Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 5/2008, s. 291-296
Barbara Górka, Joanna Skubis-Zegadło, *Barbara Czarnocka
Ekspresja NrCAM w rakach brodawkowatych tarczycy
NrCAM expression in papillary thyroid carcinomas
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Andrzej Gardas
Streszczenie
Wstęp: Białko adhezyjne NrCAM z rodziny immunoglobulinopodobnych białek adhezyjnych występujące głównie w układzie nerwowowym, jak wykazano ulega również ekspresji w innych tkankach, w tym w nowotworach. Białka adhezyjne odgrywają ważną rolę w takich procesach jak wzrost i różnicowanie komórek. Zmiany w adhezji międzykomórkowej mogą być związane ze wzrostem inwazyjności komórek nowotworowych. W związku z tym, że cząsteczka NrCAM jest coraz częściej łączona z procesami nowotworzenia w niniejszej pracy badano ekspresję NrCAM w raku brodawkowatym tarczycy, najczęściej występującym raku tarczycy.
Materiał i metody: Analizie poddano grupę 46 brodawkowatych raków tarczycy i odpowiadających im tkanek prawidłowych. Badano poziom mRNA NrCAM metodą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (Q-RT-PCR), oraz poziom i lokalizację komórkową białka NrCAM stosując metody immunologiczne: immunohistochemię (IHC) i Western blot.
Wyniki: Wykazano, że ekspresja mRNA NrCAM w rakach jest znamiennie statystycznie wyższa niż w prawidłowych tarczycach (p<0,0001). W badaniu IHC ponad 95% (44/46) przypadków raka brodawkowatego tarczycy dawało pozytywny wynik barwienia NrCAM. Białko było głównie zlokalizowane cytoplazmatycznie, a w niektórych przypadkach widoczne było znakowanie błonowe. W tkankach prawidłowych obserwowano reakcję tylko w pojedynczych pęcherzykach wykazujących cechy nadczynności. Analiza Western blot potwierdziła wyniki otrzymane metodą Q-RT-PCR i wykazała, że ekspresja białka NrCAM w rakach brodawkowatych jest wyższa niż w odpowiadających im tkankach prawidłowych. Poziom ekspresji genu i białka NrCAM w raku brodawkowatym tarczycy nie był związany z klinicznym zaawansowaniem guza.
Wnioski: Uzyskane wyniki wykazały po raz pierwszy, że w rakach brodawkowatych tarczycy jest indukcja genu i białka neuronalnej czasteczki adhezyjnej NrCAM. Wysoki poziom transkryptu i jego białka nie korelował ze stopniem zaawansowania raków i ich wielkością.
Nasze wyniki sugerują, że nadekspresja NrCAM może być związana z patogenezą raków brodawkowatych tarczycy.
Summary
Introduction: Neuronal cell adhesion molecule NrCAM is mostly expressed in the nervous system and as recently described is also expressed in a variety of tissues, including tumours. Cell adhesion molecules plays an important role during basal cells processes like the cell growth and differentiation. Changes in the integrity of the adhesion are involved in tumours development and may lead to invasive and metastatic behavior of these cells. NrCAM expression has been linked to tumorigenesis of some tissues, therefore in this study we examined NrCAM expression in the most common type of thyroid cancer, papillary thyroid carcinoma.
Materials and methods: We analysed 46 of papillary thyroid carcinomas and paired normal tissues. NrCAM expression was analysed on both mRNA (Q-RT-PCR) and protein level and cellular localization using immunohistochemistry (IHC) an Western blot methods.
Results: Expression of NrCAM transcript was significantly higher in tumours, than in normal thyroid (p<0,0001). Immunohistochemistry showed that over 95% of papillary thyroid carcinomas (44/46) were positive for NrCAM expression. The protein localized in the cytoplasm, however in some cases the membranous localization was also observed. In normal thyroid immunostaining was limited to the rare follicles showing features of hyperactivity. Western blot corroborated both Q-RT-PCR and immunohistochemistry results showing higher protein level in cancer than in paired normal thyroid. NrCAM expression is up-regulated in PTC compared to the normal thyroid on both transcript and protein level whatever the tumor grade or stage.
Conclusions: This study is the first demonstration that NrCAM is over-expressed in human papillary thyroid carcinomas on both mRNA and protein levels, whatever the tumor stage and grade.
Our results suggest that up-regulation of NrCAM may be involved in the pathogenesis and behavior of papillary thyroid cancer.
Wstęp
Białka adhezji komórkowej (cell adhesion molecules, CAMs) z rodziny L1 są błonowymi glikoproteinami, występującymi głównie w centralnym układzie nerwowym. Jak wykazały badania ostatnich lat, białka te występują również w wielu liniach komórkowych i innych tkankach, w tym tkankach endokrynnych, oraz mysich i ludzkich nowotworach (1, 2, 3) Białka adhezji komórkowej odgrywają ważną rolę w podstawowych procesach zachodzących w komórce takich jak wzrost, różnicowanie, migracja komórek czy przekazywanie sygnału. Jednym z białek tej rodziny jest neuronalna cząsteczka adhezyjna (NrCAM), której ekspresję łączy się z procesami nowotworzenia i inwazji niektórych nowotworów (4, 5).
Cząsteczka NrCAM należy do rodziny immunoglobulinopodobnych białek adhezyjnych zawierających domeny Ig-podobne typu C2 oraz domeny typu fibronektyna III (6, 7). Cząsteczka NrCAM została zidentyfikowana po raz pierwszy w układzie nerwowym gdzie jest zaangażowana w adhezję neuron-neuron oraz bierze udział w bezpośrednim przekazywaniu sygnału podczas wzrostu stożków aksonów (2, 8). Niewiele wiadomo o ekspresji i roli NrCAM w innych tkankach, w tym w tkankach endokrynnych. Przez długi czas sądzono, że NrCAM nie występuje poza układem nerwowym. Jednakże badania ostatnich lat wykazały, że białko to występuje także w wielu innych tkankach. Jak wskazują dane doświadczalne NrCAM w powyższych tkankach uczestniczy nie tylko w komunikacji międzykomórkowej przez przesyłanie sygnału z domeny wewnątrzkomórkowej do cytoszkieletu aktynowego podczas kierunkowej migracji komórek ale również może być związany z transformacją nowotworową (4). Metodą hybrydyzacji Northern blot stwierdzono mRNA NrCAM w takich tkankach jak trzustka, łożysko, rdzeń i kora nadnerczy, tarczyca oraz jądra (1, 9). Ponadto wykazano podwyższony poziom transkryptu NrCAM i/lub białka w niektórych tkankach nowotworowych (3, 10, 11).Badania nad czynnikami aktywującymi NrCAM w nowotworowych liniach komórkowych wykazały, że w procesie tym istotną rolę odgrywają kateniny. Wymuszona ekspresja cząsteczki NrCAM w mysich fibroblastach powodowała wzrost ich ruchliwości, zwiększoną proliferację oraz nabieranie niektórych cech komórek nowotworowych (3).
Celem niniejszej pracy było zbadanie czy jedna z rodziny neuronalnych cząsteczek adhezyjnych NrCAM, białko swoiste dla układu nerwowego, występuje w zróżnicowanych rakach tarczycy.
Materiał i metody
Tkanki tarczycy pochodziły od pa-cjentów operowanych w Centrum Onko-logii, Instytucie Marii Skłodowskiej-Curie oddział w Gliwicach, z powodu raka brodawkowatego tarczycy.
Materiał do analizy Q-RT-PCR i Western blot stanowiły tkanki uzyskane w wyniku resekcji guzów tarczycy. Analizowano 46 przypadków raka brodawkowatego (37 kobiet i 9 mężczyzn w wieku od 15 do 74 lat; średnia wieku wynosiła 47,3 lata) i odpowiadające im tkanki prawidłowe. Do analizy immunohistochemicznej użyto tkanek archiwalnych obejmujących raki brodawkowate (n=46).
Reakcja Q-RT-PCR
Całkowite RNA izolowano z zamrożonych fragmentów tkanek, używając zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen) według zaleceń producenta. Stężenie RNA określono na podstawie pomiaru absorbancji przy długości fali 260 nm a czystość próbek stosunkiem A 260/A 280 nm.
Następnie 500 ng RNA z każdej tkanki posłużył do otrzymania cDNA przy użyciu zestawu Super Script II RT (Applied Biosystem) oraz uniwersalnych starterów.
Otrzymane cDNA poddano ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Sekwencje starterów do reakcji zaplanowano w oparciu o dane z banku genów;
starter sensowny: 5´-TTGTGCAAAGAGGGAGCATG-3´,
starter antysensowny: 5´-GGGCAGTTCCCTGTTGTCCT-3´.
Równocześnie z próbkami badanymi amplifikowano geny β-aktyny i GAPDH w czterech różnych stężeniach cDNA (200 ng, 50 ng, 12,5 ng, 3,125 ng), każde w dwóch powtórzeniach, celem wykreślenia krzywej standar-dowej. Ilościową reakcję PCR dla badanych genów prowadzono z wykorzystaniem detektora sekwencji GeneAmp 7500 (PE Aplied Biosystems) na płytkach 96 dołkowych.
Western Blot
Zamrożone tkanki tarczycy homogenizowano w buforze (0,25 M sacharoza, 0,02 M Tris, 0,001 M EDTA o pH 7,4) zawierającym inhibitory proteaz (PMSF-50 μM, aprotynina – 1 μg/ml, leupeptyna – 1 μg/ml, pepstatyna – 1 μg/ml). Homogenaty wirowano 15 min., 1000 x g. Otrzymany osad odrzucono a supernatanty wirowano 1h przy 100 000 x g, 4°C. Stężenie białka mierzono metodą BCA (Pierce), według standardowego protokołu.
Białka (50 μg/studzienkę) rozdzielano na 7,5% żelu poliakryloamidowym w warunkach nie redukujących (SDS-PAGE). Elektroforezę prowadzono 15 min. – 80V, następnie 1h 150V. Rozdzielone na żelu białka elektrotransferowano na membranę Immobilon P (PVDF, Bio-Rad), 1h, 100 V. Membrany wysycano 5% roztworem odtłuszczonego mleka, przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano z roztworem króliczych poliklonalnych przeciwciał anty-NrCAM w rozcieńczeniu 1:2000 (ab24344, Abcam) przez noc w 4°. Błony płukano 3 x TBST po czym inkubowano 1 godzinę z II rzędowym, kozim przeciwciałem przeciwko króliczym IgG, skoniugowanym z peroksydazą chrzanową (HRP), w stężeniu 20 ng/ml (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Błonę ponownie płukano 3 x TBST. Kompleksy przeciwciało-NrCAM uwidaczniano chemiluminescencyjnie z użyciem SuperSignal West Pico (Pierce). Wizualizację prążków przeprowadzono naświetlając filmy BioMax MS (Sigma-Aldrich, Corp.). We wszystkich tkankach oznaczano poziom β-aktyny, jako kontrolę integralności i jednakowego stężenia białek w poszczególnych próbkach.
Immunohistochemia (IHC)
Do badań immunohistochemicznych użyto utrwalone formaliną i zaparafinowane archiwalne tkanki tarczycy pochodzące od pacjentów operowanych z powodu raka brodawkowatego tarczycy. Skrawki tkanek tarczycy o grubości 3 μm krojono z bloczków parafinowych. Materiał odparafinowano w ksylenie i uwadniano w H2O. Antygen odkrywano stosując roztwór 0,01% proteinazy XXIV przez 10 min. w 37°C przez 10min. Preparaty trzykrotnie płukano w TBST, następnie inkubowano z kozim poliklonalnym przeciwciałem anty NrCAM (Santa Cruz Biotechnology) w rozcieńczeniu 1:100 przez noc w 4°C. Następnie preparaty płukano TBST i inkubowano z LSAB 2 Kit (Labelled Streptavidin-Biotin2 System, DACO). Reakcję wizualizowano przy pomocy chromogenu DAB (diaminobenzidine, DACO). Jądra podbarwiano hematoksyliną Mayer´a (Daco). Reakcję immunohistochemiczną oceniano używając następujących kryteriów: 0 – brak reakcji, ++ reakcja średnio pozytywna, +++ reakcja silnie pozytywna. Preparaty oceniało dwóch niezależnych patologów.
WYNIKI
Reakcja Q-RT-PCR

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Wang B, et al.: Alternative splicing of human NrCAM in neural and nonneural tissues. Molecular and Cellular Neuroscience 1998; 10:287-295.
2. Grumet M, et al.: Structure of a new nervous system glycoprotein, Nr-CAM, and its relationship to subgroups of neural cell adhesion molecules. The Journal of Cell Biology 1991; 113:1399-1412.
3. Conacci-Sorrell M, et al.: NrCAM is a target gene of the β-catenin/LEF-1 pathway in melanoma and colon cancer and its expression enhances motility and confers tumorigenesis. Genes & Development 2002; 16:2058-2072.
4. Conacci-Sorrell M, et al.: The Shed Ectodomain of Nr-CAM Stimulates Cell Proliferation and Motility, and Confers Cell Transformation. Cancer Res. 2005; 65:11605-11612.
5. Cavallaro U, Cristofori G: Cell adhesion and signaling by cadherins and IgCAMs in cancer. Nature Publishing Group 2004; 4:118-131.
6. Dry K, et al.: The complete sequence of human locus for NgCAM-related cell adhesion molecule reveals a novel alternative exon in chick and man and conserved genomic organization for the L1 subfamily. Gene 2001; 273:115-122.
7. Lane RP, et al.: Characterization of highly conserved human homolog to the chicken neural cell surface protein Bravo/NrCAM that maps to chromosome band 7q31. Genomics 1996; 35:456-465.
8. Volkmer H, et al.: Neurofascin induces neurites by heterophilic interactions with axonal NrCAM while NrCAM requires F11 on the axonal surface to extend neurites. J. Cell Biol. 1996; 135: 1059-1069.
9. Dhodapkar KM, et al.: Differential expression of the cell-adhesion molecule Nr-CAM in hyperplastic and neoplastic human pancreatic tissue. Hum Pathol 2001; 32:396-400.
10. Sehgal A, et al.: Antisense human neuron glia related cell adhesion molecule hNr-CAM, reduces the tumorigenic properties of human glioblastoma cells. Anticancer Res. 1999; 19:4947-4953.
11. Okegawa T, et al.: The role of cell adhesion molecule in cancer therapy. Acta Biochimica Polonica 2004; 51:445-457.
12. Grumet M.: NrCAM: a cell adhesion molecule with ligand and receptor functions. Cell Tissue Res. 1997; 290:423-428.
13. Custer AW, et al.: The role of the ankyrin-binding protein in node of Ranvier formation. The Journal of Neuroscience 2003; 23: 10032-10039.
14. Glinke J, et al.: Differential gene expression by endothelial cells in distinct angiogenic states. Eur. J. Biochem. 2000; 267:2820-2830.
15. Sakurai T, et al.: Induction of neurite outgrowth through contactin and Nr-CAM by extracellular regions of glial receptor tyrosine phosphatase. J. Cell Biol. 1997; 136:907-918.
16. Brümmendorf T, Rathjen FG.: Structure/function relationships of axon-associated adhesion receptors of the immunoglobulin superfamily. Curr. Opin. Neurobiol. 1996; 6:584-593.
otrzymano: 2008-03-25
zaakceptowano do druku: 2008-05-10

Adres do korespondencji:
*Barbara Czarnocka
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
ul. Marymoncka 99/103, 01-813 Warszawa
tel.: (0-22) 569-38-13
e-mail: barbarac@cmkp.edu.pl

Postępy Nauk Medycznych 5/2008
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych