© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2010, s. 3-8
*Elżbieta Hołderna-Kędzia
Działanie substancji olejkowych na bakterie i grzyby
Activity of essential oil substances on bacteria and fungi
Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Grzegorz Spychalski
Summary
The aim the study was to assess the antibiotic activity of the 36 essential oil components of four classes of aromatic organic compounds (monoterpene, sesquiterpenes, phenols, polyacetylene). The antimicrobial activity of these compounds was tested against standard and clinical strains Gram-positive cocci (Staphylococcus aureus), Gram-negative bacilli (Escherichia coli), yeast-like fungi (Candida albicans). The activity was determined by the serial dilutions method in Antibiotic Medium for bacteria, and Sabouraud Liquid Broth for fungi. In our study, the eight of a thirty-six essential oil components: limonene, p-cymene, terpinolene, thymol, carvacrol, borneol, anethole, cinnamic aldehyde, tested against standard strains of bacteria and fungi demonstrated the highest antibiotic activity (MIC = 250-750 ?g/ml). In turn, a four of seventeen essential oil components: tested against clinical strains showed, accordingly, the highest antibiotic activity (MIC = 25-250 ?g/ml). Remained essential oil components demonstrated a very low activity against one, two or three standard or clinical strains (MIC = 300-1000 ?g/ml).
Wśród naturalnych substancji o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych liczną, a zarazem bardzo zróżnicowaną pod względem struktury chemicznej i właściwości grupę, stanowią substancje olejkowe. Związki te wchodzą w skład frakcji roślin olejkowych, tj. zawierających w swych komórkach olejki eteryczne, które pozyskuje się z surowca roślinnego na drodze destylacji z parą wodną. Najczęściej spotykane w świecie roślinnym składniki olejkowe należą do takich grup chemicznych, jak monoterpeny (acykliczne, monocykliczne, dicykliczne), seskwiterpeny, fenole (proste, alkoholofenole), poliacetyleny. Wykazują one szereg cennych właściwości biologicznych, w tym działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, co znajduje potwierdzenie w badaniach prowadzonych w licznych ośrodkach naukowych.
Przegląd danych piśmiennictwa wskazuje na dużą różnorodność zastosowanych technik badawczych substancji olejkowych, uwzględnianie składników z rożnych grup chemicznych, jak również na dużą rozpiętość uzyskanych wyników badań.
Morris i wsp. (1) przy wykorzystaniu metody rozcieńczeń w podłożu agarowym ocenił aktywność antybiotyczną kilkudziesięciu składników olejkowych wobec przedstawicieli trzech grup drobnoustrojów chorobotwórczych, tj. ziarniaków Gram-dodatnich ( Staphylococcus aureus), pałeczek Gram-ujemnych ( Escherichia coli), grzybów drożdżoidalnych ( Candida albicans). Uzyskane wartości MIC (Minimal Inhibitory Concentration) od 500 do>1000 ?g/ml wskazują na słabą aktywność przeciwbakteryjną przebadanych składników. Jedynie anetol i cytronelol wykazywały silne działanie na grzyby drożdżoidalne C. albicans (MIC = 100 ?g/ml).
Z kolei Didry i wsp. (2) na podstawie badań w podłożu płynnym stwierdzili, że oceniane przez nich składniki olejkowe, tj. aldehyd cynamonowy, tymol i karwakrol działały silnie zarówno na ziarniaki S. aureus,jak i na pałeczki E. coli (MIC = 125-250 ?g/ml).
Autorzy australijscy (3) określili aktywność antybiotyczną przy zastosowaniu metody agarowej 61 związków terpenowych należących do różnych grup chemicznych. Najsilniejsze działanie na ziarniaki S. aureus wykazywały cytronelol i karwakrol, na pałeczki E. coli – karwakrol, a na drożdżaki C. albicans cytronelal, cytronelol, geraniol, mentol, α-terpineol, karwakrol, terpinen-4-ol, tymol, izoeugenol i eugenol (MIC w granicach 430-930 ?g/ml). Natomiast pozostałe badane przez autorów terpenoidy odznaczały się słabszą aktywnością antybiotyczną (MIC w zakresie 1000-18000 ?g/ml).
Inouye i wsp. (4) przebadali pod kątem aktywności przeciwbakteryjnej 14 składników olejkowych metodą rozcieńczeń w podłożu agarowym. Wobec ziarniaków Gram-dodatnich S. aureus najwyższą aktywność uzyskali oni dla karwakrolu, tymolu, aldehydu cynamonowego, cytralu, geraniolu i mentolu (MIC = 200-800 ?g/ml). Natomiast wobec pałeczek Gram-ujemnych E. coli najwyższą aktywność wykazywały – karwakrol, aldehyd cynamonowy i tymol (MIC = 400->500 ?g/ml). Pozostałe badane składniki olejkowe, tj. aldehyd perylowy, menton, terpinen- 4-ol, linalol, kamfora, α-pinen, 1,8-cyneol i d-limonen działały słabiej na testowane drobnoustroje (MIC w granicach stężeń 1000->3200 ?g/ml).
Kolejne badania (5), prowadzone przez zespół naukowców japońskich, obejmowały działanie 13 olejków eterycznych i 15 głównych składników tych olejków w formie gazowej na drobnoustroje chorobotwórcze dla człowieka. Najmniejszą dawkę składników olejkowych hamującą wzrost drobnoustrojów (MID) określano w mg/l powietrza. I tak najsilniejsze działanie zarówno na ziarniaki S. aureus,jak i na pałeczki E. coli stwierdzono dla tymolu, aldehydu cynamonowego i cytralu (MID wynosiła odpowiednio 3,13; 6,25 i 12,5 mg/l). Pozostałe przebadane składniki olejkowe w liczbie 12 wykazywały słabszą aktywność antybiotyczną wobec powyższych drobnoustrojów (MID w granicach 25->800 mg/l).
Rai i Mares (6) ocenili przy wykorzystaniu podłoża agarowego efekty działania 6 składników olejkowych z grupy terpenów, fenoli i aldehydów na bakterie i grzyby pochodzące ze zmian chorobowych skóry człowieka. Prawie wszystkie przebadane składniki olejkowe, tj. geraniol, santalol, tymol, eugenol i aldehyd cynamonowy, wykazywały silne działanie na ziarniaki Gram-dodatnie S. epidermidis (MIC w granicach 100-800 ?g/ml). Wyjątek stanowił cytronelol (MIC =>1000 ?g/ml). Natomiast silnym działaniem przeciwgrzybiczym w stosunku do grzybów drożdżoidalnych C. albicans odznaczał się geraniol, tymol, eugenol i aldehyd cynamonowy (MIC w zakresie stężeń 60-400 ?g/ml). Słabą aktywność przeciwdrożdżakową wykazywał jedynie santalol i cytronelal (MIC odpowiednio 1000 i 1500 ?g/ml).
Podobne badania z użyciem składników olejkowych, w kontekście analizy składu chemicznego zawierających je olejków eterycznych, prowadzone były również we własnym zakresie. Przy zastosowaniu techniki rozcieńczeń w podłożu agarowym przebadano podstawowe składniki olejku krwawnikowego wobec szczepów drobnoustrojów szpitalnych (7). Najsilniejszym działaniem na ziarniaki S. aureus odznaczał się chamazulen (MIC = 750 ?g/ml), a na grzyby drożdżoidalne C. albicans – chamazulen, borneol i terpineol (MIC = 500-1000 ?g/ml). Działanie pozostałych składników olejku krwawnikowego (β-kariofylen, cyneol, borneol, kamfen, kamfora, octan bornylu, α-pinen) było znacznie słabsze wobec testowanych szczepów bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i grzybów drożdżoidalnych (MIC w granicach 2500-10000 ?g/ml). W kolejnej pracy (8) z użyciem chorobotwórczych szczepów bakterii i grzybów, także w podłożu agarowym, określono aktywność antybiotyczną 13 składników olejku szałwiowego. Silne działanie w odniesieniu do ziarniaków S. aureus wykazywał p-cymen (MIC = 500 ?g/ml), wobec drożdżaków C. albicans p-cymen i borneol (MIC odpowiednio 250 i 1000 ?g/ml). Pozostałe analizowane składniki olejkowe (tujon, kamfora, cyneol, β-kariofylen, kamfen, α-pinen, octan bornylu, limonen, β-myrcen, β-pinen, linalol) działały słabo na ziarniaki S. aureus,pałeczki E. coli, jak i na drożdżaki C. albicans (MIC w granicach 2500-10000 ?g/ml).
W późniejszych badaniach (9), przeprowadzonych w podłożu płynnym, oceniono stopień aktywności przeciwdrobnoustrojowej 9 składników olejku melisowego (cytronelal, geraniol, cytronelol, cytral, β-kariofylen, limonen, tymol, karwakrol i mentol). Na ziarniaki Staphylococcus aureus działały one w zakresie stężeń 75-300 ?g/ml, nieco słabiej na drożdżaki C. albicans (MIC od 200 do 400 ?g/ml). Natomiast na pałeczki Escherichia coli działanie prawie wszystkich składników olejku melisowego było słabe (MIC w granicach 750-1000 ?g/ml). Wyjątek stanowiły tymol i karwakrol, które hamowały wzrost tej pałeczki Gram-ujemnej w niższym stężeniu, tj. 200 ?g/ml.
Z przytoczonych danych wynika, że składniki olejkowe należące do różnych grup chemicznych charakteryzują się zróżnicowaną aktywnością antybiotyczną, tak wobec przedstawicieli ziarniaków Gram-dodatnich, pałeczek Gram-ujemnych, jak i grzybów drożdżoidalnych. Jest to związane z zastosowaniem różnych technik badawczych praktykowanych w danym laboratorium, ze źródłem pochodzenia użytych do oznaczeń składników olejkowych, jak również z wykorzystaniem do badań różnych szczepów bakterii i grzybów. Wydaje się, że najbardziej wiarygodną i nadającą się do porównań metodą badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej różnych substancji, w tym olejkowych, jest metoda rozcieńczeń w podłożu płynnym. Metoda rozcieńczeń w podłożu agarowym jest zatem mniej preferowana do oceny aktywności, ze względu na to, że uzyskiwane wyniki oznaczeń MIC dają praktycznie dziesięciokrotnie niższą wartość w porównaniu z badaniem wykonanym w podłożu płynnym.
Celem badań było porównanie aktywności antybiotycznej różnych składników olejkowych najczęściej występujących w składzie olejków eterycznych, zarówno między sobą, jak również w zależności od zastosowanej metody badawczej.
Materiał i metody
Składniki olejkowe
Badania obejmowały 36 następujących składników olejkowych:
– monoterpeny acykliczne: β-myrcen (Sigma), linalol (Dragoco), geraniol, octan geranylu (Aldrich), cytronelol (Riedel), cytronelal, cytral (Aldrich);
– monoterpeny monocykliczne: p-cymen, limonen, α-terpineol, mentol (Aldrich), 1,8-cyneol (Fluka);
– monoterpeny dicykliczne: α-pinen, β-pinen, borneol (Aldrich), octan bornylu (Dragoco), izoborneol, kamfora (Aldrich), tujon (Roth), fenchon, kamfen (Aldrich);
– seskwiterpeny: farnezol, farnezal (Aldrich), α-bisabolol, β-kariofylen (Roth), chamazulen (Phytolab);
– fenole proste: tymol, karwakrol, eugenol, izoeugenol, safrol, anetol (Aldrich);
– alkoholofenole: α-azaron (Aldrich);
– aldehydofenole: aldehyd cynamonowy, aldehyd salicylowy (Aldrich);
– poliacetyleny: spiroeter (en-in-dicykloeter) (Phytolab).
Drobnoustroje
W badaniach użyto 3 drobnoustroje wzorcowe z następujących kolekcji: Staphylococcus aureus ATCC 6538 P, Escherichia coli PZH 026B6 i Candida albicans PCM 1409 PZH oraz 3 drobnoustroje wyizolowane z materiału klinicznego w Państwowym Szpitalu Klinicznym nr 5 w Poznaniu: Staphylococcus aureus PSK 5, Escherichia coli PSK 5 i Candida albicans PSK 5.
Antybiotyki
W badaniach do celów porównawczych wykorzystano następujące antybiotyki: tetracyklinę i ampicylinę (Polfa-Tarchomin) oraz amfoterycynę B (Squibb-Heyden).
Określanie aktywności antybiotycznej
Badane składniki olejkowe rozpuszczano w DMSO (Serva) w stężeniu 100 mg/ml i przygotowywano z nich rozcieńczenia w podłożach płynnych: Antibiotic Broth (Merck) w przypadku bakterii Staphylococcus aureus i Escherichia coli oraz Sabouraud Broth (Merck) w przypadku grzybów drożdżoidalnych Candida albicans, w stężeniach od 10 do 1000 ?g/ml. Do przygotowanych rozcieńczeń składników olejkowych o objętości 1 ml dodawano po 0,1 ml 18-godz. hodowli badanych szczepów, rozcieńczonych w tych samych podłożach co składniki olejkowe, w stosunku 1:1000 (105-106 komórek w 1 ml). Następnie po 18 godz. inkubacji w temperaturze 37°C określano najmniejsze stężenia hamujące (MIC – Minimal Inhibitory Concentration) badanych składników olejkowych. Jako substancji referencyjnych użyto tetracykliny, ampicyliny (bakterie) i amfoterycyny B (grzyby drożdżoidalne).
Wyniki
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
24 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
59 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
119 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 28 zł
Piśmiennictwo
1. Morris JA, Khettry A, Seitz EW. Antimicrobial activity of aroma chemicals and essential oils. J Am Oil Chem Soc 1979; 56:595-603. 2. Didry N, Dubrenil L, Pinkas M. Activité antibacterienne du thymol, carvacrol et de l'aldehyde cinnamique seuls ou associés. Pharmazie 1993; 48:301-4. 3. Griffin SG, Grant-Wyllie S, Markham JL i wsp. The role of structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity. Flavour Fragr J 1999; 14:322-32. 4. Inouye S, Yamaguchi H, Takizawa T. Screening of the antibacterial effects of variety of essential oils on respiratory tract pathogens, using dilution assay method. J Infect Chemother 2001; 7:251-4. 5. Inouye S, Takizawa T, Yamaguchi H. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact. J Antimicrob Chemother 2001; 47:565-73. 6. Rai M, Mares D (Ed.): Plant derived antimycotics and future prospects. The Haworth Press Inc., New York 2003, 357-66. 7. Kędzia B, Krzyżaniak M, Hołderna E. Działanie olejku krwawnikowego ( Ol. Millefolii) i jego składników na drobnoustroje patogenne dla człowieka. Herba Pol 1990; 36:117-25. 8. Kędzia B, Segiet-Kujawa E, Hołderna E i wsp. Skład chemiczny oraz działanie przeciwdrobnoustrojowe olejku szałwiowego ( Oleum Salviae). Herba Pol 1990; 36:155-64. 9. Kędzia B, Krzyżaniak M, Hołderna E i wsp. Skład i właściwości przeciwdrobnoustrojowe Ol. Melissae i jego składników. Herba Pol 1994; 40:5-11.
