Chcesz wydać pracę habilitacyjną, doktorską czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 3/2012, s. 190-193
Beata Kaleta, *Jacek Łukaszkiewicz, Grażyna Kubiak-Tomaszewska, Piotr Tomaszewski
Polimorfizm C-159T receptora CD14 i C-1196T jego ko-receptora TLR4 u pacjentów z alkoholowym stłuszczeniem i alkoholową marskością wątroby
A C-159T polymorphism of CD14 receptor and polymorphism of TLR4 gene in patients with alcoholic fatty liver and alcoholic cirrhosis
Katedra Biochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik Katedry: prof. dr hab. Dariusz Sitkiewicz
Streszczenie
Obok czynników środowiskowych, diety, trybu życia, itp. prawdopodobny wpływ na rozwój alkoholowego stłuszczenia (AC) i alkoholowej marskości wątroby (AC) mają czynniki genetyczne. Badania kliniczne dowodzą, iż toksyny bakterii Gram-ujemnych u osób przewlekle nadużywających alkoholu w większym stopniu przedostają się do krwi ze światła jelita. Przez interakcję z receptorami błony komórkowej CD14 i TLR4 powodują one aktywację komórek Kupffera w wątrobie i produkcję cytokin prozapalnych, które uszkadzają hepatocyty. Polimorfizm C-159T receptora CD14 w rejonie promotorowym genu powoduje zwiększenie ekspresji tego receptora na powierzchni komórek Kupffera oraz nasilenie reakcji immunologicznej. Również polimorfizm C-1196T jego ko-receptora TLR4 może powodować zmiany w kaskadzie sygnalizacyjnej. W badaniu oznaczono warianty polimorficzne genu CD14 i TLR4 w grupie chorych z alkoholowym stłuszczeniem (AFL) i alkoholową marskością wątroby (AC) oraz w grupie kontrolnej, wykorzystując technikę RT-PCR. W przypadku polimorfizmu C-159T receptora CD14 stwierdzono istotne statystycznie różnice w częstości występowania genotypu TT w grupie osób z AC i kontrolnej (p = 0,008), co sugeruje ochronną rolę allelu C. Natomiast w przypadku polimorfizmu C-1196T receptora TLR4 stwierdzono znaczne różnice w częstości występowania genotypu CC między grupą chorych z AFL i kontrolną (p = 0,009*10-9). Rozkład genotypów C-1196T TLR4 u chorych z AC i w kontroli był niemal identyczny. Uzyskane w tej grupie wyniki nie pozwalają na jednoznaczną interpretację, co sugeruje konieczność kontynuacji badań na większej populacji.
Summary
In addition to environmental factors, diet, life style etc., genetic factors influence the susceptibility for alcoholic fatty liver and alcoholic cirrhosis. Clinical studies show that gut permeability for endotoxines from Gram-negative bacteria in patients chronically abuse alcohol, is increased. LPS interact with membrane receptors CD14 and TLR4 cause Kupffer cell activation and production of proinflammatory cytokines, which are critical in the AFL and AC. A C-159T polymorphism in the promotor region of CD14 gene confer increased CD14 expression on Kupffer cells and enhanced inflammatory response. Polymorphism C-1196T of TLR4 gene can also change the intracellular signalling pathway. In the present study we identified polymorphic wariants of CD14 and TLR4 genes in patients with alcoholic fatty liver (AFL), alcoholic cirrhosis (AC) and control group using the Real-Time PCR technique. For C-159T polymorphism of CD14 gene we found stastistically significant differences in the frequency of TT genotype in patients with AC and control (p = 0.008), suggesting the protective role of C allel. However, for C-1196T polymorphism of TLR4 gene we found significant differences in the frequency of CC genotype in patients with AFL and control (p = 0.009*10-9). Distribution of genotypes C-1196T of TLR4 receptor was almost identical in patients with AC and control group. The results obtained are not conclusive, suggesting the need continuation of tests repetition with the use of larger population.
WPROWADZENIE
Dane kliniczne wskazują, że tylko u około 10-30% osób nadużywających alkoholu rozwija się alkoholowe stłuszczenie (AFL – alcoholic fatty liver) i alkoholowa marskość wątroby (AC – alcoholic cirrhosis) (1). Poza nadmiernym spożywaniem etanolu również inne czynniki odgrywają znaczącą rolę w patogenezie tych schorzeń. Prawdopodobny wpływ na ich rozwój mają geny. Badania nad polimorfizmem różnych genów mogą wyjaśnić przyczynę i mechanizm rozwoju AFL i AC. Do genów mających związek z rozwojem tych schorzeń można zaliczyć m.in. geny kodujące receptory dla endotoksyn bakteryjnych (LPS – lipopolisacharyd): CD14 oraz jego ko-receptor TLR4.
Nadmierna konsumpcja etanolu powoduje zaburzenia w funkcjonowaniu i szczelności śluzówki jelit. Endotoksyny, np. LPS pochodzące ze ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych w większym stopniu przedostają się do krwi, a z nią do wątroby (2-4). LPS po przejściu przez śluzówkę jelita wiąże się z osoczowym białkiem wiążącym (LBP – lipopolysaccharide binding protein). Kompleks ten dociera do wątroby. Dochodzi do aktywacji komórek Kuppfera (KC – Kupffer cells) w wyniku interakcji z receptorami błony komórkowej: powierzchniowym CD14 i przezbłonowym TLR4 (2, 5). Receptor CD14 pośredniczy w rozpoznaniu endotoksyn przez TLR4. TLR4 aktywuje wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne, m.in. kaskadę NF-κβ (NF-κβ – nuclear factor-κβ), czego następstwem jest intensywna synteza wolnych rodników tlenowych, chemokin (IL-8) i cytokin prozapalnych, głównie TNF-α i TGF-β1, IL-1, IL-2, IL-6 (5-10, 20, 21).
Dane eksperymentalne i badania kliniczne dowodzą, iż w patogenezie AFL i AC uczestniczy nadmierna odpowiedź immunologiczna (4, 11-13). Również polimorfizm genów kodujących receptory biorące udział w rozpoznawaniu LPS i wywołaniu kaskady zapalnej może mieć wpływ na rozwój alkoholowego stłuszczenia i marskości wątroby. Jarvelainen i wsp. wykazali związek polimorfizmu C-159T receptora CD14 ze zwiększonym ryzykiem rozwoju alkoholowej choroby wątroby. Polimorfizm ten polega na zamianie allelu cytozynowego na tymidynowy w rejonie promotorowym genu w pozycji -159. W wyniku zamiany alleli C→T zwiększa się ekspresja CD14 na powierzchni komórek Kupffera, co w konsekwencji nasila odpowiedź zapalną (1, 12, 14-16). Ponieważ błonowy CD14 nie posiada części przezbłonowej, wymaga obecności ko-receptora. TLR4 jest ważnym partnerem CD14 w wywołaniu odpowiedzi immunologicznej. Odkryto dwa istotne polimorfizmy receptora TLR4, które mają wpływ na przezbłonową domenę receptora. Znana jest rola polimorfizmu Asp299Gly w osłabieniu sygnalizacji TLR4 w odpowiedzi na LPS, co w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia wydzielania cytokin prozapalnych, natomiast niejasna jest rola drugiego ważnego polimorfizmu: C-1196T (Thr399Ile) tego receptora (17-19).
Biorąc pod uwagę rolę endotoksyn, CD14 i TLR4 w wywołaniu reakcji zapalnej, w badaniu oznaczono warianty polimorficzne (SNiPs – single nucleotide polymorphisms) genów kodujących te receptory u pacjentów z alkoholowym stłuszczeniem i marskością wątroby w populacji polskiej.
MATERIAŁ I METODY
Charakterystyka pacjentów i izolacja DNA
Badanie zostało przeprowadzone w grupie pacjentów z rozpoznanym alkoholowym stłuszczeniem i alkoholową marskością wątroby oraz w grupie kontrolnej (zdrowi Honorowi Dawcy Krwi). Pod kątem polimorfizmu receptora CD14 przebadano 69 chorych z AFL, 70 z AC i 82 zdrowych krwiodawców. Polimorfizm receptora TLR4 oznaczono u 70 chorych z AFL, 68 z AC i 68 zdrowych.
DNA wyizolowano ze 100 μl mrożonej krwi obwodowej, używając standardowego zestawu firmy A&A Biotechnology zgodnie z protokołem izolacji (22).
Oznaczenie wariantów polimorficznych CD14 (rs2569190) i TLR4 (rs4986791)
Genotypowanie przeprowadzono za pomocą metody Real-Time PCR, używając termocyklera LightCycler® 480 firmy Roche oraz sond typu SimpleProbe firmy TIB MOLBIOL zgodnie z warunkami przedstawionymi w tabeli 1.
Tabela 1. Program RT-PCR do genotypowania CD14 (rs2569190) i TLR4 (rs4986791).
ProgramDenat.CyclingMeltingCooling
Parameter  
Analysis ModeNoneQuantificationMelting CurvesNone
Cycles14511
Segment11231231
Target [°C]9595607295407540
Hold [hh:mm:ss]00:10:0000:00:1000:00:1000:00:1500:00:3000:02:0000:00:0000:00:30
Ramp rate [°C/s]4,44,42,24,44,41,51,5
Acquisition modeNoneNoneSingleNoneNoneNoneContinu.None
Acquisitions [per [°C]      3 
Do oznaczenia genotypów wykorzystano analizę temperatury topnienia. Pozwoliło to rozróżnić heterozygoty, geny typu dzikiego i mutanty.
Analiza statystyczna

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu oraz innych artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 20 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

Piśmiennictwo
1. Jarvelainen HA, Orpana A, Perola M et al.: Promoter Polymorphism of the CD14 Endotoxin Receptor Gene as a Risk Factor for Alcoholic Liver Disease. Hepatology 2001; 33: 1148-1153.
2. Rao R: Endotoxemia and Gut barier dysfunction In alcoholic liver disease. Hepatology 2009; 50: 638-644.
3. Parlesak A, Schafer C, Schultz T et al.: Increased intestinal permeability to macromolecules and endotoxemia In patients with chronic alkohol abuse In diffrent sta ges of alkohol-induced liver disease. J Hepatol 2000; 32: 742-747.
4. Bode C, Kugler V, Bode JC: Endotoxemia In patients with alcoholic and non-alcoholic cirrhosis and its subjects with no evidence of chronic liver disease following acute alkohol excess. J Hepatol 1987; 4: 8-14.
5. Purohit V, Bode JC et al.: Alcohol, intestinal bacterial growth, intestinal premeability to endotoxin, and medical consequences: summary of a sympodium. Alcohol 2008; 42: 349-361.
6. Hines IN, Wheeler MD: Recent advances In alcoholic liver disease. Role of innate immune response In alcoholic hepatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 287: 310-340.
7. McClain CJ, Hill DB, Song Z et al.: Monocyte activation in alcoholic liver disease. Alcohol 2002; 27(1): 53-61.
8. O’Neill LA: The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: Signac transduction Turing inflammation and host defense. Sci STKE 2000; 44: re1.
9. Takeuchi O, Hoshino K, Kawai T et al.: Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of Gram-negative and Gram-positive bacteria cell Wall components. Immunity 1999; 11: 443-451.
10. Barnes PJ, Karin M: Nuclear factor-κβ: a pivotal transcription factor In chronic inflammatory diseases. N Engl J Med 1997; 336: 1066-1071.
11. Nanji AA, Khettry U, Sadrzadeh SM, Yamanaka T: Severity of liver injury In experimental alcoholic liver disease. Correlation with plasma andotoxin, prostaglandyn E2, leukotriene B4, and thromboxane B2. Am J Pathol 1993; 142: 367-373.
12. Su GL: Lipopolysaccharides In liver injury: molecular mechanisms of Kupffer cell activation. Am J Physiol Gastrointest liver Physiol 2002; 283: G256-G265.
13. Bauista AP: Impact of alkohol on the ability of Kupffer cells to pro duce chemokines amd its role In alcoholic liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2000; 15: 349-356.
14. Baldini M, Lohman IC, Halonen M et al.: A polymorphism* In the 5’ flanking region of the CD14 gene is associated with circulating soluble CD14 levels and with total serum immunoglobulin E. Am J Respir Cell Mol Biol 1999; 20: 976-983.
15. Hubacek JA, Rothe G, Pit’ha J et al.: C(-260)→T polymorphism In the promotor of the CD14 monocyte receptor gene as a risk factor for myocardial infarction. Circulation 1999; 99: 3218-3220.
16. Arroyo-Espliguero R, Avanzas P, Jeffery S, Kaski JC: Cd14 and Toll-like receptor 4: a link between infection and acute coronary events? www.heartjnl.com.
17. Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC: TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness In humans. Nat Genet 2000; 25: 187-191.
18. Ameziane N, Beillat T, Verpillat P et al.: Association of the Toll-like receptor 4 Asp299Gly polymorphism with acute coronary syndromes. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23: e61-64.
19. Graaf C, Kullberg BJ, Joosten L, et al.: Functional consequences of the Asp299Gly Toll-like receptor-4 polymorphism. Cytokine 2005; 30: 264-268.
20. Jarvelainen HA, Fang C, Ingelman-Sundberg M, Lindros KO: Effect of chronic coadministration of endotoxin and etanol on rat liver patology and proinflammatory and anti-inflammatory cytokines. Hepatology 1999; 29: 1503-1510.
21. Mathurin P, Deng QG, Keshavarzian A et al.: Exacerbation of alcoholic liver injury by enteral andotoxin In rats. Hepatology 2000; 32: 1008-1017.
22. Protokół izolacji dostępny na stronie: www.aabiot.com.
otrzymano: 2012-02-17
zaakceptowano do druku: 2012-03-15

Adres do korespondencji:
*Jacek Łukaszkiewicz
Katedra Biochemii i Chemii Klinicznej, Wydział Farmaceutyczny WUM
ul. Banacha 1a, 02-097 Warszawa
tel./fax: +48 (22) 572-07-35
e-mail: jacek.lukaszkiewicz@wum.edu.pl

Postępy Nauk Medycznych 3/2012
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych