Ludzkie koronawirusy - autor: Krzysztof Pyrć z Zakładu Mikrobiologii, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków

Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 8/2017, s. 408-413
*Patrycja Zielińska, Agata Wieczorkiewicz-Kabut, Monika Dzierżak-Mietła, Krzysztof Białas, Anna Koclęga, Krystyna Jagoda, Agnieszka Karolczyk, Grzegorz Helbig, Sławomira Kyrcz-Krzemień
Ocena populacji mieszanej erytrocytów (chimeryzmu erytrocytów) metodą cytometrii przepływowej u pacjentów po allogenicznej transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych**
Analysis of mixed population of erythrocytes (chimerism of erythrocytes) by flow cytometry in patients who underwent allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
Klinika i Oddział Hematologii i Transplantacji Szpiku, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
p.o. Kierownika Kliniki: prof. dr hab. med. Grzegorz Helbig
Lekarz Kierujący Oddziałem: prof. dr hab. med. Sławomira Kyrcz-Krzemień
Streszczenie
Wstęp. Cytometria przepływowa (FC) to nowoczesna metoda badawcza i diagnostyczna, umożliwiająca diagnostykę jakościową i ilościową różnych populacji komórek.
Cel pracy. Ocena chimeryzmu erytrocytów u pacjentów po alloprzeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych w przypadku dużej niezgodności grup krwi pomiędzy dawcą i biorcą.
Materiał i metody. Grupę badaną stanowiło łącznie 65 dorosłych pacjentów poddanych allogenicznej transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych w Klinice Hematologii i Transplantacji Szpiku Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach w latach 2012-2014. Materiał stanowiła krew obwodowa pobrana do rutynowego oznaczenia morfologii krwi, w ilości od 100 do 250 μl. Badanie oceny chimeryzmu erytrocytów zostało przeprowadzone w dobie +30., a następnie 2, 3, 6, 9 i 12 miesięcy po alloHSCT w podgrupie chorych z dużą niezgodnością grup krwi.
Wyniki. Wśród badanej podgrupy chorych (n = 33) z dużą niezgodnością grup krwi mediana wartości chimeryzmu erytrocytów u większości chorych z prawidłowo przebiegającym wszczepieniem linii erytroblastycznej wynosiła: w dobie +30. – 7% (zakres: 0,2-15,1%), 2 miesiące po alloHSCT – 34,7% (zakres: 16,2-45,5%), 3 miesiące po przeszczepieniu – 87% (zakres: 79,1-97,2%), w kolejnych punktach pomiarowych odpowiednio mediany wynosiły: 95,3% (zakres: 85,2-99,1%), 98,7% (zakres: 86,6-99,7%) i 98,8% (zakres: 89,4-99,8%). Jedynie u 3 chorych z dużą niezgodnością grup krwi stwierdzono brak erytrocytów dawcy we krwi obwodowej chorego, co w dalszej obserwacji doprowadziło do rozwoju aplazji czystoczerwonokrwinkowej u tych chorych.
Wnioski. W przypadku oceny erytrocytów po allogenicznej transplantacji cytometria przepływowa jest narzędziem prostym oraz stosunkowo mało czaso- i kosztochłonnym, pozwalającym w szybki sposób monitorować wszczep linii erytroblastycznej w przypadku transplantacji z dużą niezgodnością grup krwi pomiędzy dawcą i biorcą.
Summary
Introduction. Flow cytometry (FC) is a modern research and diagnostic technique, that allows qualitative and quantitative assessment of different cell populations.
Aim. Assessment of chimerism of erythrocytes in patients after allogeneic stem cell transplantation with major blood group incompatibility.
Material and methods. The group of 65 patients who underwent allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in the Department of Hematology and Bone Marrow Transplantation, Medical University of Silesia, Katowice, in years 2012-2014 was included in the study. Peripheral blood collected for routine blood count in the amount of 100-250 μl was used. The assessment of erythrocyte chimerism was performed in day +30 after alloHSCT and then 2, 3, 6, 9 and 12 months after transplantation in the subgroup of patients with major blood group incompatibility.
Results. Among the subgroup of patients with major blood group mismatch (n = 33) and normal engraftment of erythroblastic line, median erythrocyte chimerism was found to be: 7% (range: 0.2-15.1%) in day +30, 34.7% (range: 16.2-45.5%) 2 months after alloHSCT, 87% (range: 79.1-97.2%) 3 months after the procedure, in the next time points the median values were as follows: 95.3% (range: 85.2-99.1%), 98.7% (range: 86.6-99.7%) and 98.8% (range: 89.4-99.8%). Only 3 patients with major blood group mismatch were found to have no donor erythrocytes in their peripheral blood, which resulted in the development of pure red cell aplasia in these cases.
Conclusions. Flow cytometry can be used after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation as an easy, reliable, not time and cost-consuming method to evaluate the engraftment of erythroblastic line in patients with major blood group incompatibility.
WSTĘP
Allogeniczna transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych (ang. allogeneic hematopoietic stem cell transplantation – alloHSCT) to metoda dająca szansę na wyleczenie u pacjentów z chorobami rozrostowymi układu krwiotwórczego. Procedura ta może być przeprowadzona również w przypadku niezgodności grup krwi pomiędzy dawcą a biorcą, gdyż antygeny zgodności tkankowej są dziedziczone w sposób niezależny od antygenów grupowych erytrocytów. Obecnie niemal połowa wszystkich procedur przeszczepowych jest wykonywana w przypadku niezgodności grup krwi. Odmiennie wygląda to w przeszczepieniach narządów litych, gdzie zgodność grup krwi w parze dawca-biorca jest kluczową kwestią. Stwierdzono, że w przypadku niezgodności grup krwi częściej dochodzi do hemolizy, która objawia się natychmiast podczas przeszczepienia lub też dopiero podczas regeneracji układu krwiotwórczego, jak również częściej obserwuje się opóźnienie lub brak wszczepu linii erytroblastycznej. Powikłania hemolityczne znacznie częściej pojawić się mogą po przeszczepieniach krwiotwórczych komórek macierzystych szpiku, co związane jest z zanieczyszczeniem materiału przeszczepowego przez erytrocyty i/lub osocze. Szacuje się, że w około 3-29% przypadków może wystąpić aplazja czystoczerwonokrwinkowa (ang. pure red cell aplasia – PRCA) (1-3).
Dostępne dane w piśmiennictwie nie wskazują w sposób jednoznaczny na niekorzystny wpływ niezgodności grup krwi na całkowite przeżycie biorców (ang. overall survival – OS) czy śmiertelność niezwiązaną z nawrotem (ang. non-relapse mortality – NRM), jak również rozwój choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (ang. graft-versus-host disease – GVHD) oraz przeżycie wolne od choroby (ang. disease free survival – DFS) (1-4).
W celu monitorowania i/lub zapobieżenia wystąpieniu powyższych powikłań kluczowym wydaje się odpowiednie monitorowanie wszczepu linii erytroblastycznej we wczesnym okresie poprzeszczepowym u pacjentów przeszczepianych od dawców o innej grupie krwi. Wyróżnia się dużą i małą niezgodność grup krwi oraz tzw. dwukierunkową (ang. bidirectional). Duża niezgodność grup krwi, występująca w około 20-25% przypadków, ma miejsce, gdy na erytrocytach dawcy są obecne antygeny niewystępujące u biorcy, a pacjent posiada izohemaglutyniny skierowane przeciwko tym antygenom. Duża niezgodność występuje między dawcą grupy A, B lub AB oraz biorcą grupy 0. Gdy w materiale przeszczepowym obecne są krwinki czerwone, izohemaglutyniny biorcy mogą je związać, powodując gwałtowną hemolizę. Ponadto mogą też wpłynąć na opóźnienie wszczepienia linii erytroblastycznej lub rozwój aplazji czystoczerwonokrwinkowej, będącej wynikiem produkcji izohemaglutynin przez resztkowe limfocyty B i plazmocyty pacjenta.
O małej niezgodności grup krwi, która również stanowi około 20-25% przypadków, mówimy w sytuacji odwrotnej, tzn. gdy dawca posiada izohemaglutyniny skierowane przeciwko odpowiednim antygenom grupowym na erytrocytach pacjenta. Sytuacja taka występuje między dawcą grupy 0 a biorcą grupy A, B lub AB oraz między dawca grupy A lub B a biorcą grupy AB. Bierny transfer tych przeciwciał może skutkować ostrą hemolizą u chorego, zwłaszcza przy wysokim mianie przeciwciał u dawcy. Może również wystąpić opóźniona hemoliza jako skutek tzw. passenger lymphocyte syndrome, czyli zespołu limfocytów pasażerskich.
Możliwe jest też występowanie małej i dużej niezgodności grup krwi jednocześnie (gdy dawca ma grupę A, a biorca grupę B lub odwrotnie), czyli gdy zarówno dawca, jak i biorca posiadają przeciwciała skierowane przeciwko antygenom grupowym odpowiednio u dawcy/biorcy, jednak taka sytuacja ma miejsce jedynie w około 5% przypadków. Potencjalne powikłania są podobne jak opisane dla dużej i małej niezgodności grup krwi.
Uważa się, że niezgodność w zakresie czynnika Rh nie wpływa istotnie na przebieg okresu okołoprzeszczepowego u pacjenta.
Po około 3 miesiącach po przeszczepieniu chory powinien zmienić grupę krwi na grupę krwi dawcy. Największe ryzyko poważnych powikłań występuje w przypadku dużej niezgodności grup krwi i jest najwyższe we wczesnym okresie poprzeszczepowym, czyli do 3 miesięcy po transplantacji.
CEL PRACY
Praca prezentuje zastosowanie cytometrii przepływowej (ang. flow cytometry – FC) w celu określenia chimeryzmu erytrocytów po przeszczepieniu allogenicznych krwiotwórczych komórek macierzystych w przypadku niezgodności grup krwi pomiędzy dawcą i biorcą.
MATERIAŁ I METODY
Grupę badaną stanowiło łącznie 65 dorosłych pacjentów poddanych allogenicznej transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych w Klinice Hematologii i Transplantacji Szpiku Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach w latach 2012-2014. Wskazaniami do procedury alloHSCT były ostra białaczka limfoblastyczna oraz ostra białaczka szpikowa i zespół mielodysplastyczny. Chorzy zostali poddani leczeniu kondycjonującemu mieloablacyjnemu (32 pacjentów) oraz niemieloablacyjnemu (33 osoby). Od dawcy rodzinnego komórki przyjęło 13 chorych, natomiast od dawcy niespokrewnionego – 52 pacjentów. Wśród grupy badanej 13 dawców wykazywało niezgodność antygenową bądź alleliczną z biorcą w zakresie antygenów HLA. Źródłem komórek macierzystych była krew obwodowa we wszystkich przypadkach. Wśród badanej grupy 15,6% (24 przypadki) stanowiły transplantacje z dużą niezgodnością grup krwi pomiędzy dawcą i biorcą, natomiast 5,85% (9 przypadków) pary biorca-dawca z dużą i małą niezgodnością grup krwi. U większości chorych (łącznie 38 chorych) stosowano standardowe leczenie immunosupresyjne (tj. metotreksat w dobie +1., +3. oraz +6. oraz cyklosporynę początkowo dożylnie, a następnie doustnie w dawkach modyfikowanych w zależności od stężenia leku we krwi). U pozostałych chorych w leczeniu immunosupresyjnym stosowano mykofenolan mofetilu od doby -1., również początkowo dożylnie, a następnie doustnie. W przypadku przeszczepień od dawców niespokrewnionych stosowano surowicę antylimfocytarną w dawce 15 mg/kg przez 3 kolejne dni poprzedzające transplantację lub surowicę antytymocytarną (Thymoglobuline) w dawce 7,5 mg/kg (u 4 chorych). Dodatkowo stosowano profilaktyczne leczenie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe oraz przeciwgrzybicze, a także wspomagające, w zależności od sytuacji klinicznej. W okresie regeneracji i w trakcie opieki ambulatoryjnej monitorowano też reaktywację wirusa CMV metodą PCR u pacjentów. Charakterystykę grupy badanej przedstawiono w tabeli 1.
Tab. 1. Charakterystyka pacjentów
CharakterystykaLiczba
Diagnoza podstawowa:
ostra białaczka szpikowa
zespół mielodysplastyczny
ostra białaczka limfoblastyczna
 
50
5
10
Płeć pacjenta:
kobieta
mężczyzna
 
30
35
Wiek pacjenta, mediana (zakres)35 (19-67)
Dawca:
zgodny dawca rodzinny
zgodny dawca niespokrewniony (10/10)
niezgodny dawca niespokrewniony (9/10)
 
13
39
13
Niezgodność grup krwi:
duża
mała
dwukierunkowa
N = 45
24
12
9
Leczenie kondycjonujące:
mieloablacyjne (MAC)
niemieloablacyjne (RIC)
 
32
33
Źródło komórek macierzystych:
krew obwodowa
 
65
Wiek dawcy, mediana (zakres)23 (19-49)
Płeć dawca-biorca:
kobieta – dawca/mężczyzna – biorca
inne
 
19
46
Status CMV dawca-biorca:
pozytywny-negatywny
pozytywy-pozytywny
negatywny-negatywny
 
17
40
8
Materiał stanowiła krew obwodowa pobrana do rutynowego oznaczenia morfologii krwi, w ilości od 100 do 250 μl. Badanie oceny chimeryzmu erytrocytów zostało przeprowadzone w dobie +30., a następnie 2, 3, 6, 9 i 12 miesięcy po alloHSCT w podgrupie chorych z dużą oraz małą i dużą niezgodnością grup krwi.
Do badania wykorzystano przeciwciała monoklonalne wykorzystywane do rutynowego oznaczania grup krwi w układzie AB0. Przed inkubacją z przeciwciałami monoklonalnymi (PcMo) erytrocyty były wstępnie utrwalane 0,1% glutaraldehydem w PBS (roztworze soli fizjologicznej). Utrwalanie erytrocytów miało na celu zablokowanie zdolności do aglutynowania erytrocytów przez I PcMo. Następnie, po dwukrotnym przepłukaniu PBS, próbkę inkubowano najpierw z I PcMo anty-A, anty-B lub anty-D, potem z II PcMo wykrywającym obecność I PcMo na erytrocytach, sprzężonym z fluoresceiną. Do barwienia erytrocytów zastosowano metodę immunofluorescencji pośredniej ze względu na brak PcMo wykrywających antygeny grupowe – bezpośrednio znakowanych fluorochromami. Wyznakowane erytrocyty były analizowane na cytometrze przepływowym FACSCanto II firmy Becton Dickinson, na którym oceniano odsetek erytrocytów mających antygen A, B oraz ew. D (w zależności od grupy krwi dawcy i biorcy). W niektórych przypadkach, gdy niezgodność dotyczyła np. równocześnie układu AB0 i Rh, możliwa była ocena odsetka erytrocytów biorcy, dawcy oraz – dodatkowo przetaczanych w okresie okołoprzeszczepowym lub w przedłużającej się aplazji czerwonokrwinkowej – erytrocytów innych dawców. Wynik podawano w postaci odsetka erytrocytów posiadających dany antygen: A, B lub D.
Na przeprowadzone badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach (nr KNW/0022/KB1/123/11 oraz nr KNW/0022/KB1/100/14).
WYNIKI
W badanej grupie 65 chorych mediana przeszczepionych komórek CD34 dodatnich wynosiła 4,76 x 106/kg masy ciała (zakres: 1,7-11,91). Mediana czasu regeneracji neutrofili > 500/μL wynosiła 13 dni (zakres: 12-28 dni). Mediana czasu regeneracji płytek krwi > 50 000/μL – 16 dni (zakres: 11-24), jednak u 7 chorych wartości płytek krwi nie spadły poniżej 20 000/μL. Do doby +30. po alloHSCT żaden pacjent nie otrzymywał granulocytowego czynnika wzrostu.
Szczegółową analizą objęto chorych z niezgodnością grup krwi pomiędzy dawcą a biorcą. Wśród podgrupy chorych z dużą lub dwukierunkową niezgodnością grup krwi (łącznie 33 chorych) oceniano chimeryzm erytrocytów w dobie +30. po alloHSCT, następnie 2, 3, 6, 9, i 12 miesięcy po alloHSCT.

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 30 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Booth GS, Gehrie EA, Bolan CD, Savani BN: Clinical guide to ABO-incompatible allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2013; 19: 1152-1158.
2. Kimura F, Sato K, Kobayashi S et al.: Impact of AB0-blood group incompatibility on the outcome of recipients of bone marrow transplants from unrelated donors in the Japan Marrow Donor Program. Haematologica 2008; 93(11): 1686-1693.
3. Worel N: ABO-Mismatched Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Transfus Med Hemother 2016; 43(1): 3-12.
4. Ozkurt ZN, Yegin ZA, Yenicesu I et al.: Impact of AB0-incompatible donor on early and late outcome of hematopoietic stem cell transplantation. Transplant Proc 2009; 41(9): 3851-3858.
5. Stussi G, Halter J, Bucheli E et al.: Prevention of pure red cell aplasia after major or bidirectional ABO blood group incompatible hematopoietic stem cell transplantation by pretransplant reduction of host anti-donor isoagglutinins. Haematologica 2009; 94(2): 239-248.
6. Daniel-Johnson J, Schwartz J: How do I approach ABO-incompatible hematopoietic progenitor cell transplantation? Transfusion 2011; 51: 1143-1149.
7. Van der Meulen FW, de Bruin HG, Goosen PC et al.: Quantitative aspects of the destruction of red cells sensitized with IgG1 autoantibodies: An application of flow cytofluorometry. Br J Haematol 1980; 46: 47-56.
8. Arndt PA, Garratty G: Flow cytofluorometric analysis in red blood cell immunology. Transfus Med Hemother 2003; 31: 163-174.
9. Brown M, Wittwer C: Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem 2000; 46: 1221-1229.
10. Arndt PA, Kumpel BM: Blood doping in athletes-detection of allogenic blood transfusions by flow cytofluorometry. Am J Hematol 2008; 83: 657-667.
otrzymano: 2017-03-21
zaakceptowano do druku: 2017-07-26

Adres do korespondencji:
*Patrycja Zielińska
Klinika i Oddział Hematologii i Transplantacji Szpiku Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Dąbrowskiego 25, 40-032 Katowice
tel. +48 (32) 259-12-81
patrycja.zielinska@interia.pl

Postępy Nauk Medycznych 8/2017
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych