.
Możliwość ilościowej oceny stopnia odwapnienia daje cyfrowa obróbka obrazu, m.in. detekcja krawędzi zmian, pomiary planimetryczne, ilościowy kontrast między poszczególnymi pikselami. Po wydzieleniu konturu zmian, pola o najmniejszej fluorescencji przecinane są prostymi i przyporządkowuje się im rozkład intensywności emisji pikselem objętym linią przecięcia. Minimum natężenia emisji fluorescencji odpowiada maksymalnemu stopniu odwapnienia.
Przedstawiona metoda DF daje w warunkach klinicznych duże możliwości oceny stopnia zaawansowania próchnicy i wykazuje istotną przewagę w stosunku do tradycyjnej metody odbiciowej. W obrazach fluorescencyjnych znikają refleksy światła utrudniające prawidłową ocenę a miejsca dotknięte próchnicą widoczne są jako ciemne plamy na jasnym tle. Wyniki ilościowe stopnia zdemineralizowania tkanki zęba dostarczają lekarzowi danych o stopniu zaawansowania procesu próchnicowego i pomagają w podjęciu decyzji terapeutycznej. Metoda fluorescencyjna ze względu na wysoką wydajność kwantową luminescencji szkliwa nie wymaga super czułych kamer i źródeł światła o wysokich mocach. Typowe mikrokamery kolorowe i miniaturowe źródła światła laserowego o mocy około 15-25 mW rozwiązują problem techniczny pomiarów. Obok diagnostyki próchnicy metoda oferuje możliwość monitorowania procesu remineralizacji oraz dokładną kontrolę płytki bakteryjnej.
Prezentowane obrazy potwierdzają możliwość wykorzystania metody DF do rejestracji wczesnych zmian próchnicowych, ale co równie ważne umożliwiają monitorowanie tempa ich rozwoju, przy zachowaniu warunków powtarzalności pomiarów. Wstępne wyniki omawianych badań oraz wcześniejsze spostrzeżenia z badań własnych (59) sugerują, że fluorescencja różnicowa może znaleźć zastosowanie w diagnostyce próchnicy. Kolejnym etapem planowanych badań jest ilościowa analiza obrazów zarejestrowanych z użyciem DF i porównanie skuteczności diagnostycznej systemu DF i systemu QLF.
Piśmiennictwo
1. Andersson-Engels S. et al.: ,Fluorescence imaging and point measurements of tissue: aplications to the demarcation of malignant tumors and atherosclerotic lesion from normal tissue. Photochem. Photobiol., 1991, 53: 807-814. 2. Graczyk A.: Fotodynamiczna metoda rozpoznawania i leczenia nowotworów, Bellona, Warszawa, 1999. 3. Henderson B.W., Dougherty T.Y.: How does Photodynamic Therapy work? Photoche. Photobiol., 1992, 55: 145-157. 4. Bottiroli G. et al.: Natural fluorescence of normal and neoplastic human colon. A comprehensive "Ex vivo" study, Lasers Surg. Med., 1995, 16: 48-60. 5. Alfano R.R. et al.: Fluorescence spectra from cancerous and normal human breast and lung tissues. IEEE J. Quant. Electron., 1987, 10: 1806-1811. 6. .Andersson P.S. et al.: Autofluorescence of various rodent tissues and human skin tumors samples. Lasers Med. Sci, 1987, 2: 41-49. 7. Konig K. et al.: Laser induced autofluorescence of squamous cell carcinoma. Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers, Excerpta Medica, 1992: pp 903-906. 8. Hung J. et al.: Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue. Lasers Surg. Med., 1991, 11: 99-10522. 9. Lam S. et al.: Detection of lung cancer by ratio fluorymetry with and without Photofrin. Proc. SPIE, 1990, 1201: 561-568. 10. Mielczarek A. i wsp.: Fotoluminescencja w nowoczesnej diagnostyce wczesnych zmian próchnicowych. Stomatologia Współczesna, 1998, 5(3): 179-183. 11. Mielczarek A. et al.: Diagnozowanie zmian próchnicowych z wykorzystaniem techniki laserowej. Badania porównawcze in vitro. Stomatologia Współczesna, 2000, 2: 13-17. 12. Mielczarek A. et al.: Differential fluorescence as a method used in caries diagnosis. (Abstract) J Dent Res, 2001, 80: 563.
otrzymano: 2007-02-19
zaakceptowano do druku: 2007-03-12

Adres do korespondencji:
*Agnieszka Mielczarek
Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii AM w Warszawie
ul. Miodowa 18, 00-246 Warszawa
tel./fax 022 502-20-32

Nowa Stomatologia 1/2007
Strona internetowa czasopisma Nowa Stomatologia