© Borgis - Nowa Pediatria 2/2004, s. 46-50
Agnieszka Szypowska, Ewa Pańkowska
Ocena wybranych parametrów układu immunologicznego u dzieci i młodzieży ze źle wyrównaną cukrzycą typu 1
Selected parameters of immunological system in children and adolescents with poorly controlled type-1 diabetes and fungal infections
II Katedra Pediatrii, Klinika Diabetologii Dziecięcej i Wad Wrodzonych Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Lech Korniszewski
Streszczenie
We assessed selected parameters of immunological system in group of children and adolescents with poorly controlled diabetes and fungal infections. The only abnormality we found was statistically significant low CD4 + in group of patients with fungal infection.
WSTĘP
Cukrzyca typu 1 jest ciężkim zaburzeniem metabolicznym, wywołanym niedoborem insuliny. Do rozwoju choroby dochodzi na skutek wybiórczego niszczenia w procesie autoimmunologicznym komórek beta w wysepkach Langerhansa w trzustce.
Celem leczenia cukrzycy jest prawidłowe wyrównanie metaboliczne pacjentów. Niedostateczne wyrównanie nie tylko sprzyja rozwijaniu się późnych powikłań, ale zwiększa także skłonność do rozwoju zakażeń bakteryjnych i grzybiczych. Szereg czynników wpływa na wzrost częstości zakażeń w tej grupie pacjentów. Opisuje się upośledzenie czynności granulocytów obojętnochłonnych takich jak: fagocytoza, zdolność do wewnątrzkomórkowego zabijania drobnoustrojów, adhezja, czy chemotaksja (1, 2, 3, 4).
Jednym ze skutków hiperglikemii jest glikacja białek, wysoki poziom glikowanej immunoglobuliny IgM może wpływać negatywnie na odpowiedź immunologiczną w początkowej fazie ostrej infekcji (5).
U chorych z przewlekle źle wyrównaną cukrzycą powstają ponadto zmiany w układzie naczyniowym i nerwowym (microangiopathia i neutropathia diabetica), które przyczyniają się do zaburzeń ukrwienia i do powstania zmian troficznych w tkankach, szególnie w obrębie kończyn dolnych. W momencie przerwania ciągłości podstawowej bariery obronnej człowieka, jaką jest skóra, łatwo dochodzi do wnikania drobnoustrojów i rozwoju infekcji (3, 6).
Częstym problemem chorych na cukrzycę są nawracające zakażenia grzybicze. Wysokie stężenie cukru w wydzielinach ustrojowych sprzyja namnażaniu się grzybów. Zazwyczaj obserwujemy grzybice powierzchowne ograniczone do zewnętrznych warstw skóry, paznokci i błon śluzowych, o łagodnym przebiegu. Najczęściej wywołują te zmiany grzyby z gatunku Candida, które występują jako saprofity na błonach śluzowych i skórze człowieka (4, 7).
U chorych na cukrzycę zakażenia wpływają niekorzystnie na wyrównanie metaboliczne pacjentów. W trakcie infekcji wzrasta zapotrzebowanie na insulinę i trudniej jest uzyskać normoglikemię (3, 4, 6).
Obserwując dzieci i młodzież ze złym wyrównaniem metabolicznym, zaobserwowaliśmy u części z nich masywny wzrost grzybów z wymazów pobranych z zewnętrznych narządów płciowych i/lub odbytu. Zastanawiające było, dlaczego u pozostałych badanych, mimo podobnie złego wyrównania metabolicznego, nie stwierdziliśmy obecności, bądź występowały tylko nieliczne komórki grzybów. Wywiad nie wskazywał na różnice w przestrzeganiu higieny osobistej w obydwu grupach. Podejrzewając, że chorzy ze źle wyrównaną cukrzycą i masywnym wzrostem grzybów mogą mieć zaburzenia odporności, sprzyjające rozwojowi flory patogennej, oceniono u pacjentów wybrane parametry odpowiedzi immunologicznej.
MATERIAŁ I METODY
Badaniem objęto 29 dzieci i młodzieży chorujących na cukrzycę typu 1, znajdujących się pod opieką Kliniki Diabetologii Dziecięcej i Wad Wrodzonych II Katedry Pediatrii Akademii Medycznej w Warszawie. Kryterium doboru grupy było złe wyrównanie metaboliczne cukrzycy, które oceniano na podstawie wartości HbA1c, do badania zakwalifikowano osoby z HbA1c powyżej 10%. Pacjentów podzielono na dwie grupy.
Grupa A: pacjenci z masywnym wzrostem grzybów z wymazów pobranych z zewnętrznych narządów płciowych i/lub odbytu, u których średnią liczbę kolonii grzybów uzyskaną z dwóch płytek posiewowych oceniono jako: dość liczne, liczne, lub zlewne: 14 osób w wieku 12-19 lat (śr. 16,5±2,34), chorujący na cukrzycę od 2-17 lat (śr. 7,7±08), HbA1c 10,2%-15,6% (śr. 12,1±1,48).
Grupa B: pacjenci, u których nie stwierdzono obecności grzybów, lub średnią liczbę kolonii grzybów oceniono jako: pojedyncze lub nieliczne: 15 osób w wieku 12-18 lat (śr. 15,0±1,77), chorujący na cukrzycę od 3 do 11 lat (śr. 6,7±2,69), HbA1c 10,0%-17,6% (śr. 11,4±1,96).
Żaden z badanych pacjentów nie miał w czasie badania objawów infekcji wirusowej, ani bakteryjnej oraz nie przyjmował antybiotyków, ani preparatów grzybobójczych w okresie poprzedzającym 6 tygodni badanie. Wszyscy badani, bądź ich rodzice, zostali poinformowani o sposobie i celu badań oraz wyrazili pisemną zgodę na ich wykonanie. Protokół badań został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Akademii Medycznej w Warszawie.
Badania mikologiczne
U wszystkich pacjentów pobrano wymazy z odbytu, sromu, lub spod napletka i oceniano obecność grzybów w preparacie bezpośrednim oraz w hodowli na podłożu Sabourauda. Wyrastające hodowle grzybów drożdżoidalnych identyfikowano używając agaru selektywnego CHROMagar Candida firmy BBL Becton Dickinson oraz testów API 20C AUX i ID 32C firmy BioMerieux. Inne grzyby identyfikowano w oparciu o cechy morfologiczne. Występowanie grzybów określano poprzez ocenę średniej liczby kolonii uzyskanej z dwóch płytek posiewowych.
Wyrównanie metaboliczne
Hemoglobina glikowana frakcja A1c oznaczana była metodą HPLC (zakres normy wynosi od 4% do 6%). W badaniu tym oceniano wartość HbA1c z ostatnich 6 miesięcy.
Badania immunologiczne
Test proliferacji
Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej izolowano przy użyciu Gradisolu L firmy Polfa Kutno i zawieszano w środowisku hodowlanym Parkera z Wytwórni Surowic i Szczepionek w Lublinie, suplementowane 10% inaktywowaną surowicą cielęcą firmy Sigma. Hodowle stymulowano PHA firmy Sigma dodając szczep Cowan Staphylococcus aureus firmy SAC, Pansorbin, Calbiochem. Wykonywano stymulację limfocytów T przy użyciu przeciwciała monoklonalnego OKT-3. Oceniano stopień proliferacji komórek na podstawie pomiaru aktywności wbudowywanej przez te komórki, znakowanej trytem tymidyny. Po zakończeniu inkubacji komórki zbierano za pomocą harvestera firmy Skatron i odczytywano aktywność wbudowanej tymidyny na liczniku scyntylacyjnym 1450 Microbeta firmy Wallac.
Test fagocytarny
Izolowane przy pomocy Gradisolu G firmy Polfa Kutno granulocyty krwi obwodowej zawieszano w środowisku hodowlanym PBS z Wytwórni Surowic i Szczepionek w Lublinie suplementowanym 0,1% albuminą bydlęcą firmy Sigma i glukozą. Do granulocytów dodawano cytochrom c oraz Phorbol 12-Myristate 13- Acetate firmy Sigma. Odczytywano pomiar ekstynkcji zredukowanego cytochromu c przez granulocyty przy długości fali 550 nm czytnikiem ELISA firmy Spectra.
Plaque Forming Test
Erytrocyty barana (SRBC) inkubowano z liofilizowanym białkiem A firmy Sigma (SpA) uzyskujac zawiesinę SRBC SpA. Do zawiesiny dodawano surowicę świnki morskiej firmy Biomed zawierającą komplement. Otrzymany roztwór inkubowano uzyskując aktywny komplement. Komórki krwi obwodowej izolowano przy pomocy Gradisolu L, następnie hodowano je po dodaniu Lecitin Form Phytolacca Americana firmy Sigma. Do komórek po hodowli dodawano zawiesiną SRBC SpA, królicze przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobulinom firmy Dako, do roztworu dodano komplement absorbowany SRBC. Liczono obszary powstałej hemolizy i przeliczono na 105 komórek krwi obwodowej.
Analiza komórek Natural Killer (NK) oraz ocena ich aktywności
Komórki obwodowe izolowano z pełnej krwi obwodowej przy użyciu Gradisolu L. Do wyizolowanych komórek dodawano przeciwciała CD 16 FITS firmy Becton Dickinson. Analizę komórek przeprowadzano w cytometrze przepływowym FACS Calibur firmy Becton Dickinson. W celu oceny aktywności komórek NK do hodowli komórek krwi obwodowej dodawano hodowlę komórek K 562. Po inkubacji analizowano dane przy pomocy cytometru przepływowego. Wynikiem był stosunek komórek martwych do wszystkich komórek.
Ocena subpopulacji komórek w populacji limfocytów
Do znakowania poszczególnych subpopulacji użyto przeciwciał monoklonalnych stosując technikę dwukolorowej lub jednokolorowej immunofluorescencji. Wyizolowane komórki krwi obwodowej inkubowano z przeciwciałami monoklonalnymi CD3-PE, CD4-FITC/CD8-PE. Analizę przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego.
Analiza statystyczna
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej. Do porównywania średnich wartości stosowano test t-Studenta. Za różnice istotne statystycznie przyjęto te, przy których poziom istotności (p) był mniejszy od 0,05.
WYNIKI
W badaniach mikologicznych u pacjentów z grupy A stwierdzono masywny wzrost grzybów w hodowlach z wymazów z odbytu i/lub zewnętrznych narządów płciowych. W tej grupie średnią liczbę kolonii uzyskaną z dwóch płytek posiewowych oceniono jako: dość liczne, liczne lub zlewne. U osób z grupy B, pomimo podobnie złego wyrównania metabolicznego w hodowlach mikologicznych z wymazów z odbytu i/lub zewnętrznych narządów płciowych, nie stwierdzono obecności grzybów, bądź występowały, pojedyncze, lub nieliczne komórki grzybów.
Ze względu na trudności techniczne wynikające z konieczności jednoczesnego wykonywania kilku badań immunologicznych w różnych pracowniach, u pojedynczych osób nie udało się uzyskać wyników wszystkich badań.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Dębczyński W., Pietruska Z.: Chemotaksja i migracja spontaniczna granulocytów obojętnochłonnych u chorych na cukrzycę. Pol. Tyg. Lek. 1994, XLIX:11-13. 2.Wierusz-Wysocka B. i wsp.: Adhezja granulocytów obojętnochłonnych u chorych na cukrzycę. Pol. Tyg. Lek. 1996, LI:11-13. 3. Czyżyk A.: Patofizjologia i klinika cukrzycy. PWN 1997, 533-545. 4.Pickup J., Wiliams G.: Textbook of Diabetes. Oxford Blackwell Scientific Publication 1991. 5.Hammes H.P. et al.: Impaired aglutination of IgM resulting from non-enzymatic glycation in diabetes mellitus. Diabet. Res. Clin. Practice 1990, 9: 37-42. 6.Tatoń J.: Diabetologia praktyczna PZWL 1993, 374-379. 7.Kowszyk-Gindifer Z., Sobiszewski W.: Grzybice i sposoby ich zwalczania. Warszawa PZWL 1986. 8.Bodey G.P., Fainstein V.: Candidiasis New York Raven Press 1988. 9.Pozzilli P., Leslie R.D.: Infections and diabetes: mechanisms and prospects for prevention. Diabet-Med. 1994, 11: 935-41. 10.Goswami R. et al.: Species - specific prevalence of vaginal candidiasis among patients with diabetes mellitus and its relation to their glycaemic status. J. Infect. 2000, 41:162-6. 11.Vazquez J.A., Sobel J.D.: Fungal infection in diabetes. Infect. Dis. Clin. North. Am. 1995, 9: 97-116. 12.Liotta A. et al: Vaginal infections in a population of diabetic children and adolescents. Pediatr. Med. Chir. 1987, 9:305-308. 13.Leigh J.E. et al.: Candida - specific systemic cell - mediated immune reactiviaties in human immunodeficiency virus - positive persons with mucosal candidiasis. J. Infect. Dis. 2001 183:277-285 (CD4 HIV). 14.Cantorna M.T., Balish E.: Acquired immunity to systemic candidiasis in immunodeficient mice. J. Infect. Dis. 1991, 164:936-943. 15.Jakóbisiak M.: Immunologia PWN 1995. 16.Inoue S. et al.: Reduced hydrogen peroxide production in neutrophils from patients with diabetes. Diabetes Res. Clin. Pract. 1996, 33:119-127 (NADPH). 17.Noritake M. et al.: Intracellular hydrogen peroxide production by peripheral phagocytes from diabetic patients. Dissociation between polymorphonuclear leucocytes and monocytes. Clin. Exp. Immunol. 1992, 88:269-274 (NADPH). 18.Tebbs S.E. et al.: The role of aldose reductase inhibition in diabetic neutrophil phagocytosis and killing. Clin. Exp. Immunol. 1991, 84:482-487. 19.Talluri G. et al.: Immune response in patients with persistent candidiuria and occult cadidiemia. J. Urol. 1999, 162:1361-4 (Th1). 20.Moraes-Vasconcelos D. et al.: Characterisation of the cellular immune function of patients with chronic mucocutaneous candidiasis. Clin. Exp. Immunol. 2001, 123: 247-53 (Th1). 21.Fidel P. et al.: Effects of preinduced Candida - specific cell-mediated immunity on experimental vagina candidiasis. Infect. Immun. 1994, 62:1032-1038. 22.Cantorna M.T., Balish E.: Role of CD4+ lymphocytes in resistance to mucosal candidiasis. Infect. Immun. 1991, 59:2447-2455. 23.Repentigny L. et al.: Gastrointestinal colonization and systemic dissemination by Candida albicans and Candida tropicalis in intact and immunocompromised mice. Infect. Immun. 1992, 60:4907-4914. 24.Fidel P. et al.: Candida specific Th1 - type responsiveness in mice experimental vaginal candidiasis. Infect. Immun. 1993; 61:3939-3943.
