Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

© Borgis - Nowa Pediatria 3/2006, s. 62-65
*Ewa Iżycka-Świeszewska1, Elżbieta Drożyńska2, Robert Rzepko1, Grażyna Kobierska-Gulida1, Iwona Kardaś3, Wiesława Grajkowska4, Anna Balcerska2, Kazimierz Jaśkiewicz1
Gęstość naczyniowa a wybrane cechy kliniczne i patologiczne w guzach typu neuroblastoma*
Vascular density and chosen clinico-pathological features in neuroblastoma
1z Katedry i Zakładu Patomorfologii AM w Gdańsku
Kierownik Zakładu: prof. dr med. Kazimierz Jaśkiewicz
2z Kliniki Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii AM w Gdańsku
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. Anna Balcerska
3z Katedry i Zakładu Biologii i Genetyki AM w Gdańsku
Kierownik Katedry i Zakładu: prof. dr hab. med. Janusz Limon
4z Zakładu Patomorfologii Instytutu-Pomnika Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie
Kierownik Zakładu: dr hab. med. Maciej Pronicki
Streszczenie
The aim of the study was the quantitative assessment of intratumoral angiogenesis in neuroblastoma and to determine its link with chosen clinico-pathological features.
Material and methods. Tissue samples from 70 cases of neuroblastic tumors were evaluated (60 neuroblastoma Schwannian stroma-poor cases and 10 ganglioneuroblastoma). Patho-clinical data included: patient´s age, gender, tumor site and stage, moreover tumor histology, mitosis-karyorrhexis index and MYCN status. On HE slides the tumors were reassessed pathologically and the representative sections with high vessel number were chosen for the immunohistochemical staining with anti-CD34. In hot spots vascular density (VD) was counted semi-automatically with computer analyzer. The associations between data were calculated statistically.
Results. VD in examined group ranged 48-385 vessels/mm3 (median 145). In Schwannian stroma-poor tumors higher VD was associated with younger patient´s age and in untreated tumors it was significantly higher in infants than in children over one year of age.
Conclusions. Our results confirmed high vascularization of neuroblastoma. The angiogenic potential in neuroblastoma Schwannian stroma-poor showed association with the patients´ age.
Wstęp
Nerwiak zarodkowy – neuroblastoma jest najczęstszym pozaczaszkowym nowotworem wieku niemowlęcego i wczesnodziecięcego. Guzy neuroblastyczne stanowią heterogenną grupę embrionalnych guzów części współczulnej układu nerwowego. Główne typy histologiczne zwojaka zarodkowego to neuroblastoma skąpopodścieliskowy, ganglioneuroblastoma (neuroblastoma bogatopodścieliskowy) i dojrzały ganglioneuroma (z przewagą podścieliska) (1-3). Możliwe są trzy drogi przebiegu choroby: progresja i rozsiew, samoistna regresja i inwolucja guza lub stopniowe dojrzewanie nowotworu (4, 5).
Obowiązującym obecnie systemem prognostycznym klasyfikacyjnym dla neuroblastoma jest międzynarodowa klasyfikacja kliniczno-patologiczna (INPC) oparta na systemie Shimady (1-3). Klinicznymi czynnikami rokowniczymi w tej klasyfikacji są: wiek dzieci i stopień zaawansowania klinicznego guza. Wśród biologicznych czynników rokowniczych podstawowym niezależnym wskaźnikiem jest liczba kopii onkogenu NMYC. Powyższe dane umożliwiają podział pacjentów na grupy ryzyka, optymalizację terapii i prognozowanie przebiegu choroby (1, 4, 5). Jednakże większość pacjentów prezentuje postać rozsianą choroby w chwili rozpoznania, a rokowanie u dzieci w wieku powyżej 1 r.ż, z zaawansowanym stadium choroby, pomimo agresywnej terapii jest niepomyślne (4-6). Istnieje zatem konieczność identyfikacji nowych biologicznych czynników prognostycznych i predykcyjnych oraz poszukiwanie nowych form terapii celowanej w neuroblastoma.
Angiogeneza w nowotworach od kilkunastu lat stanowi temat badań morfologicznych i rozważana jest w kontekście prognostyczno-terapeutycznym. Rozwój podścieliska naczyniowego jest niezbędny do wzrostu guza nowotworowego i jego rozsiewu (7, 8). Ogólnie przyjętą i szeroko stosowaną metodą oceny nasilenia angiogenezy jest oznaczanie gęstości naczyniowej w wycinkach z guza z immunohistochemicznie wyznakowanymi naczyniami (8-10). W guzach neuroblastycznych morfologiczne prace nad unaczynieniem są nieliczne, a korelacje histo-kliniczne parametrów naczyniowych niejasne (11-13). Postęp badań i rozwój terapii antyangiogennej i angiostatycznej w onkologii spowodował, że w niektórych nowotworach złośliwych stanowią one obiecującą uzupełniającą metodę leczniczą (9, 10). Wobec niezadawalających dotychczasowych wyników leczenia NB wydaje się, że badania unaczynienia tego guza mogą ocenić szansę na skuteczność leczenia antyangiogennego. W przedstawianej pracy dokonano oceny nasilenia angiogenezy w guzach typu neuroblastoma oraz przeprowadzono statystyczną analizę związków pomiędzy gęstością naczyniową, a wybranymi parametrami histo-klinicznymi.
Materiał i metoda
Badane przypadki neuroblastoma pochodziły z bazy danych, prowadzonej przez jedną z autorek (ED). Przypadki rozpoznane jako ganglioneuroma, jak i przypadki z niewystarczającą ilością materiału tkankowego wykluczono z analizy. Ostatecznie badania przeprowadzono na 60 guzach neuroblastoma typu skąpopodścieliskowego i 10 ganglioneuroblastoma. pochodzących od chorych leczonych w okresie 1996-2005 w Oddziale Chemioterapii Kliniki Pediatrii, Hematologii, Onkologii i Endokrynologii Akademii Medycznej w Gdańsku (47 przypadków) oraz w kilku innych polskich ośrodków onkologicznych (Klinika Onkologii CZD w Warszawie, Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii w Bydgoszczy, Klinika Chorób Dzieci AM w Łodzi, Klinika Transplantacji Szpiku, Hematologii i Onkologii Dziecięcej we Wrocławiu, Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej w Zabrzu, Klinika Chirurgii Dziecięcej Instytutu Matki i Dziecka w Katowicach, Klinika Transplantacji Szpiku, Hematologii i Onkologii Dziecięcej w Poznaniu). Dane kliniczne obejmowały wiek i płeć chorych, lokalizację guza pierwotnego, stadium zaawansowania choroby i rodzaj leczenia przed pobraniem wycinków z guza. Danych dotyczących przebiegu klinicznego choroby nie włączono do badań ze względu na krótką obserwację kliniczną u licznych pacjentów.
Określanie liczby kopii genu MYCN we fragmentach tkanki nowotworowej wykonano w Katedrze i Zakładzie Biologii i Genetyki AMG. Badania cytogenetyczne FISH z użyciem sondy MYCN wykonano w 52 przypadkach. W 16 przypadkach FISH przeprowadzono na komórkach z hodowli tkankowej, a w 36 na preparatach odciskowych z guzów. Liczbę sygnałów ł 10 uznawano za amplifikację.
Wycinki z guzów utrwalane w formalinie, zatapiane w parafinie skrojone na skrawki grubości 4 mm wybarwiano H-E. Rozpoznanie histopatologiczne w każdym przypadku było weryfikowane przez dwóch niezależnych patologów (EIS, WG), według kryteriów zmodyfikowanego systemu Shimady (INPC) (1, 3). W oparciu o utkanie histologiczne, wiek i indeks mitotyczno-karryorhektyczny (MKI) chorych przed chemioterapią podzielono na dwie grupy prognostyczne: o korzystnej i niekorzystnej histologii.
W celu oznaczenia gęstości naczyniowej (g.n.) na reprezentatywnych wycinkach, z najwyższą ilością naczyń i bez rozległej martwicy, przeprowadzono odczyny immunohistochemiczne z przeciwciałem CD34 (DAKO, 1:50) metodą LSAB2 z odpowiednią kontrolą pozytywną i negatywną. Badania ilościowe wykonano przy użyciu systemu do analizy obrazu (mikroskop Olympus BX50, kamera CCD-FS-2012P Bischke, oprogramowanie MultiScan v. 5.10 (CSS). Pod powiększeniem 40x wybierano miejsca o najwyższym unaczynieniu (hot spot), a pod 100x wczytywano obraz 10 pól (jedno pole 0,31 mm2) do pamięci komputera i liczono naczynia wyznakowane immunohistochemicznie. Każda struktura immunododatnia (okrągła, owalna, nieregularna), leżąca osobno od innych profili lub elementów tkankowych, była liczona jako pojedyncze naczynie. W analizie skomplikowanych struktur liczono każde oddzielne światło otoczone chromogenem. Każdy element traktowany jako naczynie zaznaczano manualnie, a komputer zliczał wyniki. Wyniki prezentowano jako liczbę naczyń/mm2. Pomiary wykonano dwukrotnie w ośmiu losowo wybranych przypadkach, w celu określenia powtarzalności metody. Korelacja pomiędzy pierwszym a drugim oznaczeniem g.n. była wysoka (r= 0,902; p<0,002).
Wyniki zebrano w bazie danych i do opracowania statystycznego zastosowano odpowiednio testy Chi2, Kruskall-Wallisa, U Mann-Whitney´a i Spearman´a (Statistica for Windows 5.1) program (StatSoft Inc. Tulsa, Ok, USA). Jako znamienną statystycznie przyjęto wartość p=<0,05.
Wyniki
Dane kliniczne. Pacjenci z rozpoznaniem neuroblastoma skąpopodścieliskowego (NB) to chorzy w wieku od 2 tygodni do 10 lat (mediana 10 miesięcy, średnia 25,6 m).Większość stanowili chłopcy (41) w stosunku do dziewcząt (19). Pacjenci prezentowali następujące kliniczne stadia zaawansowania choroby: I (5), II (5), III (19), IV (25), IVs (6). Guz pierwotny był u większości chorych zlokalizowany w nadnerczach – 36, u 18 w jamie brzusznej pozanadnerczowo i u 6 w śródpiersiu.
Guzy typu NB 39 guzów badano histologicznie przed chemioterapią, a 21 – po chemioterapii wstępnej. Podtypy histologiczne NB obejmowały: 4 guzy o histologii niezróżnicowanej, 35 niskozróżnicowanych i 21 różnicujących się.
Amplifikację genu MYCN stwierdzono w 14/48 badanych przypadkach (29%).
Guzy nieleczone podzielono według klasyfikacji morfologiczno-klinicznej INPC w oparciu o podtyp histologiczny, wartość MKI oraz wiek pacjenta na guzy o „korzystnej” i „niekorzystnej” rokowniczo morfologii. Stwierdzono 22 guzy o budowie „korzystnej” i 17 o budowie „niekorzystnej” rokowniczo. MKI wynosił: poniżej 2% – w 9 przypadkach; 2-4% – w 14 guzach; powyżej 4% – w 16 przypadkach.
Ganglioneuroblastoma (typ mieszany) stwierdzono u 7 dziewczynek i 3 chłopców; w wieku 22 miesięcy-12 lat. Guzy te były zlokalizowane w nadnerczach u 3 chorych, w jamie brzusznej pozanadnerczowo u 4 i w śródpiersiu tylnym u 3 pacjentów. Stadia zaawansowania klinicznego obejmowały 3 przypadki – II i 7 przypadków – III. Amplifikację MYCN stwierdzono w jednym z 4 badanych przypadków. We wszystkich przypadkach MKI wynosił poniżej 2%.
Badania morfologiczne: Stopień unaczynienia guzów był zróżnicowany w obrębie tego samego guza jak i między poszczególnymi przypadkami. Obserwowano pola bogatonaczyniowe w obrębie zrazików tkanki nowotworowej lub zgromadzone w pasmach – elementach tworzącego się podścieliska osłonkowego. W części przypadków stwierdzano niskie unaczynienie. Naczynia krwionośne guzów miały charakter drobnych włośniczek lub naczyń z cechami proliferacji naczyniowej, nawet kłębkowatej z wieloma światłami naczyniowymi.
Gęstość naczyniowa w badanej grupie wynosiła 48 – 385 naczyń/mm2 (mediana 145). W grupie NB gęstość wynosiła 56 – 385 naczyń/mm2 (mediana 149, średnia 166,6, odchylenie standardowe – 89,33). G.n. w grupie ganglioneuroblastoma wynosiła 48 – 248 naczyń/mm2 (mediana 126, średnia 133,2). Średnia wartość g.n. w grupach guzów przed i po wstępnej chemioterapii nie różniła się znamiennie.
Analiza statystyczna ujawniła związek wyższej g.n. z młodszym wiekiem dzieci (r=-0,35; p=0,019). W guzach przed chemioterapią zależność ta była silniejsza (r= -0,47; p=0,003, współczynnik korelacji Spearmana), a średnia g.n. była wyższa u niemowląt (199,2), niż u dzieci powyżej 1 rż. (133,7) (test U-Mann Whitney p=0,02).
Analiza pozostałych związków (gęstość a płeć chorego, stadium zaawansowania, lokalizacja guza, histologia guza, MKI, grupa ryzyka, amplifikacja MYCN) nie ujawniła zależności statystycznie znamiennych.
Dyskusja
Badania w zakresie pato-klinicznych aspektów angiogenezy w guzach neuroblastycznych wnoszą informacje o biologii guza, konieczne do efektywnego wprowadzenia terapii antyangiogennej do kliniki. Przyjmuje się, że w biopsyjnych wycinkach z guza miernikiem nasilenia angiogenezy jest gęstość naczyniowa, będąca liczbą naczyń w polach guza o najwyższym unaczynieniu (8, 10). Liczne doniesienia na materiale różnych guzów złośliwych dowodzą związków między wysoką gęstością a gorszą prognozą, ale w części guzów relacje te są odwrotne (7-9). Proces angiogenezy podlega regulacji przez kompleks czynników stymulujących i blokujących oraz ma ścisłe związki z procesem tworzenia podścieliska nowotworowego (14-16). Prognostyczna rola gęstości naczyniowej w NB nie została ostatecznie wyjaśniona (11-13).
Zakres i zmienność wartości g.n. w analizowanej przez nas grupie była wysoka, zbliżona do wielu złośliwych nowotworów uznawanych za bogatounaczynione (18-20). Wysokie unaczynienie warunkuje podatność na terapię antyangiogenną. Porównanie wyników własnych z innymi pracami dotyczącymi NB jest trudne, a nawet niemożliwe ze względu na odmienną metodykę oznaczania naczyń, inne grupy chorych, jak i sposób prezentacji wyników (11-13). Najczęściej cytowana praca Meitar i wsp. (11) podaje korelację wysokiego indeksu naczyniowego (powyżej 4 naczyń/mm3) z rozsianą chorobą, gorszym przeżyciem i amplifikacją MYCN. W pracy Meitar i wsp. naczynia liczono manualnie na preparatach HE na całych wycinkach z 50 guzów o różnej histologii. Canete i wsp. (12) badali kilka parametrów naczyniowych całkiem automatycznie analizatorem obrazu, na skrawkach barwionych CD34. Autorzy uzyskali bardzo wysokie wartości g.n., nie znajdując korelacji parametrów naczyniowych z żadnymi czynnikami prognostycznymi. Ribatti i wsp. (13) na małej i heterogennej histologicznie grupie 20 NB barwionych F VIII, zastosował skomplikowane kryteria i metody liczenia naczyń i odnotował wyższą g.n. w zaawansowanych guzach, zwłaszcza IVs.
Nasza analiza ujawniła statystycznie znamienne związki między g.n. i wiekiem chorych. W podgrupie guzów nieleczonych związek wyższej g.n. i młodszego wieku był silny, a różnica średniej gęstości u niemowląt była znamiennie wyższa, niż u dzieci powyżej 1. r.ż. Spośród innych guzów rozpoznawanych w wieku dziecięcym podobną relację stwierdzono w PNET, a u dorosłych m.in. w glejaku wielopostaciowym i raku sutka (17, 18). Grupa Ribattiego stwierdziła najwyższe unaczynienie w guzach IVs, które występują u niemowląt (13). Wydaje się, że potencjał angiogenny w guzach rozwijających się poniżej 1 roku życia nie ma związku z prognozą choroby. Jak wiadomo leczenie niemowląt z neuroblastoma w większości kończy się najczęściej pomyślnie. Być może wysokie unaczynienie NB u niemowląt prezentuje typ unaczynienia płodowego występującego fizjologicznie w rozwoju struktur autonomicznego układu nerwowego, z których NB się wywodzi (2, 12). Dobra odpowiedź na leczenie może również zależeć od lepszej penetracji tkankowej czynników wzrostowych i chemioterapeutyków dzięki bogatej sieci naczyń w guzach niemowlęcych.
Gęstość naczyniowa, która jest najszerzej stosowanym miernikiem nasilenia angiogenezy ma swoje ograniczenia. G.n. daje jedynie ilościową informację o obecności naczyń, bez wglądu na ich funkcjonalne i morfologiczne właściwości (9, 18). W niektórych nowotworach kryterium diagnostycznym, a nawet prognostycznym stała się specyficzna morfologia naczyń (9, 18). Dla pełniejszej oceny potencjału angiogennego nowotworów stosuje się również oznaczanie poziomu czynników angiogennych w surowicy chorych (19, 20). W kilku innych opracowaniach amp MYCN korelowała z wyższym nasileniem angiogenezy mierzonej poprzez g.n. i ekspresję czynników angiogennych (11, 16, 19). MYCN stymuluje czynniki angiogenne pośrednio, głównie poprzez hamowanie inhibitorów wzrostu komórek śródbłonka (19).
Wstępne wyniki terapii antyangiogennej w neuroblastoma są obiecujące (10, 16), a gęstość naczyniowa może służyć jako czynnik predykcyjny dla tego typu terapii. Problemem do rozwiązania jest określenie miejsca i roli takiego leczenia – jako terapii uzupełniającej w obecnie stosowanych protokołach (10, 15).
Wnioski
Nasza analiza ujawniła wysoki potencjał angiogenny guzów NB, mierzony poprzez gęstość naczyniową. Gęstość naczyniowa wykazywała duże zróżnicowanie w badanych grupach nowotworów.
Stwierdzono związek wyższej gęstości naczyniowej z młodszym wiekiem chorych dzieci.
Podjęcie długofalowych dalszych obserwacji chorych jest istotne dla określenia wartości prognostycznej i predykcyjnej gęstości naczyń w neuroblastoma.
Podziękowania
Autorzy opracowania dziękują następującym ośrodkom onkologii dziecięcej za udostępnienie materiału do analizy: Klinice Onkologii CZD w Warszawie – kierownik prof. dr hab. med. Danuta Perek; Klinice Pediatrii, Hematologii i Onkologii w Bydgoszczy – kierownik prof. dr hab. med. Mariusz Wysocki; Klinice Chorób Dzieci AM w Łodzi – kierownik prof. dr hab. med. Jerzy Bodalski; Klinice Transplantacji Szpiku, Hematologii i Onkologii Dziecięcej we Wrocławiu – kierownik prof. dr hab. med. Alicja Chybicka; Klinice Hematologii i Onkologii Dziecięcej w Zabrzu – kierownik prof. dr hab. Danuta Sońta-Jakimczyk; II Klinice Chirurgii Dziecięcej Instytutu Matki i Dziecka w Katowicach – kierownik prof. dr hab. Jerzy Bohosiewicz; Klinice Transplantacji Szpiku, Hematologii i Onkologii Dziecięcej w Poznaniu – kierownik prof. dr hab. Jacek Wachowiak oraz prof. dr hab. Januszowi Limonowi za możliwość przeprowadzania analizy MYCN w Katedrze i Zakładzie Biologii i Genetyki Akademii Medycznej w Gdańsku.

*Praca jest finansowana z grantu badawczego KBN nr 6PO5E-091-21 i grantu W-951AMG
Piśmiennictwo
1. Schwab M., et al.: Neuroblastic tumours of adrenal and sympathetic nervous system. In: Chapter 9 Peripheral neuroblastic tumours. In: Pathology and Genetics of tumours of the Nervous system (Kleihues P and Cavenee WK, eds). Lyon, IARC Press, 2000, pp 153-161.2. Klepacka T., i wsp.: Neuroblastoma-epidemiologia, diagnostyka patomorfologiczna i molekularna, prognoza. Przegl. Lek. 2003, 60: 22-6.3. Shimada H., et al.: The International Neuroblastoma Pathology Classification (The Shimada System). Cancer 1999, 86 (2): 364-72.4. Bown N.: Neuroblastoma tumour genetics: clinical and biological aspects. J. Clin. Pathol., 2001, 54: 897-910.5. Brodeur G.M.: Neuroblastoma – biological insights into a clinical enigma. Nat. Rev. Cancer, 2003, 3(3): 203-16.6. Schmidt M., et al.: Biologic factors determine prognosis in infants with stage IV neuroblastoma: a prospective children´s cancer group study. J. Clin. Oncol., 2000, 18: 1260-68.7. Carmeliet P., Jain R.: Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000, 407: 249-57.8. Weidner N.: Angiogenesis as a predictor of clinical outcome in cancer patients. Hum. Pathol., 2000, 31(4): 403-5.9. Sharma S., et al.: Morphology of angiogenesis in human cancer: a conceptual overview, histoprognostic perspective and significance of neoangiogenesis. Histopathology 2005, 46: 481-9.10. Ribatti D.: (2002). Angiogenesis and anti-angiogenesis in neuroblastoma. Eur. J. Cancer, 38: 750-7.11. Meitar D., et al.: Tumor angiogenesis correlates with metastatic disease, N-myc amplification and poor outcome in human neuroblastoma. J. Clin. Oncol., 1996, 14: 405-14.12. Canete A., et al.: Angiogenesis in neuroblastoma. Relationship to survival and other prognostic factors in a cohort of neuroblastoma patients. J. Clin. Oncol., 2000, 18: 27-34.13. Ribatti D., et al.: Angiogenesis extent and expression of matrix metalloproteinase-2 and –9 correlate with progression in human neuroblastoma. Life Sci 2001, 68(10): 1161-8.14. Hanahan D., Weinberg R.: The hallmarks of cancer. Cell 2000,100: 57-70.15. Chlenski A., et al.: The regulation of angiogenesis in neuroblastoma. Cancer Lett 2003, 197: 47-52.16. Eggert A., et al.: High-level expression of angiogenic factors is associated with advanced tumor stage in human neuroblastoma. Clin. Cancer Res., 2000, 6: 1900-8.17. Grotzer M., et al.: High microvessel density in primitive neuroectodermal brain tumors of childhood. Neuropediatrics 2001, 32: 75-9.18. Izycka-Swieszewska E., et al.: Angiogenesis in glioblastoma-analysis of intensity and relation to chosen clinical data. Folia Neuropathologica 2003,41(1): 15-21.19. Hatzi E., et al.: MYCN oncogene and angiogenesis: down-regulation of endothelial growth inhibitors in human neuroblastoma cells. Purification, structural, and functional charcterization. Adv. Exp. Med. Biol., 2000, 476: 239-48.20. Drożyńska E., et al.: Serum concentrations of angiogenic cytokines in neuroblastoma patients. Pol. J. Envir. Stud., 2005, Suppl 2, 508-513.
otrzymano: 2006-06-02
zaakceptowano do druku: 2006-09-05

Adres do korespondencji:
*Ewa Iżycka-Świeszewska
Katedra i Zakład Patomorfologii AMG
ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk
tel: (0-58) 349-21-72
e-mail: eczis@wp.pl

Nowa Pediatria 3/2006
Strona internetowa czasopisma Nowa Pediatria