Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 5/2008, s. 285-290
Joanna Skubis-Zegadło, Barbara Górka, Jolanta Czerwińska, *Barbara Czarnocka
NIS i pendryna - białka metabolizmu jodu w zróżnicowanych rakach tarczycy
NIS and pendrin – the proteins of iodide metabolism in differentiated thyroid carcinomas
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Andrzej Gardas
Streszczenie
Wstęp: Transport jonów jodkowych w tyreocycie jest pierwszym etapem biosyntezy hormonów tarczycy. Proces ten jest katalizowany przez wysoko wyspecjalizowane białka i obejmuje dwa etapy. Jony jodkowe są aktywnie transportowane z krwi do wnętrza tyreocyta z udziałem symportera sodowo-jodowego, a następnie są przenoszone na interfazę błony szczytowej i koloidu. Uważa się, że jednym z białek przenoszących jony jodkowe do koloidu jest pendryna. Nieprawidłowości w transporcie jonów jodkowych mogą być w istotny sposób związane z ich nieprawidłowym metabolizmem obserwowanym w zróżnicowanych rakach tarczycy.
Materiały i metody: W prezentowanej pracy używając metody PCR w czasie rzeczywistym zbadano poziom ekspresji genów kodujących NIS i pendrynę w dużej grupie tarczyc pochodzących od pacjentów ze zróżnicowanymi rakami tarczycy w porównaniu do tkanek prawidłowych.
Wyniki: W analizowanej serii raków tarczycy poziom transkryptu genu NIS i PDS był znamiennie statystycznie obniżony w porównaniu do wartości tkanek prawidłowych. Poziom ekspresji badanych genów nie korelował ze sobą zarówno w zróżnicowanych rakach tarczycy jak i tkankach prawidłowych. Jak pokazały nasze wcześniejsze badania w zróżnicowanych rakach tarczycy lokalizacja obu białek była cytoplazmatyczna w przeciwieństwie do błonowej charakteryzującej tkanki prawidłowe.
Wnioski: Większość zróżnicowanych raków tarczycy zachowuje zdolność ekspresji obu białek zaangażowanych w transport jonów jodkowych: NIS i pendryny. Poziom mRNA NIS i PDS jest silnie obniżony w rakach w porównaniu do tarczyc prawidłowych. W większości pozytywnych przypadków badane białka zlokalizowane są cytoplazmatycznie.
Summary
Introduction: The thyroid hormones biosynthesis involves a two-step iodide transport process: the active transport across the basolateral plasma membrane of thyrocytes and a passive transport across the apical plasma membrane. Each step is catalyzed by a high specialized protein. Initially I- ions are taken from the blood and transported into a thyrocyte via the N(+)/I(-) symporter and then moved to the colloid space of the follicle through the apical membrane transporters. Pendrin is believed to be one of these proteins. An altered iodide transport may be strongly related to the impaired iodide metabolism which is often observed in thyroid diseases.
Materials and methods: Real-time PCR method was used to investigate the level of both, NIS and PDS, genes expression in a large group of control (normal) and differentiated thyroid carcinoma tissues.
Results: We demonstrated that the mRNA expression of both, NIS and PDS, genes in the analyzed series of thyroid cancer tissues was significant lower in comparison to their expression in normal thyroid tissues. NIS and PDS genes´ levels in all analyzed cancers and normal thyroid were not correlated. The immunohistochemical staining showed membrane localizations of NIS and PDS in the normal thyroid thyrocyte, whereas in the cancer tissues both proteins were observed in the cytoplasm.
Conclusions: Most of the examined thyroid cancers tissues are capable to express two proteins involved in iodide metabolism: NIS and PDS. However, their localization in disease state seems to be changed, from membranous to cytoplasmic. Both, NIS and PDS, mRNA levels were significantly lower in the group of thyroid cancerous samples comparing to normal thyroid tissues.
Wstęp
Główną fizjologiczną funkcją tarczycy jest produkcja hormonów T3 i T4. Pierwszym etapem biosyntezy hormonów tarczycy jest transport jonów jodkowych (I-) z krwioobiegu do koloidu. Transport I- w tarczycy przebiega w dwóch etapach i jest katalizowany przez NIS i pendrynę, białka zlokalizowane na przeciwnych biegunach tyreocyta. Symporter sodowo-jodowy (NIS) zlokalizowany jest w błonie podstawnej tyreocyta. Jego fizjologiczna rola polega na katalizowaniu aktywnego, sodowo-zależnego transportu jodków z krwi do wnętrza komórki tarczycy. Gen kodujący NIS znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 19 w pozycji 13 (19p13) i składa się z 15 egzonów oraz 14 intronów (1). Koduje białko zbudowane z 643 aminokwasów o masie molekularnej wynoszącej około 70-95 kDa. W strukturze przestrzennej tego białka występuje 13 trans-membranowych fragmentów. NIS należy do rodziny białek transportujących aniony SLC5A (ang. solute carrier family 5). Białka z tej rodziny wykazują wysoką homologię pomiędzy sobą i charakteryzują się zbliżoną funkcją. Wykorzystują elektrochemiczny gradient sodu, jako siłę napędową do transportu swoistej dla nich substancji (2, 3). Nagromadzone wewnątrz komórki jony I- są następnie transportowane przez błonę szczytową do światła koloidu. Uważa się, że jednym z białek odpowiedzialnych za ten transport jest pendryna. Pendryna należy do rodziny białek transportujących aniony zwanej SLC26 (ang. solute carrier family 26). Białka z tej rodziny charakteryzuje duża jednorodność struktury przestrzennej. Ich podstawową funkcją jest transport jonów organicznych i nieorganicznych, a proces ten jest niezależny od gradientu jonów sodowych (4). Pendryna jest silnie hydrofobową błonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej ok. 115 kDa składającą się z 780 reszt aminokwasowych. Podobnie jak inne białka należące do rodziny transporterów SLC26 składa się z 12 dużych fragmentów przezbłonowych połączonych krótkimi pętlami ułożonymi naprzemiennie wewnątrz i zewnątrz cytoplazmatycznie. Fragmenty N- i C- końcowe białka zlokalizowane są wewnątrz komórki (5). Gen kodujący pendrynę oznaczony skrótem PDS (SLC26A4 ang. Pendred syndrome gene) sklonowano w 1997 roku (6). U ludzi gen PDS zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 7 w pozycji 31, w pobliżu genu DRA// CLT (SLC26A3) (7). Mutacje w obrębie genu PDS są odpowiedzialne za występowanie zespołu Pendreda, schorzenia charakteryzującego się wrodzoną głuchotą, częściowym defektem organifikacji jodków oraz wolem (8, 9).
Podczas transformacji nowotworowej w komórkach tarczycy obserwuje się nieprawidłowości w wewnątrzkomórkowym metabolizmie jonów jodkowych (10, 11). Wiążą się one ze zmianami lub brakiem ekspresji kluczowych białek zaangażowanych w proces biosyntezy hormonów takich, jak: TPO, Tg, NIS oraz pendryny (12,13).
W prezentowanej pracy badano poziom ekspresji NIS i pendryny w dużej grupie próbek pochodzących od pacjentów ze zróżnicowanymi rakami tarczycy w odniesieniu do tkanek prawidłowych pochodzących od tych samych pacjentów.
Materiały i metody
Tkanki tarczycy
Tkanki tarczycy otrzymano z Centrum Onkologii Instytutu im. Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach. Do analizy metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (real-time) użyto 74 tkanek tarczycy pochodzących od 43 pacjentów (32 kobiet i 11 mężczyzn w wieku od 15 do 74 lat, średnia wieku 46 lat). Analizie poddano 31 tkanek prawidłowych i 43 zróżnicowane raki tarczycy z których ponad połowa (56%) była o średnicy>1 cm do ≤ 4 cm -T2. Wszystkie otrzymane pooperacyjnie skrawki tarczyc przechowywano w temperaturze -80°C.
Poziom ekspresji genu PDS
Poziom ekspresji genu PDS w tkankach tarczycy analizowano metodą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym (real-time RT-PCR).
Izolacja RNA
Do izolacji RNA wykorzystywano zestaw RNeasy Mini Kit (Qiagen). Całkowite RNA izolowano z około 100 mg tkanki zgodnie z załączoną przez producenta instrukcją.
Pomiarów stężenia otrzymanego RNA dokonywano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 260 nm w odniesieniu do długości fali 280 nm. Stosunek pomiaru stężenia przy długości fal: A260/A280 określał czystość preparatu i w większości badanych prób wynosił od 1.7-2.0. Próby, w których wartość współczynnika nie mieściła się w wymienionym zakresie odrzucano, a RNA ponownie izolowano.
Reakcja odwrotnej transkrypcji
Do syntezy cDNA wykorzystywano zestaw Superscript II RT (GIBCO-BRL). W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: heksamery o przypadkowej sekwencji (1μg), całościowe RNA (1μg), mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dATP, dTTP, DTP, dGTP) o stężeniu końcowym 200μM, inhibitor RNazy (1μl), 1x stężony bufor dla polimerazy oraz 200 jednostek odwrotnej transkryptazy (Invitrogen).
Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono w objętości 20 μl w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie przez 10 minut w temperaturze 70°C. Otrzymane cDNA przechowywano w -20°C.
Reakcja real-time RT-PCR
Ilościowe oznaczenie poziomu mRNA dla NIS i pendryny oraz genu referencyjnego β-aktyny wykonano przy użyciu zestawu firmy PE Applied Biosystems.
Reakcję QRT-PCR prowadzono w aparacie GeneAmp 5700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) na 96 dołkowych płytkach w objętości 25 μl. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: gotowy zestaw starterów i sond dla genów NIS i PDS oraz referencyjnego genu β-aktyny (TaqMan Assays-on-demand gene expression, PE Applied Biosystems, PDS - Id: Hs00166504_ml i β-aktyna - Id: Hs99999903_ml), 1μg cDNA, TaqMan Universal PCR Master Mix 25 μl. Po wstępnej 10 minutowej denaturacji w temperaturze 95°C reakcję amplifikacji przeprowadzono w następujących warunkach:
l 30 cykli składających się z następujących etapów:
– denaturacja (w temp. 95°C przez 15 sek.),
– przyłączanie starterów i wydłużanie (w temp. 60°C przez 1 min.).
l 1 cykl składający się z końcowego wydłużania w temperaturze 72°C przez 10 minut.
Otrzymane wyniki ekspresji genu NIS i PDS normalizowano względem genu referencyjnego β-aktyny. W tym celu poziom ekspresji genu PDS określano z krzywej standardowej i dzielono przez poziom ekspresji genu β-aktyny. Do skonstruowania krzywej standardowej dla obu genów użyto cDNA z puli sześciu tkanek prawidłowych tarczycy w czterech różnych rozcieńczeniach cDNA: 200 ng, 50 ng, 12,5 ng, 3,125 ng. Dla każdej badanej próby wykonywano dwa powtórzenia, które uśredniano.
Wyniki analizowano używając aplikacji Q-Gene do Microsoft Excel(r).
Analiza immunohistochemiczna
Poziom ekspresji białka i jego lokalizację komórkową badano metodą immunohistochemiczną. Materiał stanowiły zaparafinowane archiwalne bloczki tkanek tarczycy. Reakcję immunochistochemiczą z przeciwciałami antyNIS i antypendryna przeprowadzono zgodnie z uprzednio opisaną procedurą (14, 16).
Analiza statystyczna
W opracowaniu statystycznym wyników stosowano test Whitneya-Manna, nieparametryczną korelację Spearmana. Istotność różnic na poziomie 5% (P ≤ 0,05) uznana była za istotną, a na poziomie 0,1% (P ≤ 0,001) za wysoce istotną.
WYNIKI
Poziom ekspresji genu NIS i PDS w tkankach tarczycy badano metodą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym.
We wszystkich 31 analizowanych tarczycach prawidłowych oraz 43 zróżnicowanych rakach tarczycy wykryto transkrypt genów NIS i PDS. Obserwowany poziom ekspresji obu genów był heterogenny zarówno w analizowanych tkankach prawidłowych jak i w zróżnicowanych rakach tarczycy (ryc. 1). W części raków poziom mRNA NIS (14/33%) i PDS (2/5%) był bardzo niski (na granicy czułości metody).
Ryc. 1. Poziom ekspresji mRNA NIS i PDS w zróżnicowanych rakach tarczycy w porównaniu do tkanek prawidłowych.

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2008-03-25
zaakceptowano do druku: 2008-05-10

Adres do korespondencji:
*Barbara Czarnocka
Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego
ul. Marymoncka 99/103, 01-813 Warszawa
tel.: (0-22) 569-38-13
e-mail: barbarac@cmkp.edu.pl

Postępy Nauk Medycznych 5/2008
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych