© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 5/2008, s. 268-278
*Alicja Nauman, Agnieszka Piekiełko-Witkowska, Olga Turowska, Piotr Popławski, Adam Master, Zbigniew Tański1, Joanna Lampkowska, Anna Wójcicka, Izabela Brózda, Monika Puzianowska-Kuźnicka
Zaburzenia szlaków sygnałowych hormonu tarczycy – trijodotyroniny – w raku nerki typu jasnokomórkowego
Disturbances of thyroid hormone signal pathway – in clear cell renal cell carcinoma
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. med. Andrzej Gardas
1Oddział Urologii, Szpital Specjalistyczny, Ostrołęka
Ordynator: dr med. Zbigniew Tański
Streszczenie
Praca przedstawia wyniki badań prowadzone przez Zespół od ponad 15 lat nad udziałem hormonu tarczycy – trijodotyroniny (T3) i jej receptorów jądrowych (TR) w raku nerkowo-komórkowym – w jego najczęstszej postaci – raka zbudowanego z komórek jasnych (ccRCC). Na podstawie naszych początkowych wyników badań postawiliśmy hipotezę, że T3 może być związana z nowotworzeniem. T3 jest czynnikiem niezbędnym dla prawidłowej kontroli podstawowych procesów komórkowych takich jak podział komórkowy, apoptoza czy różnicowanie komórek. Wszystkie te procesy zależne są nie tylko od stężenia i biodostępności T3, ale również od rodzaju, ilości i aktywności TR oraz od obecności innych czynników, z którymi TR oddziałują na poziomie molekularnym. Udowodniliśmy, że zmiany w ekspresji genów TR, prowadzą do zaburzeń przekazywania sygnału od T3 do genów docelowych, w sposób zależny od obecności T3 (hamowanie bez liganda, aktywacja w obecności liganda). Udowodniliśmy, że T3 może wywierać swój efekt biologiczny tylko wtedy, gdy TR posiada prawidłową budowę.
Summary
The article describes the results of more that 15 years research on the role of thyroid hormone, triiodothyronine (T3) and its nuclear receptors in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). On the basis of our primary research we made a hypothesis that T3 can be engaged in neogenesis. T3 is indispensable for the proper control of the basic cellular processes such as cell division, apoptosis and differentiation. All these processes are dependent not only on concentration and bioavailability of T3 but also on type, amount and activity of TRs and the presence of other TRs molecules. We proved that the changes in TR expression lead to disturbances in signal transduction from T3 to the T3 regulated genes. The disturbances are T3 dependent (the expression is lowered in the absence of T3 and activated in the presence of T3). We also proved that T3 can exert its effect only in the presence of TRs which possess proper sequence.
Wprowadzenie
Szlaki sygnałowe, poprzez które działa hormon tarczycy, trijodotyronina (T3), i ich wzajemne połączenia tworzą sieć przenoszącą informację zapisaną w strukturze chemicznej hormonu, doprowadzając do swoistej odpowiedzi na poziomie genomu. Specyficzna odpowiedź osiągana jest dzięki istnieniu jądrowych białek receptorowych, z którymi T3 się wiąże. Receptory T3 ( Thyroid hormone Receptor, TR) są zależnymi od liganda czynnikami transkrypcyjnymi, które wiążą się ze specyficznymi sekwencjami, TRE ( Thyroid Responsive Element) (1), w obrębie części regulatorowych genów docelowych.
Trijodotyronina jest czynnikiem niezbędnym dla prawidłowej kontroli podstawowych procesów komórkowych, takich, jak proliferacja komórki (pro- lub anty-proliferacyjne działanie T3 zależne jest w znacznym stopniu od rodzaju tkanki i etapu rozwojowego), śmierć fizjologiczna komórki (apoptoza) oraz różnicowanie komórek. Równowaga pomiędzy tymi procesami jest konieczna dla prawidłowej kontroli szybkości podziałów komórkowych i utrzymania homeostazy organizmu. Wszystkie te procesy zależne są od stężenia i biodostępności T3, rodzaju, ilości i aktywności TR oraz od obecności innych czynników, z którymi TR oddziałują na poziomie molekularnym. Z licznych badań, prowadzonych między innymi w naszym zespole wynika, że zmiany w ekspresji genów TR prowadzą do zaburzeń w funkcjonowaniu komórki, tkanki i całego organizmu. Prawdopodobne jest więc, że w nowotworach, na skutek zmian dotyczących TR, dochodzi do zaburzeń przekazywania sygnału od T3 do genów docelowych.
W prowadzonych przez nas od 1990 roku badaniach nad udziałem T3 i jej receptorów w raku nerki typu jasnokomórkowego ( clear cell Renal Cell Carcinoma ccRCC) zajmujemy się przede wszystkim identyfikacją genów o zaburzonej ekspresji wywołanej zmianą stężenia biodostępnej T3 lub nieprawidłowościami dotyczącymi TR w komórce docelowej. W komórkach nowotworowych nerki analizowaliśmy regulację ekspresji genów będących pod ścisłą kontrolą T3, a mianowicie genów kodujących białka receptorowe TR i genu jodotyroninowej dejodynazy typu I (enzymu kontrolującego poziom T3 w komórce). Ponadto, badaliśmy ekspresję genów kodujących białka kontrolujące przejście z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego (cykliny E, czynniki transkrypcyjne rodziny E2F1-8, geny białek rodziny retinoblastoma (Rb, p107, p130), kinazę cdk2), których ekspresja jest również zależna od T3. Badania prowadzono w tkankach (guz nowotworowy nerki/tkanka nienowotworowa nerki) oraz w liniach komórkowych wywodzących się z raka nerki i ze zdrowych kanalików nerkowych (Caki-2, Caki-1 i HK2). Badając różnice w regulacji ekspresji genów, szczególną uwagę poświęcono zmianom na poziomie trans-kryptomu, czyli:
– regulacji pretranskrypcyjnej: regulacji poprzez wiązanie czynników transkrypcyjnych, np. TR, z regulatorowymi sekwencjami promotorowymi (TRE),
– regulacji potranskrypcyjnej: regulacji przez usuwanie intronów z pre-mRNA i różnicowe łączenie eksonów ( alternative splicing),
– regulacji pretranslacyjnej: regulatorowym sekwencjom w obrębie 5´ UTR (region niekodujący, UnTranslated Region) i 3´UTR.
Ponadto:
– geny o zróżnicowanej ekspresji identyfikowano również na podstawie obrazu rozdziału w żelach ich białkowych produktów,
– określano aktywację receptorow TR przez oznaczanie maksymalnego wiązania z T3
Analizowano 200 skrawków tkanek pobranych z guza nowotworowego, 200 skrawków tkanek nienowotworowych pobranych z przeciwnego bieguna tej samej nerki i 20 tkanek nienowotworowych, pobranych z nerek operowanych z innych powodów niż nowotwór. Stworzono bank cDNA, DNA, RNA oraz kolekcję wektorów zawierających sekwencje kodujące i niekodujące receptory jądrowe trijodotyroniny TRα i TRβ, gotowych do dalszej analizy. Przeprowadzono też genetyczną ocenę badanego materiału biologicznego pod kątem występowania niestabilności mikro-satelitarnej ( MicroSatellite Instability, MSI) oraz utraty heterozygotyczności ( Loss Of Heterozygosity, LOH). Wykazano, że w obrębie grupy nowotworów określonych histopatologicznie jako homogenna w aspekcie stopnia zróżnicowania (G1, G2, G3) znajdują się tkanki wykazujące różnice genetyczne w zakresie niestabilności mikrosatelitarnej i utraty heterozygotyczności. Analiza niestabilności mikrosatelitarnej wykazała obecność MSI w 12,50% analizowanych nowotworów (ryc. 1), zaś analiza utraty heterozygotyczności wykazała obecność LOH w 9,35% analizowanych tkanek ccRCC (ryc. 2).
Ryc. 1. Chromatogramy genotypowania niestabilności mikrosatelitarnej-MSI. Porównanie dwóch przykładowych profili ccRCC i kontroli (P1-próbka z obserwowanym profilem MSI, P2-bez MSI). Poszczególne linie wynikowe zawierają informacje o kolejnych analizowanych systemach STR występujących na różnych chromosomach i oznaczonych: Ch(nr chromosomu). Strzałki wskazują zwielokrotnienie alleli w poszczególnych loci, wskazując na obecność MSI w przykładowej lini P1 ccRCC.
Ryc. 2. Chromatogramy genotypowania utraty heterozygotyczności – Porównanie przykładowych profili ccRCC i kontroli w badanych loci typu SNP, występujących na chromosomie 3, sekwencji genu THRB. „Profil prawidłowy” prezentuje genotyp próbki kontrolnej (bez obserwowanej utraty heterozygotyczności), na co wskazują zaznaczone strzałkami (hz) heterozygotyczne miejsca SNP (podwójne piki dwóch alleli w pojedynczym loci na dwóch różnych chromosomach homologicznych). „LOH” prezentuje profil próbki ccRCC z obserwowaną homozygotycznością we wszystkich badanych loci, co wskazuje na utratę heterozygotyczności w obrębie analizowanej sekwencji chromosomu trzeciego
Ekspresja jodotyroninowej dejodynazy w komórkach nowotworowych
Jodotyroninowe dejodynazy, które są oksydoreduktazami [EC.3.8.14] i należą do rodziny selenoprotein, do aktywacji których konieczna jest obecność zredukowanych związków tiolowych (RSH), pełnią kluczową rolę w homeostatycznym systemie kontrolującym stężenie hormonów tarczycy w każdej komórce. Odpowiadają za kontrolę prawidłowego rozwoju, wzrostu, różnicowania i specyficznego metabolizmu komórek. Działają w tyreocytach i we wszystkich komórkach pozatarczycowych, tworząc swoisty wewnątrzkomórkowy system enzymów błonowych, odpowiedzialnych nie tylko za biotransformację (konwersję) prohormonu, tyroksyny (T4), do aktywnego hormonu T3, ale również za specyficzną regulację poziomu T4 i T3 w każdej komórce. Synteza dejodynaz jest ściśle kontrolowana przez stężenie T3 w komórce, a stężenie T3 przez jodotyroninowe dejodynazy.
Wyróżnia się trzy typy jodotyroninowych dejodynaz: dejodynaza typu I (D1) dejodynaza typu II (D2) i dejodynaza typu III (D3). Jodotyroninowe dejodynazy katalizują reakcje odjodowania hormonów tarczycy (ryc. 3). Reakcja odjodowania T4 w pozycji 5´ ( Outer Ring Deiodination, ORD, odjodowanie pierścienia zewnętrznego, fenolowego), katalizowana przez dejodynazę typu I (5´D1) i typu II (5´D2) prowadzi do powstania aktywnej formy hormonu, T3. Reakcja odjodowania T4 w pozycji 5 ( Inner Ring Deiodination, IRD, odjodowanie pierścienia wewnętrznego, tyrozylowego), katalizowana przez dejodynazę typu I (5D1) i typu III (5D3), prowadzi do powstania nieaktywnej pochodnej, tzw. rewers trijodotyroniny (rT3). Zarówno trijodotyronina, jak i rT3, podlegają dalszym reakcjom odjodowania z wytworzeniem nieaktywnych dijodotyronin (T2).
Ryc. 3. Reakcje katalizowane przez jodotyrononowe dejodynazy typu: 1 (D1), 2 (D2) i 3 (D3). T4: 3,5,3´5´-tetrajodotyronina (tyroksyna), T3: 3,5,3´- trijodotyronina, rT3: 3´5´3- rewers-trijodotyronina, T2: 3,3´-dijodotyronina.
Dejodynazy są zakotwiczonymi w błonach komórkowych białkami o masie 29-33 kDa. D1 i D3 lokalizują się w błonie cytoplazmatycznej, natomiast D2 zakotwiczona jest w błonie retikulum endoplazmatycznego (2,3). Funkcjonują prawdo-podobnie jako dimery (4,5). Centrum aktywne dejodynaz zawiera nietypowy aminokwas, selenocysteinę (Sec), kodowany przez trójkę nukleotydów UGA, w większości przypadków traktowanych w procesie translacji jako kodon STOP (6-8). Podczas syntezy łańcucha polipeptydowego kompleks translacyjny rozpoznaje kodon UGA jako kodujący Sec-tRNA dzięki współdziałaniu elementów trans (białek SBP2 i EF-sec) oraz elementu cis – zlokalizowanej w rejonie 3´UTR transkryptu dejodynazy sekwencji o nazwie SECIS, tworzącej strukturę tzw. szpilki do włosów (9).
Jodotyroninowa dejodynaza typu I
Dejodynaza typu I była pierwszym odkrytym enzymem katalizującym konwersję T4 do T3 (10,11), pierwsza też została sklonowana (6, 12). D1 jako jedyna spośród dejodynaz, katalizuje reakcję odjodowania w pozycji 5´ (z wytworzeniem T3 i T2), jak i w pozycji 5 (z wytworzeniem rT3). D1 wykazuje najwyższe powino-wactwo do rT3, mniejsze do T4 i T3 (rT3<
W stanie eutyreozy D1 odpowiada za syntezę około 34% obwodowej T3, natomiast w stanie tyreotoksykozy jej udział wzrasta do 67% (i więcej) w zależności od stopnia zaawansowania choroby (16). Aktywność D1 specyficznie hamuje 6-n-propylotiouracyl (PTU); właściwość ta jest wykorzystywana do różnicowania aktywności D1 od pozostałych dejodynaz.
Gen kodujący D1 ( Dio1) w genomie ludzkim zlokalizowany jest w pozycji 1p32-33, składa się z 4 eksonów (17). Transkrypcja Dio1jest regulowana między innymi przez hormony tarczycy. W promotorze Dio1znajdują się dwa pozytywne TRE: klasycznyTRE-DR4 (18,19) oraz nietypowy TRE-DR10 (18), umożliwiające aktywację transkrypcji genu przez receptory TR, a także miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego Sp1 (19, 20).
Pierwotny transkrypt Dio1podlega procesowi różnicowego składania eksonów, w wyniku którego powstają warianty transkrypcyjne o różnej sekwencji, w tym pozbawione elementów kodujących rejon białka zawierający centrum aktywne (ryc. 4).
Ryc. 4. Gen, transkrypt i produkt białkowy ludzkiej dejodynazy 1. Rycina przedstawia cztery istniejące w bazie danych Entrez-Gene warianty splicingowe i powstające na ich matrycy produkty białkowe. W literaturze opisano jedynie wariant 1 i odpowiadającą mu izoformę a. Znakiem "?” oznaczono izoformy dejodynazy, których istnienie in vivo nie zostało jeszcze potwierdzone. Eksony zaznaczono prostokątami i ponumerowano od 1 do 4. Liczby ponad eksonami i intronami wskazują na ich wielkość w parach zasad. Na schemacie genu zaznaczono pozycje kodonów ATG i STOP. Na schemacie białka zaznaczono aminokwasy istotne z punktu widzenia aktywności enzymatycznej dejodynazy 1.
Ekspresja dejodynazy 1 w tkankach nowotworowych
Ekspresja genu Dio1jest zaburzona w nowotworach. Poziom mRNA i aktywności D1 są obniżone w raku brodawkowatym tarczycy (21-24), w raku jasnokomórkowym nerki (25, 26), w guzach glejowych mózgu (27), podwyższony w gruczolaku pęcherzykowym i raku pęcherzykowym tarczycy (21), raku piersi (28). Badania na liniach komórkowych raka piersi MCF-7 i MDA-MB-231 sugerują, że podwyższona ekspresja D1 ( Dio1) może stanowić marker różnicowania w komórkach nowotworowych (29).
Pierwsze doniesienia dotyczące zaburzonej ekspresji D1 w ccRCC zostały opublikowane przez nasz zespół w 1991 r. (25). Stwierdzono wówczas, że aktywność D1 była znacząco obniżona w tkance nowotworowej w porównaniu ze stanowiącą kontrolę zdrową tkanką otaczającą guz. Obniżona aktywność D1 korelowała z obniżonym poziomem białka. Kolejne badania wykazały znaczne zróżnicowanie aktywności D1 oraz jej ekspresji na poziomie mRNA pomiędzy próbkami kontrolnymi pobranymi od różnych pacjentów. Różnice w poziomie mRNA były nawet 10-krotne. W tkankach nowotworo-wych zarówno aktywność enzymatyczna jak i ilość mRNA D1 były prawie niewykrywalne (30, 26). Jedną z przyczyn obniżonej ekspresji D1 w nowotworach nerki może być zaburzona aktywacja transkrypcji Dio1przez receptory TR. Zmutowane wersje TR sklonowane z tkanek ccRCC aktywowały promotor genu Dio1znacznie słabiej, niż dzikie typy tych (31).
Analiza ekspresji Dio1na poziomie posttranskrypcyjnym
Analiza wariantów transkrypcyjnych klonowanych z tkanek ccRCC oraz z tkanek nienowotworowych z przeciwległego bieguna nerki nowotworowej, jak również z próbek pobranych z nerek nienowotworowych (powypadkowych, kamiczych, ektopowych, marskich) wykazała istnienie wielu nieopisanych do tej pory wariantów transkrypcyjnych Dio1, w tym wariantów pozbawionych eksonu 2, zawierającego rejon kodujący centrum aktywne. Zidentyfikowano m.in. warianty zawierające wszystkie 4 eksony, eksony: 1, 2, 4, eksony: 1 i 4, a nawet wariant składający się tylko z eksonu 1. Dokładna analiza poziomu ekspresji transkryptów genu Dio1,wykonana za pomocą techniki PCR czasu rzeczywistego ( real-time PCR) wykazała dramatycznie obniżony poziom ekspresji wszystkich wariantów transkrypcyjnych (o około 90%) w tkankach nowotworowych w porównaniu z tkankami kontrolnymi (32). Zaburzony był również proces różnicowego składania eksonów. W tkankach nowotworowych stwierdzono istotny statystycznie spadek stosunku wariantów transkrypcyjnych zawierających rejon kodujący centrum aktywne białka i wariantów pozbawionych tego rejonu. Stwierdzono, że zaburzenia różnicowego składania eksonów D1 wynikają prawdopodobnie z nieprawidłowej ekspresji czynników splicingowych SF2/ASF i hnRNPA1 w ccRCC (Piekiełko-Witkowska A., wyniki niepublikowane).
Analiza ekspresji receptorów jądrowych trijodotyroniny
Receptory jądrowe trijodotyroniny, TR, to średniej wielkości białka jądrowe (TRβ1- 461 aminokwasów; 53 kDa), kodowane przez geny zlokalizowane na chromosomach trzecim ( THRB - 3p24.2) i siedemnastym ( THRA - 17q23).
W procesie różnicowego składania pierwotnego transkryptu powstają po dwie główne izoformy każdego receptora – odpowiednio TRα1 i TRα2 oraz TRβ1 i TRβ2. Receptory jądrowe T3 wpływają na ekspresję genów docelowych poprzez selektywne wiązanie się z promotorowymi sekwencjami DNA typu HRE ( Hormone Response Element), wzmacniając tym samym (lub osłabiając) wydajność transkrypcji. TR, podobnie jak inne białka z rodziny receptorów jądrowych, wykazują obecność dobrze scharakteryzowanych domen funkcjonalnych (ryc. 5). Wiązanie hormonu powoduje zmiany konformacyjne białka powodując zmiany w oddziaływaniu TR z koaktywatorami i korepresorami.
Ryc. 5. Schemat budowy domenowej białka receptorowego dla trijodotyroniny TRβ1 (A.) oraz układu eksonów transkryptu THRB (B.).
W budowie receptora TRβ1 wyróżniono: domenę A/B, odpowiedzialną za wiązanie białek regulatorowych oraz niezależną od T3 aktywację transkrypcji, domenę C wiążącą DNA (8Cys=2 palce cynkowe), domenę łącznikową D zawierającą sygnał lokalizacji jądrowej, domenę E odpowiedzialną za wiązanie hormonu (T3) i dimeryzację receptorów oraz domenę F odpowiedzialną za zależną od T3 aktywację transkrypcyjną receptora.
Na schemacie przedstawiono ponumerowane kolejno eksony transkryptu THRB (B.) z wyszczególnieniem eksonów 5´UTR (1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 2a, 2b, 2c) powstających w procesie różnicowego składania pierwotnego transkryptu do alternatywnych form mRNA, różniących się sekwencją obszaru regulatorowego nie ulegającego translacji. Na schemacie zaznaczono również kodon startu translacji, kodon zamknięcia ramki odczytu (TAG) oraz sekwencję kodującą (THRB-ORF).
Regulacja pretranskrypcyjna ekspresji TR w jasnokomórkowym raku nerki: regulacja poprzez wiązanie czynników transkrypcyjnych - receptorów trijodotyroniny (TR) z regulatorAmi sekwencjami promotorowymi (TRE)
W pracy dotyczącej ekspresji TR w raku jasnokomórkowym nerki (33) stwierdzono, że ilość mRNA TRα1 była znamiennie zmniejszona w większości przypadków ccRCC w porównaniu z odpowiadającymi im tkankami kontrolnymi, natomiast ekspresja TRβ1 na poziomie mRNA była bardziej heterogenna: w 70% raków była znacząco zmniejszona, zaś w 30% – zwiększona w guzach w porównaniu z odpowiadającymi im kontrolami. Średnia ilość białka TRα1 była wyższa w ccRCC w porównaniu z tkankami kontrolnymi, podczas, gdy średnia ekspresja TRβ1 na poziomie białka była obniżona w tkankach tych samych nowotworów. Zwiększenie ilości TR niekoniecznie przekładało się na zwiększenie aktywności genów docelowych trijodotyroniny, ponieważ funkcja TR może być, i zwykle jest, zaburzona wskutek różnych mechanizmów, na przykład mutacji w genach kodujących TR, albo, prawdopodobnie, zaburzeń w modyfikacjach potranslacyjnych białka. W ccRCC znaleziono mutacje w receptorze trijodotyroniny (34). Mutacje dotyczyły obu izoform TRα1 i TRβ1; większość z nich znajdowała się w domenie wiążącej ligand, kilka zaś w domenie wiążącej DNA. Ponadto, odsetek tkanek ccRCC, w których stwierdzono mutacje TR wzrastał wraz ze spadkiem zróżnicowania histologicznego nowotworu (34). Badania funkcjonalne in vitro mutantów TR wykazały, że w zależności od miejsca, gdzie doszło do zmiany aminokwasu, mutanty takie nieprawidłowo wiążą T3 lub/i DNA oraz w sposób niedostateczny aktywują geny docelowe (34-38).
Regulacja ekspresji THRB na poziomie potranskrypcyjnym
Składanie pre-mRNA ( splicing) THRB (ryc. 5B) polega na usuwaniu z pierwotnego transkryptu preRNA sekwencji niekodujących (intronów) i łączeniu pozostałych eksonów w gotowy do translacji mRNA. W wyniku alternatywnego składania mogą powstawać kodowane przez ten sam gen białka, różniące się od siebie sekwencją aminokwasów i funkcją, jak również białka identyczne, chociaż kodowane przez mRNA różniące się sekwencją UTR ( UnTranslated Region). UTR to część mRNA nie ulegająca translacji, położona w kierunku 5´ (5´-UTR) lub 3´ (3´-UTR) od sekwencji kodującej. Procesowi składania pre-mRNA podlegają również wspomniane obszary mRNA (5´- oraz 3´-UTR), których funkcja w dojrzałym mRNA polega na regulacji ekspresji genu na poziomie pre-translacyjnym. Najnowsze badania wskazują, że poziom translacji wariantów TR może być regulowany przez takie rejony mRNA (39). Innymi słowy, ilość powstającego białka TR jest zależna od wariantu splicingowego regionu 5´UTR mRNA. Obszary mRNA nie ulegające translacji mogą wpływać na trwałość cząsteczki RNA jak również inicjację oraz efektywność przebiegu samej translacji przez oddziaływanie obszarów 5´UTR na sekwencję kodującą, na tworzenie struktur II-rzędowych utrudniających inicjację translacji (40-41) jak również poprzez wiązanie małych cząsteczek regulatorowych miRNA do sekwencji 3´UTR, obniżających najczęściej efektywność procesu translacji (42-46). W ostatnim czasie wskazuje się na rolę miRNA oraz sekwencji 3´UTR w patogenezie nowotworów (46-48). Sekwencje mRNA nie ulegające translacji stanowią część znaczącego mechanizmu regulacji ekspresji genów na poziomie pre-translacyjnym.
Analiza ekspresji produktów alternatywnego składania THRB
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)
|
|
Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej
|
otrzymano: 2008-03-25
zaakceptowano do druku: 2008-05-10
Adres do korespondencji:
*Alicja Nauman
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
ul. Marymoncka 99/103, 01-813 Warszawa
tel.: (0-22) 569-38-13
e-mail: anauman@cmkp.edu.pl
Postępy Nauk Medycznych 5/2008Strona internetowa
czasopisma Postępy Nauk MedycznychPozostałe artykuły z numeru 5/2008:
