Zastanawiasz się, jak wydać pracę doktorską, habilitacyjną lub monografie? Chcesz dokonać zmian w stylistyce i interpunkcji tekstu naukowego? Nic prostszego! Zaufaj Wydawnictwu Borgis - wydawcy renomowanych książek i czasopism medycznych. Zapewniamy przede wszystkim profesjonalne wsparcie w przygotowaniu pracy, opracowanie dokumentacji oraz druk pracy doktorskiej, magisterskiej, habilitacyjnej. Dzięki nam nie będziesz musiał zajmować się projektowaniem okładki oraz typografią książki.

© Borgis - Nowa Pediatria 2/2004, s. 46-50
Agnieszka Szypowska, Ewa Pańkowska
Ocena wybranych parametrów układu immunologicznego u dzieci i młodzieży ze źle wyrównaną cukrzycą typu 1
Selected parameters of immunological system in children and adolescents with poorly controlled type-1 diabetes and fungal infections
II Katedra Pediatrii, Klinika Diabetologii Dziecięcej i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Lech Korniszewski
Streszczenie
We assessed selected parameters of immunological system in group of children and adolescents with poorly controlled diabetes and fungal infections. The only abnormality we found was statistically significant low CD4 + in group of patients with fungal infection.
WSTĘP
Cukrzyca typu 1 jest ciężkim zaburzeniem metabolicznym, wywołanym niedoborem insuliny. Do rozwoju choroby dochodzi na skutek wybiórczego niszczenia w procesie autoimmunologicznym komórek beta w wysepkach Langerhansa w trzustce.
Celem leczenia cukrzycy jest prawidłowe wyrównanie metaboliczne pacjentów. Niedostateczne wyrównanie nie tylko sprzyja rozwijaniu się późnych powikłań, ale zwiększa także skłonność do rozwoju zakażeń bakteryjnych i grzybiczych. Szereg czynników wpływa na wzrost częstości zakażeń w tej grupie pacjentów. Opisuje się upośledzenie czynności granulocytów obojętnochłonnych takich jak: fagocytoza, zdolność do wewnątrzkomórkowego zabijania drobnoustrojów, adhezja, czy chemotaksja (1, 2, 3, 4).
Jednym ze skutków hiperglikemii jest glikacja białek, wysoki poziom glikowanej immunoglobuliny IgM może wpływać negatywnie na odpowiedź immunologiczną w początkowej fazie ostrej infekcji (5).
U chorych z przewlekle źle wyrównaną cukrzycą powstają ponadto zmiany w układzie naczyniowym i nerwowym (microangiopathia i neutropathia diabetica), które przyczyniają się do zaburzeń ukrwienia i do powstania zmian troficznych w tkankach, szególnie w obrębie kończyn dolnych. W momencie przerwania ciągłości podstawowej bariery obronnej człowieka, jaką jest skóra, łatwo dochodzi do wnikania drobnoustrojów i rozwoju infekcji (3, 6).
Częstym problemem chorych na cukrzycę są nawracające zakażenia grzybicze. Wysokie stężenie cukru w wydzielinach ustrojowych sprzyja namnażaniu się grzybów. Zazwyczaj obserwujemy grzybice powierzchowne ograniczone do zewnętrznych warstw skóry, paznokci i błon śluzowych, o łagodnym przebiegu. Najczęściej wywołują te zmiany grzyby z gatunku Candida, które występują jako saprofity na błonach śluzowych i skórze człowieka (4, 7).
U chorych na cukrzycę zakażenia wpływają niekorzystnie na wyrównanie metaboliczne pacjentów. W trakcie infekcji wzrasta zapotrzebowanie na insulinę i trudniej jest uzyskać normoglikemię (3, 4, 6).
Obserwując dzieci i młodzież ze złym wyrównaniem metabolicznym, zaobserwowaliśmy u części z nich masywny wzrost grzybów z wymazów pobranych z zewnętrznych narządów płciowych i/lub odbytu. Zastanawiające było, dlaczego u pozostałych badanych, mimo podobnie złego wyrównania metabolicznego, nie stwierdziliśmy obecności, bądź występowały tylko nieliczne komórki grzybów. Wywiad nie wskazywał na różnice w przestrzeganiu higieny osobistej w obydwu grupach. Podejrzewając, że chorzy ze źle wyrównaną cukrzycą i masywnym wzrostem grzybów mogą mieć zaburzenia odporności, sprzyjające rozwojowi flory patogennej, oceniono u pacjentów wybrane parametry odpowiedzi immunologicznej.
MATERIAŁ I METODY
Badaniem objęto 29 dzieci i młodzieży chorujących na cukrzycę typu 1, znajdujących się pod opieką Kliniki Diabetologii Dziecięcej i Wad Wrodzonych II Katedry Pediatrii Akademii Medycznej w Warszawie. Kryterium doboru grupy było złe wyrównanie metaboliczne cukrzycy, które oceniano na podstawie wartości HbA1c, do badania zakwalifikowano osoby z HbA1c powyżej 10%. Pacjentów podzielono na dwie grupy.
Grupa A: pacjenci z masywnym wzrostem grzybów z wymazów pobranych z zewnętrznych narządów płciowych i/lub odbytu, u których średnią liczbę kolonii grzybów uzyskaną z dwóch płytek posiewowych oceniono jako: dość liczne, liczne, lub zlewne: 14 osób w wieku 12-19 lat (śr. 16,5±2,34), chorujący na cukrzycę od 2-17 lat (śr. 7,7±08), HbA1c 10,2%-15,6% (śr. 12,1±1,48).
Grupa B: pacjenci, u których nie stwierdzono obecności grzybów, lub średnią liczbę kolonii grzybów oceniono jako: pojedyncze lub nieliczne: 15 osób w wieku 12-18 lat (śr. 15,0±1,77), chorujący na cukrzycę od 3 do 11 lat (śr. 6,7±2,69), HbA1c 10,0%-17,6% (śr. 11,4±1,96).
Żaden z badanych pacjentów nie miał w czasie badania objawów infekcji wirusowej, ani bakteryjnej oraz nie przyjmował antybiotyków, ani preparatów grzybobójczych w okresie poprzedzającym 6 tygodni badanie. Wszyscy badani, bądź ich rodzice, zostali poinformowani o sposobie i celu badań oraz wyrazili pisemną zgodę na ich wykonanie. Protokół badań został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Akademii Medycznej w Warszawie.
Badania mikologiczne
U wszystkich pacjentów pobrano wymazy z odbytu, sromu, lub spod napletka i oceniano obecność grzybów w preparacie bezpośrednim oraz w hodowli na podłożu Sabourauda. Wyrastające hodowle grzybów drożdżoidalnych identyfikowano używając agaru selektywnego CHROMagar Candida firmy BBL Becton Dickinson oraz testów API 20C AUX i ID 32C firmy BioMerieux. Inne grzyby identyfikowano w oparciu o cechy morfologiczne. Występowanie grzybów określano poprzez ocenę średniej liczby kolonii uzyskanej z dwóch płytek posiewowych.
Wyrównanie metaboliczne
Hemoglobina glikowana frakcja A1c oznaczana była metodą HPLC (zakres normy wynosi od 4% do 6%). W badaniu tym oceniano wartość HbA1c z ostatnich 6 miesięcy.
Badania immunologiczne
Test proliferacji
Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej izolowano przy użyciu Gradisolu L firmy Polfa Kutno i zawieszano w środowisku hodowlanym Parkera z Wytwórni Surowic i Szczepionek w Lublinie, suplementowane 10% inaktywowaną surowicą cielęcą firmy Sigma. Hodowle stymulowano PHA firmy Sigma dodając szczep Cowan Staphylococcus aureus firmy SAC, Pansorbin, Calbiochem. Wykonywano stymulację limfocytów T przy użyciu przeciwciała monoklonalnego OKT-3. Oceniano stopień proliferacji komórek na podstawie pomiaru aktywności wbudowywanej przez te komórki, znakowanej trytem tymidyny. Po zakończeniu inkubacji komórki zbierano za pomocą harvestera firmy Skatron i odczytywano aktywność wbudowanej tymidyny na liczniku scyntylacyjnym 1450 Microbeta firmy Wallac.
Test fagocytarny
Izolowane przy pomocy Gradisolu G firmy Polfa Kutno granulocyty krwi obwodowej zawieszano w środowisku hodowlanym PBS z Wytwórni Surowic i Szczepionek w Lublinie suplementowanym 0,1% albuminą bydlęcą firmy Sigma i glukozą. Do granulocytów dodawano cytochrom c oraz Phorbol 12-Myristate 13- Acetate firmy Sigma. Odczytywano pomiar ekstynkcji zredukowanego cytochromu c przez granulocyty przy długości fali 550 nm czytnikiem ELISA firmy Spectra.
Plaque Forming Test
Erytrocyty barana (SRBC) inkubowano z liofilizowanym białkiem A firmy Sigma (SpA) uzyskujac zawiesinę SRBC SpA. Do zawiesiny dodawano surowicę świnki morskiej firmy Biomed zawierającą komplement. Otrzymany roztwór inkubowano uzyskując aktywny komplement. Komórki krwi obwodowej izolowano przy pomocy Gradisolu L, następnie hodowano je po dodaniu Lecitin Form Phytolacca Americana firmy Sigma. Do komórek po hodowli dodawano zawiesiną SRBC SpA, królicze przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom firmy Dako, do roztworu dodano komplement absorbowany SRBC. Liczono obszary powstałej hemolizy i przeliczono na 105 komórek krwi obwodowej.
Analiza komórek Natural Killer (NK) oraz ocena ich aktywności
Komórki obwodowe izolowano z pełnej krwi obwodowej przy użyciu Gradisolu L. Do wyizolowanych komórek dodawano przeciwciała CD 16 FITS firmy Becton Dickinson. Analizę komórek przeprowadzano w cytometrze przepływowym FACS Calibur firmy Becton Dickinson. W celu oceny aktywności komórek NK do hodowli komórek krwi obwodowej dodawano hodowlę komórek K 562. Po inkubacji analizowano dane przy pomocy cytometru przepływowego. Wynikiem był stosunek komórek martwych do wszystkich komórek.
Ocena subpopulacji komórek w populacji limfocytów
Do znakowania poszczególnych subpopulacji użyto przeciwciał monoklonalnych stosując technikę dwukolorowej lub jednokolorowej immunofluorescencji. Wyizolowane komórki krwi obwodowej inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi CD3-PE, CD4-FITC/CD8-PE. Analizę przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego.
Analiza statystyczna
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Do porównywania średnich wartości stosowano test t-Studenta. Za różnice istotne statystycznie przyjęto te, przy których poziom istotności (p) był mniejszy od 0,05.
WYNIKI
W badaniach mikologicznych u pacjentów z grupy A stwierdzono masywny wzrost grzybów w hodowlach z wymazów z odbytu i/lub zewnętrznych narządów płciowych. W tej grupie średnią liczbę kolonii uzyskaną z dwóch płytek posiewowych oceniono jako: dość liczne, liczne lub zlewne. U osób z grupy B, pomimo podobnie złego wyrównania metabolicznego w hodowlach mikologicznych z wymazów z odbytu i/lub zewnętrznych narządów płciowych, nie stwierdzono obecności grzybów, bądź występowały, pojedyncze, lub nieliczne komórki grzybów.
Ze względu na trudności techniczne wynikające z konieczności jednoczesnego wykonywania kilku badań immunologicznych w różnych pracowniach, u pojedynczych osób nie udało się uzyskać wyników wszystkich badań.
W przeprowadzonych badaniach immunologicznych stwierdzono w grupie A obniżenie liczby limfocytów CD4 w porównaniu z grupą B (tab. 1). Wyniki pozostałych testów immunologicznych nie różniły się statystycznie w badanych grupach (tab. 2).
Tabela 1. Ocena odporności komórkowej.
Badane parametrynGrupa AnGrupa Bp=
Komórki NK1414,64?8,501314,31?5,11NS
Aktywność NK147,43?5,93134,38?3,80NS
Stymulacja limfT OKT31462556,50?52170,171457274,79?31708,25NS
CD31464,93?7,381566,27?6,47NS
CD81435,28?7,511530,33?4,75NS
CD41430,50?5,531536,73?6,430,0096
Tabela 2. Ocena odporności humoralnej i fagocytozy.
Badane parametrynGrupa AnGrupa Bp=
Stymulacja limf. B szczepem Cowan Staphylococcus aureus1475085,50?53349,931378387,54?38279,02NS
Zdolność do aktywacji limfocytów B124221?2290,04113736,73?2427,11NS
Zdolność limf. B do produkcji przeciwciał spontanicznie1416,86?3,11317,92?4,97NS
Zdolność limf. B do produkcji przeciwciał po aktywacji14309,29?195,2713334,92?216,50NS
Fagocytoza134,75?2,73135,02?2,73NS
DYSKUSJA
W przeprowadzonych przez nas badaniach zaobserwowaliśmy obniżenie poziomu limfocytów CD4+, u dzieci ze źle wyrównaną cukrzycą typu 1 i masywnym wzrostem grzybów z wymazów pobranych z odbytu i/lub zewnętrznych narządów płciowych, w porównaniu z dziećmi z podobnie złym wyrównaniem metabolicznym i brakiem lub obecnością pojedynczych drożdżaków. Wyniki pozostałych badań immunologicznych nie różniły się statystycznie w badanych grupach.
Rola odporności komórkowej w ochronie przed śluzówkową kandydozą podkreślana jest przez wielu autorów (19, 20, 21, 22)
W licznych badaniach na zwierzętach opisuje się znaczenie odporności komórkowej w obronie przed powierzchownymi zakażeniami Candida obejmującymi skórę, zewnętrzne narządy płciowe i przewód pokarmowy. Badając węzły chłonne zakażonych zwierząt stwierdzono, że w odpowiedzi na antygeny Candida dochodzi do rozwoju odpowiedzi immunologicznej typu Th1, charakteryzującej się zwiększeniem produkcji interleukiny 2 (IL-2), i interferonu gamma (IFN-g), przy jednoczesnym braku lub wytwarzaniu niewielkich ilości interleukiny 4 (IL-4) i interleukiny 10 (IL-10). Podawanie myszom bez defektu immunologicznego przeciwciał monoklonalnych anty-CD4 zwiększało ich podatność na zakażenia grzybicze (23, 24).
Z obserwacji klinicznych wynika, że osoby chorujące na cukrzycę mają większą predyspozycję do rozwoju zakażeń grzybiczych, a przebieg infekcji może być u nich cięższy. Najczęściej obserwujemy drożdżyce powierzchowne ograniczone do zewnętrznych warstw skóry i błon śluzowych. Większość tych zakażeń ma przebieg łagodny (8, 9, 10, 11, 12).
U pacjentów z cukrzycą szereg czynników może mieć wpływ na rozwój kandydozy. Zwiększone stężenie cukru w wydzielinach sprzyja kolonizacji i nadmiernemu namnażaniu się grzybów. U chorych z długotrwałą, źle wyrównaną cukrzycą, powikłaną mikroangiopatią i neuropatią częściej dochodzi do uszkodzeń mechanicznych skóry, które są czynnikiem predysponującym do rozwoju infekcji grzybiczych.
Jednym ze skutków hiperglikemii mogącym mieć wpływ na zaburzenie odporności jest glikacja białek. W procesie tym dochodzi do przyłączenia glukozy do cząsteczki białka. Na uwagę zasługują badania Hammes i wsp. którzy stwierdzili wyższy stopień glikacji immunoglobulin u pacjentów z cukrzycą w porównaniu z grupą kontrolną. Okazało się, że glikacja IgM była trzykrotnie wyższa niż IgG, jednocześnie stwierdzono upośledzenie aglutynacji zależnej od immunoglobuliny IgM. Przypuszcza się, że w początkowej fazie ostrej infekcji wysoki poziom glikowanej IgM wpływa negatywnie na odpowiedź immunologiczną. W dalszym ciągu nie jest do końca wyjaśnione, czy glikacja immunoglobulin powoduje zmniejszenie odporności na zakażenia (5).
W grupie pacjentów z cukrzycą opisywane są również zaburzenia odpowiedzi immunologicznej obejmujące upośledzenie podstawowych funkcji granulocytów obojętnochłonnych takich jak: fagocytoza, zdolność do wewnątrzkomórkowego zabijania drobnoustrojów, adhezja i chemotaksja. Zaburzenia czynnościowe tych komórek są ściśle związane ze stopniem wyrównania cukrzycy, dochodzi do nich u pacjentów ze złym wyrównaniem metabolicznym (1, 2, 4).
Wiadomo, że najważniejszą rolę w obronie przed zakażeniami grzybiczymi pełni fagocytoza i odporność komórkowa. Osoby z defektem fagocytozy narażone są głównie na uogólnione zakażenia grzybicze, natomiast u pacjentów z zaburzeniami odporności komórkowej częściej rozwijają się grzybice powierzchowne. Przykładem są chorzy na AIDS, u których obserwujemy masywne śluzówkowo-skórne postacie kandydozy. Należy przypomnieć, iż główną cechą określającą zaawansowanie AIDS jest utrata prawie wszystkich limfocytów T4 (CD4+) (13, 14).
Dla prawidłowego procesu fagocytozy potrzebna jest energia, której źródłem jest metabolizm glukozy. Transport glukozy przez błonę komórkową granulocyta nie wymaga obecności insuliny, odbywa się zgodnie z gradientem stężeń. Dodatkowym źródłem energii jest glikogen spichrzany wewnątrz granulocytu. Zapasy energetyczne fagocytów są niewielkie. W trakcie fagocytozy 40% glukozy zostaje zmetabolizowane tlenowym szlakiem pentozofosforanowym. W wyniku tej reakcji powstaje aktywny NADPH, który wykorzystywany jest do produkcji aktywnych związków tlenu. Fagocytoza drobnoustrojów powoduje w ciągu kilku sekund pobudzenie procesów oddechowych i utworzenie toksycznych utleniaczy, do których zaliczamy związki tlenu i utlenowane halogenki (15).
Jednym ze skutków hiperglikemii jest aktywacja szlaku poliolowego (sorbitolowego). Wysoki poziom glukozy u chorych na cukrzycę powoduje, że jest ona w znacznej części metabolizowana przez reduktazę aldozową przy udziale NADPH. Na skutek tych przemian dochodzi do zużycia NADPH, który jest niezbędny do opisanych tlenowych procesów zabijania drobnoustrojów przez komórki żerne (4, 16, 17, 18).
Analizując wyniki przeprowadzonych badań wydaje się, że masywny wzrost grzybów jaki uzyskano z wymazów z zewnętrznych narządów płciowych i/lub odbytu u dzieci i młodzieży ze źle wyrównaną cukrzycą typu 1 ma związek z obniżeniem poziomu limfocytów CD4+ w tej grupie pacjentów. U pacjentów ze źle wyrównaną cukrzycą może dochodzić nie tylko do opisywanych szeroko w literaturze zaburzeń funkcji granulocytów, ale również do zaburzeń odpowiedzi komórkowej, która pełni istotną rolę w obronie przed śluzówkowo-skórną postacią kandydozy.
Piśmiennictwo
1. Dębczyński W., Pietruska Z.: Chemotaksja i migracja spontaniczna granulocytów obojętnochłonnych u chorych na cukrzycę. Pol. Tyg. Lek. 1994, XLIX:11-13. 2.Wierusz-Wysocka B. i wsp.: Adhezja granulocytów obojętnochłonnych u chorych na cukrzycę. Pol. Tyg. Lek. 1996, LI:11-13. 3. Czyżyk A.: Patofizjologia i klinika cukrzycy. PWN 1997, 533-545. 4.Pickup J., Wiliams G.: Textbook of Diabetes. Oxford Blackwell Scientific Publication 1991. 5.Hammes H.P. et al.: Impaired aglutination of IgM resulting from non-enzymatic glycation in diabetes mellitus. Diabet. Res. Clin. Practice 1990, 9: 37-42. 6.Tatoń J.: Diabetologia praktyczna PZWL 1993, 374-379. 7.Kowszyk-Gindifer Z., Sobiszewski W.: Grzybice i sposoby ich zwalczania. Warszawa PZWL 1986. 8.Bodey G.P., Fainstein V.: Candidiasis New York Raven Press 1988. 9.Pozzilli P., Leslie R.D.: Infections and diabetes: mechanisms and prospects for prevention. Diabet-Med. 1994, 11: 935-41. 10.Goswami R. et al.: Species - specific prevalence of vaginal candidiasis among patients with diabetes mellitus and its relation to their glycaemic status. J. Infect. 2000, 41:162-6. 11.Vazquez J.A., Sobel J.D.: Fungal infection in diabetes. Infect. Dis. Clin. North. Am. 1995, 9: 97-116. 12.Liotta A. et al: Vaginal infections in a population of diabetic children and adolescents. Pediatr. Med. Chir. 1987, 9:305-308. 13.Leigh J.E. et al.: Candida - specific systemic cell - mediated immune reactiviaties in human immunodeficiency virus - positive persons with mucosal candidiasis. J. Infect. Dis. 2001 183:277-285 (CD4 HIV). 14.Cantorna M.T., Balish E.: Acquired immunity to systemic candidiasis in immunodeficient mice. J. Infect. Dis. 1991, 164:936-943. 15.Jakóbisiak M.: Immunologia PWN 1995. 16.Inoue S. et al.: Reduced hydrogen peroxide production in neutrophils from patients with diabetes. Diabetes Res. Clin. Pract. 1996, 33:119-127 (NADPH). 17.Noritake M. et al.: Intracellular hydrogen peroxide production by peripheral phagocytes from diabetic patients. Dissociation between polymorphonuclear leucocytes and monocytes. Clin. Exp. Immunol. 1992, 88:269-274 (NADPH). 18.Tebbs S.E. et al.: The role of aldose reductase inhibition in diabetic neutrophil phagocytosis and killing. Clin. Exp. Immunol. 1991, 84:482-487. 19.Talluri G. et al.: Immune response in patients with persistent candidiuria and occult cadidiemia. J. Urol. 1999, 162:1361-4 (Th1). 20.Moraes-Vasconcelos D. et al.: Characterisation of the cellular immune function of patients with chronic mucocutaneous candidiasis. Clin. Exp. Immunol. 2001, 123: 247-53 (Th1). 21.Fidel P. et al.: Effects of preinduced Candida - specific cell-mediated immunity on experimental vagina candidiasis. Infect. Immun. 1994, 62:1032-1038. 22.Cantorna M.T., Balish E.: Role of CD4+ lymphocytes in resistance to mucosal candidiasis. Infect. Immun. 1991, 59:2447-2455. 23.Repentigny L. et al.: Gastrointestinal colonization and systemic dissemination by Candida albicans and Candida tropicalis in intact and immunocompromised mice. Infect. Immun. 1992, 60:4907-4914. 24.Fidel P. et al.: Candida specific Th1 - type responsiveness in mice experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 1993; 61:3939-3943.
Nowa Pediatria 2/2004
Strona internetowa czasopisma Nowa Pediatria