Bioaktywny izoflawon genisteina - perspektywy zastosowań medycznych

Genisteina jest związkiem naturalnym pochodzenia roślinnego, wyodrębnionym po raz pierwszy z Genista tinctoria L. (janowiec barwierski) ponad sto lat temu. Pod względem strukturalnym należy do klasy flawonoidów - licznej grupy metabolitów wtórnych wywodzących się z fenyloalaniny, których biogeneza funkcjonuje w normalnych warunkach fizjologicznych (np. synteza barwników występujących w kwiatach), ale może też być częścią odpowiedzi na stres środowiskowy (np. wytwarzanie fitoaleksyn) (6, 9). Pod względem chemicznym jest to trójhydroksylowa pochodna 3-fenylochromen-4-onu. Podstawowe typy strukturalne (szkieletów węglowych, bez uwzględnienia typów podstawienia) flawonoidów przedstawiono na rycinie 1. Szczegółową informację o kilku tysiącach indywidualnych przedstawicieli tej grupy zawiera aktualna monografia (5). Typowo medyczne zainteresowania flawonoidami mają długą historię. A. Szent-Gyorgyi zaobserwował w 1927 roku (3), że efekt przeciwszkorbutowy odpowiednich dawek soku cytrynowego lub papryki jest znamiennie wyższy niż działanie czystego kwasu askorbinowego (witamina C), co przypisano następnie obecności flawonoidów w badanych produktach roślinnych. Wyniki te zapoczątkowały funkcjonowanie pojęcia "witamina P" w odniesieniu do zespołu flawonoidów lub konkretnych związków (rutyna, hesperydyna). Obecnie flawonoidy są stosowane m.in. także w przewlekłej niewydolności żylnej (trokserutyna, diosmina, hesperydyna) oraz w niewydolności wątroby (sylimaryna).

Genisteina zajmuje w tej grupie pozycję pod wieloma względami wyjątkową. Po pierwsze, jest obiektem intensywnych badań jako ligand zdefiniowanych biomakromolekuł spełniających ważne funkcje fizjologiczne (receptory estrogenów, kinazy tyrozynowe, topoizomerazy). W efekcie w czasopismach naukowych o profilu przyrodniczym i medycznym ukazuje się corocznie kilkaset artykułów dotyczących różnych aspektów aktywności biologicznej tego związku. Po drugie, znaczna część tych badań weszła w fazę zastosowań medycznych. Pojawiły się już produkty rynkowe o charakterze dodatków do żywności, a zaawansowane są także badania o charakterze przedklinicznym i klinicznym, zmierzające w kierunku nowych leków. Po trzecie, kilka zespołów w Polsce osiągnęło w tej dziedzinie znaczące wyniki. Można tu wymienić badania strukturalne i teoretyczne prowadzone przez prof. A.P. Mazurka (Instytut Leków, Warszawa), badania immunosupresji przez doc. dr. P. Fiedora (AM Warszawa), inicjacji apoptozy i hamowania angiogenezy w komórkach nowotworowych przez prof. Cz. Radzikowskiego (IITD PAN, Wrocław) i badania wpływu genisteiny na regulację metabolizmu przez prof. L. Nogowskiego (Akademia Rolnicza, Poznań). Sytuacja ta skłania nas do zaprezentowania krótkiego i wybiórczego przeglądu wyników dotychczasowych badań nad genisteiną oraz perspektywy jej zastosowań w ochronie zdrowia. Szerszą i bardziej szczegółową dyskusję biochemicznych i farmakologicznych aspektów aktywności genisteiny przedstawili Polkowski i Mazurek (12).

Jednym z czynników, który zadecydował o wyjątkowym zainteresowaniu genisteiną były wyniki badań dotyczące epidemiologii nowotworów. Wykazały one istnienie związku przyczynowego (korelacja negatywna) pomiędzy spożywaniem znacznych ilości produktów sojowych a zachorowalnością na nowotwory sutka i prostaty oraz śmiertelnością z powodu tych nowotworów. W następstwie tych ustaleń badano poziom genisteiny, która jest głównym flawonowym składnikiem soi (występującym głównie jako glukozyd - genistyna oraz jej estry) w płynach ustrojowych różnych grup kontrolnych i stwierdzono, że w populacjach azjatyckich obserwuje się wielokrotnie wyższe stężenie (od 7 do 110 razy w osoczu i ok. 30 razy w moczu) niż wśród mieszkańców krajów zachodnich. W modelach zwierzęcych stwierdzono hamujący wpływ diety sojowej na proces kancerogenezy indukowany czynnikami chemicznymi lub promieniowaniem. Usunięcie flawonoidów z pokarmu doświadczalnego całkowicie niwelowało ten efekt, wobec czego uznano te związki, oraz jej głównego pod względem zawartości przedstawiciela: genisteinę, za czynnik sprawczy obserwowanych efektów biologicznych. Przedmiotem badań stały się produkty sojowe o różnym stopniu przetworzenia, nader często bez adekwatnej specyfikacji analitycznej. Obecnie przyjmuje się, że całkowita zawartość izoflawonów w surowcach sojowych wynosi 0,1-0,3%. Za główne składniki flawonowe nasion Glycine max Merrill (fasola sojowa) uznane są b-D-glukozydy: genistyna, daidzyna i glicytyna, a odpowiadające im aglikony (genisteina, daidzeina i glicyteina) są praktycznie nieobecne w surowcu (ok. 100 razy mniej niż glikozydów) i pojawiają się w znaczących ilościach dopiero w trakcie technologicznego przetwarzania, pod wpływem obróbki termicznej lub podczas fermentacji (ryc. 2). Nowsze i bardziej wnikliwe badania wskazują bezspornie, że stopień złożoności frakcji izoflawonowych z soi jest jeszcze większy. Wśród aglikonów znaleziono dodatkowo formometynę i biochaninę A, co zaś tyczy glikozydów, to stwierdzono, że podstawowymi formami biogennymi są ich estry z kwasem malonowym, a także octowym. Jest oczywiste, że biodostępność, farmakokinetyka i metabolizm tych związków mogą się znacznie różnić, co skłania do daleko posuniętej ostrożności w interpretacji wyników badań biologicznych uzyskanych przy zastosowaniu produktu pochodzenia naturalnego o wątpliwej specyfikacji. Problem ten nie istnieje praktycznie w badaniach sensu stricte biochemicznych, w których używa się indywidualnej substancji chemicznej o znanym stopniu czystości.

Współczesny opis efektu biologicznego związku o potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych wymaga zdefiniowania jego działania w kategoriach molekularnych. Obserwowany w doświadczeniach z zakresu tradycyjnej farmakologii efekt biologiczny dostarcza często wystarczających wskazówek do poszukiwania biomolekularnego obiektu oddziaływań (receptora, enzymu etc.). W przypadku genisteiny, jej aktywność estrogenowa jest znana od wczesnych lat trzydziestych, co wyraźnie rzutuje także na kierunki współczesnych badań. Wiadomo, że genisteina wykazuje dość słabe powinowactwo do receptora estrogenowego, ale może konkurować z jego naturalnym substratem - estradiolem, a co więcej odpowiedni kompleks wywołuje też docelowy efekt hormonalny. Oprócz genisteiny aktywność taką stwierdzono w przypadku wielu innych związków pochodzenia roślinnego, grupowo nazwanych (w odróżnieniu od hormonów sterydowych) fitoestrogenami. Jednakże znaczenie tego faktu dla interpretacji wyników otrzymanych na modelach nowotworów hormono- zależnych nie jest jasne. Generalnie przyjmuje się, że estrogeny mogą promować kancerogenezę, szczególnie nowotworu sutka. Przeciwnowotworowe działanie genisteiny w rakach prostaty i sutka udowodnione w eksperymentach na liniach komórkowych i zwierzętach wskazuje wyraźnie, że wnioskowanie w oparciu o jednokierunkowy model działania biologicznego tego związku nie wystarcza do opisu obserwowanych zjawisk. W badaniach na liniach komórkowych wykazano efekt genisteiny (antyproliferacyjny) zarówno w stosunku do komórek estrogenozależnych, jak i niezależnych, przy czym efekt przeciwnowotworowy osiągany był przez zatrzymanie cyklu komórkowego w stadium G₂ - M, indukcji i ekspresji p21 oraz w wyniku apoptozy (13). W 1987 roku stwierdzono, że genisteina jest inhibitorem proteinowych kinaz tyrozynowych (PTK), co spowodowało lawinowy wzrost liczby publikacji na ten temat (4). Kinazy tyrozynowe mogą być zlokalizowane w błonie komórkowej i wiązać aktywujący ligand (np. czynniki wzrostu: EGF - czynniki wzrostu naskórka, FGF - czynnik wzrostu fibroblastów, PDGF - czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi) za pomocą zewnątrzkomórkowej domeny receptorowej, ale znane są także enzymy o tej funkcji działające wyłącznie w cytozolu. Enzymy PTK pełnią niezwykle ważne role w funkcjonowaniu komórki, uczestnicząc w wytwarzaniu, modulacji i przekazywaniu sygnałów chemicznych, przenoszonych od receptora do jądra komórkowego i wywołujących ekspresję genów (8). Znaczna część kinaz tyrozynowych jest kodowana przez onkogeny, stwierdzono także nadmierną ekspresję PTK w wielu różnych rodzajach nowotworów, skąd wynika powszechne przekonanie, że specyficzne hamowanie aktywności tych enzymów może mieć ogromne znaczenie terapeutyczne (4). Wydaje się, że mechanizm molekularny odpowiedzialny za hamującą rolę genisteiny wobec PTK jest dostatecznie wyjaśniony. Z danych kinetycznych wynika, że genisteina konkuruje o miejsce aktywne z jednym z substratów enzymu, a mianowicie z 5´-trifosforanem adenozyny (ATP). W grupie enzymów PTK miejsce wiązania ATP odznacza się wysoką homologią, lecz efektywność hamująca genisteiny różni się znacznie w poszczególnych przypadkach. Co ciekawe, genisteina nie wywiera wpływu na kinazy białkowe, których substratami są reszty aminokwasów hydroksylowanych: treoniny i seryny. Natomiast motyw konkurencji z ATP o miejsce aktywne enzymu pojawia się jeszcze w innych obserwacjach dotyczących aktywności biologicznej genisteiny - stwierdzono mianowicie, że jest ona inhibitorem działania topoizomerazy II, chociaż nie charakteryzuje się zdolnością do interkalacji DNA, jak to ma miejsce w przypadku typowych inhibitorów tej grupy enzymów, np. antracyklin. Ten sposób oddziaływania na enzymy odpowiedzialne za replikację materiału genetycznego może odgrywać pewną rolę w inicjowaniu przez genisteinę apoptozy. W wielu pracach dotyczących przeciwnowotworowej aktywności genisteiny podkreśla się także silne działanie przeciwutleniające izoflawonów, a więc zdolność do usuwania na poziomie komórkowym reaktywnych i toksycznych form tlenu powstających w wyniku biotransformacji (1).

Niewątpliwie genisteina charakteryzuje się powinowactwem do różnych biopolimerów i zdolnością modulowania wielu jednostkowych procesów biochemicznych, które składają się na kaskady i szlaki metaboliczne o decydującym znaczeniu dla utrzymania homeostazy organizmu. Chociaż nasza obecna wiedza o szczegółach tych oddziaływań jest ciągle bardzo fragmentaryczna, w wyniku prowadzonych badań ugruntowało się przekonanie o ogólnie korzystnym wpływie flawonoidów, a genisteiny w szczególności, na zdrowie ludzkie. Istotnym elementem tego przekonania jest poczucie bezpieczeństwa, wynikające z faktu, że znaczący udział flawonoidów (współcześnie, do ok. 1 g dziennie, jako suma różnych składników) pośród składników naszej diety liczy się na tysiąclecia.

Próby racjonalnego wykorzystania właściwości genisteiny w szeroko pojętej ochronie zdrowia odbywają się na trzech płaszczyznach charakteryzujących się różnym stopniem formalizacji działań. Są to: 1) komercjalizacja produktów zawierających genisteinę, w kategorii kwalifikowanych dodatków do żywności oraz substancji uzupełniających normalną dietę (nutraceutyki) (11), których jakość i dystrybucja nie podlegają kontroli agencji rządowych sprawujących nadzór nad obrotem lekami; 2) programy zmierzające do zastosowania genisteiny w nowej strategii - chemoprewencji nowotworów; 3) badania kliniczne w kierunku leków ze wskazaniem w nowotworach prostaty i sutka.

Projekty aplikacyjne, zmierzające do nowych produktów na bazie genisteiny, nawet o zasięgu lokalnym, jak to ma miejsce w przypadku instytucji autorów tego artykułu, powinny więc uwzględniać następujące fakty:

Ad. 1) Produkty zaliczane do pierwszej z wymienionych kategorii osiągnęły już, przynajmniej w USA (49% udziału w światowej produkcji soi), znaczącą pozycję rynkową, a dynamika wzrostu sprzedaży osiąga 30% rocznie. W informacji dla klientów podkreśla się ich aktywność przeciwnowotworową, korzystne działanie na układ krążenia i układ kostny, zdolność ograniczania symptomów menopauzy. Poniżej podajemy przykładowe deklaracje producenta, dotyczące zawartości izoflawonów (w składzie preparatu zwykle wyspecyfikowane są ponadto: proteiny, kwasy tłuszczowe, węglowodany i włóknik).

GeniSoy (GeniSoy Co. Fairfield, CA), koktajl, 90 mg izoflawonów na porcję Your Life(r) Soy Isoflavones (Leiner Health Products, Carson, CA) kaps., 50 mg koncentratu.

Isoflavones (Solgar, Leonia N.J.), tabl.,: genisteina 5,5 mg; daidzeina 18 mg; glicyteina 12,5 mg (razem 36 mg izoflawonów).

Genistein (Source Naturals, Scotts Valley, CA) tabl., genisteina 7 mg; daidzeina 22 mg; glicyteina 32 mg (razem 61 mg izoflawonów).

Specyfikacje tej kategorii produktów pozostawiają wiele do życzenia. Na przykład sprzedawany w Polsce proszek GeniSoy zawiera według ulotki 19,53 mg kompleksu daidzeiny, 29,29 mg kompleksu genisteiny oraz 3,40 mg kompleksu glyceiteiny w jednej porcji (35 g). Dokładność do jednej setnej części miligrama robi dość groteskowe wrażenie zważywszy, że zupełnie nie wiadomo, co to jest "kompleks genisteiny" - pojęcie takie nie istnieje w znanej nam literaturze. Wydaje się, że te wymienione produkty mają wspólne źródła surowcowe, którymi są koncentraty izoflawonowe oferowane przez niektóre firmy przetwarzające surowce sojowe (np. Novasoy^TM, produkowanych przez ADM Corporation, zawiera 40% izoflawonów, podobnie jak koncentrat wytwarzany przez Protein Technologies International, St. Louis, MO).

Niezależnie od potencjalnych i rzeczywistych efektów prewencyjnych i medycznych, funkcjonowanie tego rodzaju produktów na rynku dobrze służy edukacji medycznej społeczeństw i propagowaniu postaw prozdrowotnych. Wytwarza się sprzężenie zwrotne, w wyniku którego materiały informacyjne i marketingowe osiągają z konieczności wywołanej konkurencją, ruchem konsumenckim i postępującymi regulacjami prawnymi, poziom przyzwoitej popularyzacji naukowej.

Ad. 2) Pomimo ogromnych postępów w dziedzinie biologii i biochemii nowotworów, osiągnięcia w terapii tej grupy chorób pozostają daleko w tyle zarówno w stosunku do niedawnych prognoz, jak i aktualnych oczekiwań. Mimo stosowania najlepszych procedur chirurgii, radioterapii i chemioterapii, śmiertelność z powodu nowotworów stale rośnie, wobec czego współczesne programy ochrony zdrowia coraz bardziej akcentują wagę diagnostyki i prewencji. Szczególnie interesująca jest nowa strategia walki z chorobami nowotworowymi polegająca na zapobieganiu indukcji lub odwracaniu wczesnych etapów kancerogenezy (8). Chemoprewencja nowotworów stanowi obecnie dojrzałą koncepcję, w ramach której określono dość precyzyjnie metodykę badań oraz wytypowano wiele obiektów o udowodnionym lub domniemanym działaniu antykancerogennym (2). Należy tu zaznaczyć, że wymagania dla czynnika chemoprewencyjnego nowotworów są zupełnie inne niż w przypadku leku przeciwnowotworowego. Podczas gdy te ostatnie są, mówiąc obrazowo, truciznami charakteryzującymi się wystarczającą selektywnością do likwidacji szybko namnażających się komórek, lecz niestety także toksycznością systemiczną, środek chemoprewencyjny przeznaczony jest do stałego podawania ludziom zdrowym, a więc musi być zupełnie bezpieczny, a także tani. Warunki te jak się wydaje faworyzują związki pochodzenia naturalnego o udokumentowanej historii zastosowań w żywieniu człowieka. Wspólny program agencji amerykańskich (National Cancer Institute [NCI], oraz NCI Division of Cancer Prevention and Control, NCI Chemoprevention Branch, i NCI Agent Development Committee, w uzgodnieniu z Food and Drug Administration) zmierzający do nowych leków, skutecznych w chemoprewencji nowotworów, zawiera plany badań klinicznych dla 32 specyfików, wśród których znalazła się także genisteina (7).

Ad. 3) Niezależnie od potencjalnej zdolności genisteiny do odwracania lub likwidowania skutków wczesnych etapów kancerogenezy, w wielu różnorodnych doświadczeniach dowiedziono jej aktywności przeciwnowotworowej zarówno in vitro jak i in vivo. Dotyczy to szczególnie nowotworów hormonozależnych, choć aktywność ta może się realizować bez angażowania receptorów estrogenowych. Jako zasadnicze hipotezy mechanistyczne rozpatrywane są: hamowanie transdukcji sygnałów przekazywanych za pośrednictwem proteinowych kinaz tyrozynowych, hamowanie aktywności topoizomerazy II, indukowanie apoptozy oraz hamowanie angiogenezy. Aktualnie prowadzone są w USA, pod auspicjami NIH (Narodowy Instytut Zdrowia, Bethesda, MD, Nr. Protokółu: 98-C-099) badania kliniczne I-szej fazy, zmierzające do zbadania farmakokinetyki przy pojedynczym podaniu, na trzech poziomach dawki. Podawane są preparaty o zawartości genisteiny 43% i 90%. Niewątpliwie potencjalne zastosowania medyczne genisteiny nie ograniczają się do sformułowanych obecnie wskazań (rak prostaty i sutka). Przykładem nowych możliwości są obserwacje zespołu prof. Radzikowskiego (4), z których wynika, że skojarzenie genisteiny z lekami przeciwnowotworowymi (np. cyklofosfamid, doksorubicyna) pozwala na osiągnięcie efektu terapeutycznego przy użyciu znacznie niższych dawek tych ostatnich. Wykorzystywanie tego efektu daje szansę na ograniczenie działań ubocznych charakterystycznych dla większości preparatów stosowanych w onkologii. Należy zaznaczyć, że mimo zaawansowania badań o charakterze medycznym, status genisteiny jako kandydata na lek, nie jest bynajmniej jednoznaczny. Wynika to z wielu czynników, z których część, jak staramy się wykazać, ma charakter raczej organizacyjny niż naukowy. Wielokierunkowa aktywność biologiczna genisteiny, przy fragmentarycznej ciągle znajomości podstaw molekularnych jej działania, koliduje z postulatem selektywności jako podstawą farmakodynamicznej charakterystyki leku. Zakres stężeń tego związku, w jakim obserwuje się efekty biologiczne w modelach doświadczalnych, jest często znacznie wyższy od wartości uzyskiwanych u ludzi w wyniku stosowania diety bogatej w produkty sojowe. Skład frakcji izoflawonowych w soi i jej przetworach jest trudny do wyspecyfikowania, wiadomo jednak, że obecność genisteiny (podobnie jak innych aglikonów) jest raczej artefaktem niż cechą pierwotną. Koniugaty cukrowe (glikozydy i ich estry) genisteiny i pokrewnych izoflawonów, zawarte w produktach sojowych, stanowią substancje bardzo słabo poznane zarówno pod względem fizykochemicznym jak i farmakologicznym. Jeżeli uznamy genisteinę za docelową substancję aktywną to jej naturalne biokoniugaty możemy potraktować jako proleki. Nie ulega jednak wątpliwości, że związki te różnią się od genisteiny biodostępnością, metabolizmem i powinowactwem do poszczególnych funkcjonalnych biopolimerów, czyli zarówno charakterystyką farmakokinetyczną, jak i farmakodynamiczną. Niewątpliwie część różnic i niespójności ujawniających się pomiędzy badaniami biochemicznymi i medycznymi wynika z prostego faktu, że obiektem tych pierwszych jest czysta genisteina, podczas gdy w drugim przypadku używa się materiałów pochodzenia roślinnego o różnym składzie. Postępowanie takie uwarunkowane jest jak się wydaje brakiem dostępności substancji: eksperyment biochemiczny można przeprowadzić na miligramowych ilościach, podczas gdy badania o charakterze przedklinicznym i klinicznym wymagają dziesiątków kilogramów. Sądząc z cen podanych w katalogach firm odczynnikowych (w przeliczeniu z oferowanych ilości - ponad milion dolarów za kilogram) czysta genisteina nie jest wytwarzana na skalę techniczną. W przekonaniu, że dalszy rozwój produktów zawierających genisteinę przeznaczonych do szeroko pojętej ochrony zdrowia, wymaga dostępności substancji o czystości farmaceutycznej, podjęliśmy prace nad syntezą chemiczną tego związku. W wyniku badań prowadzonych w Instytucie Farmaceutycznym w ramach projektu celowego Komitetu Badań Naukowych, opracowano prosty technicznie i ekonomiczny proces syntezy, realizowany obecnie w skali półtechnicznej. Znaczna aktywność polskich zespołów naukowych różnych specjalności, które zajmują się badaniami nad genisteiną, pozwala mieć nadzieję na wykorzystanie szansy jaką obecnie stwarza dostępność tej substancji, na szybki rozwój projektów o charakterze aplikacyjnym. W konkluzji, pragniemy podkreślić szczególne zależności, jakie łączą różne etapy badań aktywności biologicznej związków chemicznych dla celów leczniczych. Niewątpliwie bogactwo strukturalne i funkcjonalne produktów naturalnych dostarcza tu nieustającej inspiracji, pomimo konkurencji nowych systemów poszukiwania struktur farmakoforowych, takich jak synteza komibnatoryczna. Coraz częściej jednak interwencja syntezy chemicznej okazuje się niezbędna także w dziedzinie związków naturalnych, zarówno dla zapewnienia odpowiednich ilości materiału do badań, jak i dla racjonalnych modyfikacji struktury prototypowej, do otrzymania wzorców analitycznych, metabolitów itp. Przykład genisteiny wydaje się być modelową ilustracją tej tezy.