漏 Borgis - Post阷y Fitoterapii 2/2016, s. 119-124
*Urszula Czy偶ewska, Wojciech Miltyk
Spektrometria mas w analizie sk艂adu propolisu
Mass spectrometry in analysis of chemical composition of propolis
Samodzielna Pracownia Analizy Lek贸w, Uniwersytet Medyczny w Bia艂ymstoku
Kierownik Pracowni: dr hab. n. farm. Wojciech Miltyk
Summary
Propolis is a honeybee product with a very complex chemical composition and a wide spectrum of pharmacological properties. The majority of propolis studies focus on the chemical composition of ethanolic extract of propolis (EEP) and its main polyphenols constituents such as flavonoids, chalcones, aromatic acids and its derivatives, terpenes, phenyl propanoids. Analysis of such complicated matrix requires implying analytical techniques capable to identify wide range of compounds with diverse physicochemical properties. Development of chromatographic and mass spectrometric methods enabled to determine variety of constituents of propolis.
This paper reviews present literature devoted to qualitative and quantitative analysis of propolis extracts by separation techniques coupled to mass spectrometry. The most frequently used types of analyzers and ionization techniques have been described according to their suitability for evaluation of propolis composition. The review summarizes the employment of GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry) and LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry) in the recent 12 years in analysis of the main flavonoids (pinocembrin, pinobanksin, chrysin, galangin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin, apigenin) and cinnamic acids (ferulic, caffeic, p-coumaric) in propolis extracts.
Ostatnie dziesi臋ciolecie by艂o okresem gwa艂townego rozwoju i zmian aparatury do spektrometrii mas (MS), kt贸re zwi臋kszy艂y mo偶liwo艣ci identyfikacyjne metod spektrometrycznych w r贸偶nych dziedzinach nauki. Najbardziej przydatne sta艂y si臋 jednak sprz臋偶enia spektrometr贸w mas z niekt贸rymi rodzajami chromatograf贸w, takie jak chromatograf gazowy (GC-MS) lub chromatograf cieczowy (LC-MS). Po艂膮czenie uk艂ad贸w GC-MS i LC-MS pozwoli艂o na stworzenie wi臋kszych mo偶liwo艣ci identyfikacyjnych wielu zwi膮zk贸w, poprzez wykorzystanie dodatkowo parametr贸w chromatograficznych, takich jak czas retencji oraz wyliczony eksperymentalnie indeks retencji (1, 2).
Propolis oraz wytworzone z niego produkty charakteryzuj膮 si臋 bogatym sk艂adem chemicznym. Liczne badania wskazuj膮 na obecno艣膰 oko艂o 300 sk艂adnik贸w, z czego oko艂o 240 zosta艂o zidentyfikowanych g艂贸wnie za pomoc膮 technik rozdzielczych po艂膮czonych ze spektrometri膮 mas (3-6). Analiza sk艂adu chemicznego propolisu wykaza艂a obecno艣膰 r贸偶nych grup zwi膮zk贸w chemicznych. Do najcz臋艣ciej identyfikowanych nale偶膮 zwi膮zki polifenolowe: flawonoidy, chalkony, kwasy aromatyczne oraz ich estry, terpeny, fenylopropanoidy, stilbeny oraz lignany (2, 5, 7-9). R贸偶norodno艣膰 sk艂adu chemicznego propolisu uwarunkowana jest rodzajem szaty ro艣linnej w miejscu zbioru oraz gatunkiem pszcz贸艂 zbieraj膮cych ten produkt (10-15). W Polsce i innych krajach europejskich g艂贸wnymi sk艂adnikami propolisu s膮 偶ywice (eksudaty) wydzielane przez p膮czki topoli czarnej (Populus nigra), topoli osiki (P. tremula) i brzozy brodawkowatej (Betula verrucosa) (15, 16).
Identyfikowanie sk艂adnik贸w tak r贸偶norodnej mieszaniny zwi膮zk贸w jak propolis jest z艂o偶onym zadaniem badawczym. Dzi臋ki po艂膮czeniu obu uzupe艂niaj膮cych si臋 technik – chromatografii i spektrometrii mas – mo偶liwym sta艂a si臋 identyfikacja struktur zwi膮zk贸w chemicznych wraz z ich analiz膮 ilo艣ciow膮. Chromatograf rozdziela z艂o偶on膮 mieszanin臋 na pojedyncze sk艂adniki, dostarczaj膮c parametr贸w chromatograficznych zar贸wno jako艣ciowych, jak i ilo艣ciowych. Z kolei spektrometria mas pozwala na okre艣lenie budowy strukturalnej badanych cz膮steczek (17).
Idea spektrometrii mas jest oparta na wytworzeniu jon贸w oznaczanego zwi膮zku chemicznego, a nast臋pnie na rozdziale utworzonych jon贸w w zale偶no艣ci od stosunku ich masy do 艂adunku (m/z) oraz detekcji. W zwi膮zku z tym, mo偶liwo艣ci stosowanego uk艂adu spektrometrycznego s膮 zale偶ne od trzech komponent贸w: 藕r贸d艂a jon贸w, analizatora mas oraz detektora.
殴r贸d艂a jon贸w
Generowanie jon贸w jest procesem, kt贸ry ma du偶e znaczenie w zakresie jako艣ci uzyskiwanych danych spektroskopowych. Wyb贸r zastosowanej metody jonizacji zale偶ny jest od w艂a艣ciwo艣ci fizykochemicznych oznaczanych zwi膮zk贸w (lotno艣ci, masy cz膮steczkowej, stabilno艣ci termicznej) oraz stopnia z艂o偶ono艣ci matrycy, w ramach kt贸rej jest analizowany (18). Metody jonizacji mo偶emy podzieli膰 na dwie grupy: te, kt贸re zachodz膮 w fazie gazowej, i pozosta艂e, kt贸re s艂u偶膮 do jonizacji niskolotnych i wielkocz膮steczkowych zwi膮zk贸w. Pierwsza grupa obejmuje jonizacj臋 elektronow膮 (EI) i jonizacj臋 chemiczn膮 (CI) – najbardziej rozpowszechnione sposoby jonizacji, kt贸re znalaz艂y zastosowanie w systemach GC-MS. Wymienione metody s膮 wykorzystywane do jonizacji zwi膮zk贸w wykazuj膮cych nawet nieznaczn膮 pr臋偶no艣膰 par przy ci艣nieniu oko艂o 10-6 tora i jednocze艣nie charakteryzuj膮cych si臋 trwa艂o艣ci膮 w temperaturze parowania (1). Do drugiej grupy mo偶emy zaliczy膰 ewaporacyjne sposoby jonizacji: termorozpylanie (TE), elektrorozpylanie (ESI), jonizacj臋 chemiczn膮 pod ci艣nieniem atmosferycznym (APCI) oraz oparte na desorpcji pr贸bki: bombardowanie szybkimi atomami (FAB) czy desorpcj臋 laserow膮 z udzia艂em matrycy (MALDI). Desorpcyjne metody jonizacji s膮 technikami, w kt贸rych substancje s膮 bezpo艣rednio emitowane w postaci jon贸w z powierzchni fazy skondensowanej do fazy gazowej.
Jonizacja strumieniem elektron贸w (EI) jest najstarsz膮 i najcz臋艣ciej stosowan膮 metod膮 w rutynowych analizach ma艂ocz膮steczkowych, hydrofobowych i stabilnych termicznie cz膮steczek (19). Z przegl膮du pi艣miennictwa wynika, 偶e jest to najcz臋艣ciej stosowana metoda jonizacji w analizie pr贸bek propolisu (tab. 1) w po艂膮czeniu z chromatografi膮 gazow膮. Cz膮steczki pr贸bki w fazie gazowej s膮 bombardowane elektronami o energii 70 eV, kt贸re nast臋pnie wybijaj膮 elektron z cz膮steczki, tworz膮c kationorodnik M[sup]+· nazywany jonem molekularnym (1). Nadmiar energii elektron贸w zostaje zu偶yty na zrywanie kolejnych wi膮za艅 kowalencyjnych w cz膮steczce. Jonizacja elektronowa jest nazywana „tward膮” ze wzgl臋du na generowanie licznych jon贸w fragmentacyjnych. Zalet膮 metody EI jest otrzymywanie wysoce powtarzalnych i charakterystycznych dla analizowanych zwi膮zk贸w widm mas. Przewidywalno艣膰 procesu fragmentacji badanych zwi膮zk贸w jest podstaw膮 do pe艂nego okre艣lania struktur za pomoc膮 spektrometrii mas. Z kolei powtarzalno艣膰 tego procesu przyczynia艂a si臋 do powstania i ci膮g艂ego rozbudowywania baz danych, zawieraj膮cych widma masowe, kt贸re zwi臋kszaj膮 mo偶liwo艣ci identyfikacyjne, m.in. w analizie sk艂adu propolisu.
Tab. 1. Przegl膮d metod oznaczania niekt贸rych sk艂adnik贸w propolisu
Oznaczane zwi膮zkiJonizacjaRozdzia艂 chromatograficzny i detekcjaPi艣miennictwo
Kwas p-kumarowyEIGC-MS(2, 8, 28-31)
ESI, APCILC-MS-MS, HPLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(20, 21, 24, 25, 32, 33)
Kwas ferulowyEIGC-MS(2, 8, 29-31)
ESI, APCILC-MS-MS, LC-Q-ToF, HPLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(20, 21, 24, 25, 34, 35)
Kwas kawowyEIGC-MS(2, 8, 29-31)
ESI, APCILC-MS-MS, HPTLC-MS, LC-Q-ToF, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(21, 24, 25, 32-35)
Ester fenyloetylowy kwasu kawowego (CAPE)EIGC-MS(2, 30)
ESILC-MS-MS, HPLC-MS(20, 21)
PinocembrynaEIGC-MS(2, 29-31)
ESILC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(20, 21, 24, 32, 33, 35)
PinobanksynaEIGC-MS(2, 29-31)
ESI, APCILC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(21, 24, 25, 32, 33, 35)
ChryzynaEIGC-MS, GCxGC-ToF-MS(8, 27, 28, 30, 31)
ESILC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(20, 21, 24, 32, 33)
GalanginaEIGC-MS(2, 30, 31)
ESILC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(21, 24, 32, 33)
KwercetynaEIGCxGC-ToF-MS(8, 28)
ESILC-MS-MS, HPTLC-MS, HPLC-IT(20, 21, 24, 32)
KemferolEIGC-MS(8, 30)
ESI, APCILC-MS-MS, HPLC-MS, HPLC-IT(21, 24, 25)
IzoramnetynaEIGC-MS, GCxGC-ToF-MS(28, 29)
ESILC-MS-MS, HPLC-IT(21, 24)
ApigeninaEIGC-MS, GCxGC-ToF-MS(2, 8, 28-30)
ESILC-MS-MS, HPTLC-MS, UPLC-MS, UPLC-Q-ToF-MS, HPLC-IT(21, 24, 32, 33)
Technika o nazwie elektrosprej, elektrorozpylanie (ESI), oparta jest na procesie utworzenia zawiesiny bardzo drobnych rozpylanych cz膮stek badanej substancji i odparowaniu rozpuszczalnika w celu jonizacji pr贸bki. Ewaporacyjne metody jonizacji s膮 bardzo wygodnym rozwi膮zaniem, szczeg贸lnie w po艂膮czeniu z chromatografem cieczowym. Znajduj膮 one szerokie zastosowanie w analizie sk艂adu propolisu (tab. 1). W metodzie ESI badany roztw贸r przep艂ywa przez kapilar臋 do 藕r贸d艂a jon贸w, gdzie przy wlocie rurki kapilarnej podlega dzia艂aniu bardzo silnego pola elektrycznego. Powoduje ono nebulizacj臋 pr贸bki na ma艂e, obdarzone 艂adunkiem kropelki. Elektrorozpylanie mo偶e nast臋powa膰 pod ci艣nieniem atmosferycznym w podwy偶szonych temperaturach (350-400°C) oraz przy udziale wy艂adowa艅 koronowych. W jonizacji chemicznej pod ci艣nieniem atmosferycznym (APCI) pr贸bka rozpylona z rurki kapilarnej przetwarzana jest w delikatn膮 mgie艂k臋 przy pomocy ogrzewanego nebulizera. Nast臋pnie zostaje ona porwana przez strumie艅 azotu i przemieszcza si臋 obok elektrody b臋d膮cej 藕r贸d艂em wy艂adowa艅 koronowych, gdzie ulega jonizacji. APCI znajduje zastosowanie do analizy mniejszych, termicznie stabilnych, polarnych i niepolarnych zwi膮zk贸w. Dane pi艣miennictwa wskazuj膮, 偶e najpowszechniejszym 藕r贸d艂em jonizacji w po艂膮czeniu z chromatografem cieczowym, zastosowanym w badaniach nad propolisem, jest elektrorozpylanie ESI (20-24).
Analizatory
Rozdzia艂 jon贸w w zale偶no艣ci od stosunku ich masy do 艂adunku (m/z) mo偶na osi膮gn膮膰 na wiele sposob贸w, m.in. za pomoc膮 oddzielnych p贸l magnetycznych i elektrycznych lub w wyniku ich interakcji. Znanych jest kilka rodzaj贸w analizator贸w. Najstarszym urz膮dzeniem rozpoczynaj膮cym er臋 spektrometrii mas by艂 przyrz膮d z sektorem magnetycznym. Stopniowy rozw贸j spektrometr贸w mas zaowocowa艂 w nowe rozwi膮zania technologiczne i przyczyni艂 si臋 do powstania analizator贸w charakteryzuj膮cych si臋: wi臋ksz膮 dok艂adno艣ci膮, wy偶sz膮 czu艂o艣ci膮, szerszym zakresem analizowanych mas i zdolno艣ci膮 do wyja艣niania struktur badanych zwi膮zk贸w. Pojawi艂y si臋 systemy oparte na analizatorze kwadrupolowym, pu艂apce jonowej, transformacji Fouriera oraz czasie przelotu. Efektywno艣膰 rozdzia艂u jon贸w w analizatorze mas zosta艂a zdefiniowana za pomoc膮 nast臋puj膮cych parametr贸w: dok艂adno艣ci pomiaru, zdolno艣ci rozdzielczej, zakresu mas, szybko艣ci skanowania oraz mo偶liwo艣ci zastosowania analizy tandemowej (19).
Analizator kwadrupolowy (Q) zbudowany jest z czterech cylindrycznych pr臋t贸w, kt贸re w przekroju poprzecznym tworz膮 kwadrat. Do pr臋t贸w przyk艂ada si臋 napi臋cie pr膮du sta艂ego oraz potencja艂 zmieniaj膮cy si臋 z cz臋sto艣ci膮 radiow膮. Jony s膮 przy艣pieszane pomi臋dzy 藕r贸d艂em jon贸w a analizatorem kwadrupolowym i pod wp艂ywem po艂膮czonych p贸l elektrycznych poruszaj膮 si臋 po z艂o偶onych trajektoriach (17). W warunkach wyindukowanego pola elektrycznego jedynie jony o okre艣lonej warto艣ci m/z maj膮 stabilny tor i s膮 w stanie dotrze膰 do ko艅ca kwadrupola, a nast臋pnie do detektora. Jony o innych warto艣ciach m/z poruszaj膮 si臋 niestabilnie, nieregularnie i trafiaj膮 poza kwadrupol. Z powodu filtruj膮cego dzia艂ania uk艂adu cz臋sto jest on nazywany kwadrupolowym filtrem mas. Mo偶liwo艣ci przyrz膮du kwadrupolowego ograniczaj膮 si臋 do rejestrowania mas w zakresie do 4000 m/z, a maksimum zdolno艣ci rozdzielczej to blisko 4000 (17). Kwadrupolowy filtr mas ma szereg zalet, charakteryzuje si臋 du偶膮 czu艂o艣ci膮 oraz efektywno艣ci膮 dzia艂ania w przypadku jon贸w o ma艂ej pr臋dko艣ci. Poza tym spektrometr kwadrupolowy jest trwa艂y, tani, o ma艂ych rozmiarach i mo偶e by膰 艂atwo 艂膮czony z szeregiem r贸偶nych uk艂ad贸w rozdzielczych. Liczne zalety przyrz膮du kwadrupolowego spowodowa艂y, 偶e jest on powszechnie wykorzystywany w analizie pr贸bek zawieraj膮cych propolis.
Analiza ekstrakt贸w propolisowych z u偶yciem analizatora kwadrupolowego obejmuje identyfikacj臋 sk艂adnik贸w propolisu oraz typow膮 analiz臋 ilo艣ciow膮. Z doniesie艅 pi艣miennictwa wynika, 偶e za pomoc膮 pojedynczego kwadrupola mo偶liwa jest identyfikacja szerokiego spektrum zwi膮zk贸w chemicznych obecnych w propolisie (2, 8, 25). Dotychczas wykonano badania preparat贸w farmaceutycznych zawieraj膮cych etanolowe ekstrakty z propolisu, kt贸re pozwoli艂y na wykrycie prawie 230 r贸偶nych sk艂adnik贸w. W badaniach zastosowano indeksy retencji w po艂膮czeniu z uzyskiwanymi widmami mas. Stwierdzono, 偶e w najwi臋kszej ilo艣ci wyst臋powa艂y polifenole, do kt贸rych zaliczono flawonoidy i chalkony, kwasy aromatyczne oraz ich estry. W analizowanych ekstraktach wskazano na obecno艣膰 wielu gliceryd贸w kwas贸w aromatycznych, kt贸rych udzia艂 by艂 na poziomie od 2,05 do 3,00%. Przeprowadzona analiza jako艣ciowa wskaza艂a na udzia艂 innych grup zwi膮zk贸w chemicznych: alkoholi i kwas贸w alifatycznych, hydroksykwas贸w, zwi膮zk贸w terpenowych, mono- i disacharyd贸w oraz polioli. Na podstawie uzyskanych profili fitochemicznych stwierdzono, 偶e 藕r贸d艂em ro艣linnym analizowanego propolisu by艂y topola czarna, osika oraz brzoza (2).
Liczne badania wskazuj膮, 偶e pojedynczy analizator kwadrupolowy jest odpowiednim narz臋dziem w analizie ilo艣ciowej zwi膮zk贸w chemicznych obecnych w propolisie. Marquez-Hernandez i wsp. (26) zaprezentowali metod臋 ilo艣ciowego oznaczenia triterpenoid贸w, m.in. lanosterolu, β-amironu, β-amiryny, lupeolu oraz germanikolu w pr贸bkach propolisu pochodz膮cego z Kuby. Wykazano, 偶e sumaryczna zawarto艣膰 triterpenoid贸w w 19 badanych pr贸bkach by艂a na poziomie od 2,4 do 19,2 μg w 100 μl ekstraktu. Inni autorzy dokonali ilo艣ciowego oznaczenia alergizuj膮cych sk艂adnik贸w propolisu, do kt贸rych zaliczono: estry benzylowe kwasu cynamonowego oraz ester benzylowy kwasu salicylowego. W ka偶dej z pi臋ciu analizowanych pr贸bek oznaczono ester benzylowy kwasu cynamonowego na poziomie 20-1025 μg/g oraz ester benzylowy kwasu salicylowego w ilo艣ci 15-80 μg/g. Uzyskane wyniki oznacze艅 por贸wnano z zawarto艣ci膮 niekt贸rych flawonoid贸w i kwas贸w cynamonowych w tych samych pr贸bach propolisu. Na podstawie przeprowadzonych bada艅 stwierdzono, 偶e zawarto艣膰 alergen贸w, w stosunku do sk艂adnik贸w aktywnych biologicznie, jest nieznaczna (8).
Badania wskazuj膮, 偶e kwadrupolowy filtr mas dobrze sprawdza si臋 w wykrywaniu nowych zwi膮zk贸w chemicznych w skompilowanej matrycy propolisu. Choudhari i wsp. (27) dokonali identyfikacji nowych zwi膮zk贸w chemicznych odpowiedzialnych za aktywno艣膰 biologiczn膮 propolisu.
Niewiele doniesie艅 pi艣miennictwa wskazuje na zastosowanie pu艂apki jonowej (IT) w analizie propolisu oraz jego sk艂adnik贸w. Pu艂apka jonowa jest typem spektrometru mas, w kt贸rym jony przechowuje si臋 w znajduj膮cej si臋 pod pr贸偶ni膮 komorze. Najprostszym sposobem dzia艂ania IT jest sekwencyjne wyrzucanie jon贸w (odpowiednio do warto艣ci ich masy) do detektora i rejestracja uzyskanego widma. Pu艂apka jon贸w jest rozszerzeniem uk艂ad贸w kwadrupolowych. Przyrz膮dy sk艂adaj膮 si臋 z trzech elektrod: jednej pier艣cieniowej o hiperbolicznej powierzchni wewn臋trznej, do kt贸rej przyk艂ada si臋 potencja艂 sinusoidalny o cz臋sto艣ci radiowej; pozosta艂e dwie elektrody zakrywaj膮ce znajduj膮 si臋 na obu ko艅cach elektrody pier艣cieniowej. Obie elektrody mog膮 dzia艂a膰 w trybie uziemionym z potencja艂em zerowym lub z przy艂o偶onym napi臋ciem sta艂ym lub zmiennym. Pu艂apki jonowe mog膮 by膰 stosowane na wiele sposob贸w, przy u偶yciu r贸偶nych potencja艂贸w lub uziemnie艅 pokrywy. Celem typowego dzia艂ania analizatora IT jest wytworzenie porcji jon贸w, uwi臋zienie ich, a nast臋pnie, przy zmiennym potencjale o cz臋sto艣ci radiowej, wywo艂anie ruchu jon贸w w kierunku detektora, zgodnie z ich warto艣ciami m/z. Nale偶y podkre艣li膰, 偶e w kwadrupolowym filtrze mas jony o niestabilnych trajektoriach nie s膮 rejestrowane, podczas gdy w IT jony nabieraj膮 niestabilnego ruchu, aby mog艂y wydosta膰 si臋 z pu艂apki i ulec detekcji (17).
Pu艂apka jonowa dzia艂a w takich samych warto艣ciach zakresu mas i zdolno艣ci rozdzielczej, jak kwadrupolowy filtr mas. Badania w pu艂apce jonowej charakteryzuj膮 si臋 bardzo du偶膮 czu艂o艣ci膮 i 艂atwo艣ci膮 wykonania, przy niskim koszcie analizy. Najwi臋ksz膮 zalet膮 takiego urz膮dzenia jest mo偶liwo艣膰 zastosowania tandemowej analizy, przy zastosowaniu jednego analizatora IT (1). Ten aspekt zosta艂 wykorzystany przez Pellati i wsp. (24), kt贸rzy zastosowali tandemow膮 analiz臋 w oparciu o pu艂apk臋 jonow膮. Oznaczono ilo艣ciowo zwi膮zki nale偶膮ce do polifenoli i flawonoid贸w: kwas cynamonowy, kawowy, p-kumarowy, kwercetyn臋, pinocembryn臋, chryzyn臋, kemferol, izoramnetyn臋 oraz apigenin臋. Z przeprowadzonego procesu walidacyjnego wyznaczono najmniejsz膮 warto艣膰 granicy oznaczalno艣ci LOQ dla kwasu kawowego – 2,68 μg/ml oraz najwi臋ksz膮 dla pinocembryny – 7,74 μg/ml. Autorzy zaproponowali opracowan膮 procedur臋 do oceny sk艂adu ilo艣ciowego polifenoli i flawonoid贸w w preparatach farmaceutycznych zawieraj膮cych propolis.
Ristivojevic i wsp. (22) wykorzystali pu艂apk臋 jonow膮 do identyfikacji licznych flawonoid贸w oraz ich po艂膮cze艅 glikozydowych w pr贸bkach propolisu pochodz膮cego z Serbii. W wyniku przeprowadzonego eksperymentu oznaczono 75 zwi膮zk贸w o strukturze fenolowej, do kt贸rych zaliczono: kwasy fenolowe i ich pochodne, flawonoidy, flawan-3-ole, flawonole, flawanonole, flawony, glikozydy, glicerydy oraz pochodne kwasu kawowego.
Podstawa dzia艂ania analizatora czasu przelotu (ToF) jest wzgl臋dnie prosta. Przyrz膮d oparty jest na czasie przelotu i rozdziela jony o r贸偶nych masach na podstawie ich r贸偶nych warto艣ci pr臋dko艣ci uzyskanych po przy艣pieszeniu przez przy艂o偶ony potencja艂 V. Na pocz膮tku drogi wszystkie jony maj膮 t臋 sam膮 energi臋 zeV = m?2/2, a jony o r贸偶nych masach m maj膮 r贸偶n膮 pr臋dko艣膰 ? = (2zeV/m)1/2. Je偶eli d艂ugo艣膰 analizatora zostanie okre艣lona jako L, a pr臋dko艣膰 wyra偶ona jako ? = L/t, to czas przelotu zostanie zdefiniowany nast臋puj膮cym wzorem: t = (L2m/2zeV)1/2, z kt贸rego 艂atwo oblicza si臋 mas臋 (m/z) jonu (1, 18). Zdolno艣膰 rozdzielcza linowych analizator贸w czasu przelotu jest rz臋du 20 000, co wynika z rozrzutu energii pocz膮tkowej przekazanej jonom. Do istotnych zalet analizatora ToF nale偶膮: szybki czas odpowiedzi, nieograniczony zakres analizowanych mas oraz wysoka czu艂o艣膰.
Gao i wsp. (28) zaproponowali spektrometr czasu przelotu do analizy jako艣ciowej i ilo艣ciowej sk艂adnik贸w propolisu i innych pr贸bek pochodzenia naturalnego. Identyfikacj臋 sk艂adnik贸w w matrycy prowadzono w oparciu o wyliczone indeksy retencji oraz widma masowe uzyskane w wyniku tandemowego sprz臋偶enia ToF-MS. Analizator czasu przelotu umo偶liwi艂 wykrycie nowych po艂膮cze艅 aglikon贸w flawonoidowych w propolisie. Dokonano ilo艣ciowego oznaczenia flawonoid贸w: epikatechiny, katechiny, chryzyny, tektochryzyny, kemferolu, kwercetyny, izoramnetyny, apigeniny oraz luteoliny. Autorzy zaproponowali ocen臋 jako艣ci propolisu na podstawie sumarycznej zawarto艣ci flawonoid贸w w pr贸bce. Propolis o procentowym udziale flawonoid贸w powy偶ej 17% kwalifikowano jako pr贸bki spe艂niaj膮ce wymogi wysokiej jako艣ci.
Moc dzia艂ania ka偶dego analizatora mo偶e by膰 zwi臋kszona poprzez zbudowanie integralnego systemu opartego o kilka analizator贸w – tego samego lub innego typu. Uk艂ady sprz臋偶one nosz膮 nazw臋 „tandemowej spektrometrii mas” (MS-MS). Typowy tandem MS-MS polega na wyodr臋bnieniu z jon贸w fragmentacyjnych jonu-prekursora, nast臋pnie jego samoistnej lub wymuszonej fragmentacji, z wytworzeniem jonu-produktu. Stosuj膮c metod臋 MS-MS, mo偶na jednoznacznie stwierdzi膰 obecno艣膰 analizowanego zwi膮zku w bardzo z艂o偶onej mieszaninie bez wst臋pnego oczyszczania, rozdzia艂u i izolacji badanej pr贸bki. Po艂膮czenie analizator贸w w tandemow膮 spektrometri臋 mas zosta艂o wykorzystane w analizie ilo艣ciowej zwi膮zk贸w biologicznie czynnych zawartych w pr贸bkach propolisu (20, 21, 24). Do najcz臋艣ciej wykorzystywanych uk艂ad贸w tandemowych nale偶膮 po艂膮czenia trzech analizator贸w kwadrupolowych, w kt贸rych pierwszy kwadrupol wyodr臋bnia okre艣lone jony do dalszej analizy, drugi dzia艂a jako komora zderze艅, a trzeci rozdziela jony-produkty, daj膮c widmo mas (1, 21). Warto zaznaczy膰, 偶e jeden analizator typu pu艂apka jonowa jest zdolny do przeprowadzenia analizy w tandemie MS-MS bez konieczno艣ci 艂膮czenia kilku analizator贸w; te mo偶liwo艣ci IT zosta艂y wykorzystane przy analizie sk艂adnik贸w propolisu (24).
Mo偶liwo艣ci tandemowej spektrometrii mas zosta艂y przedstawione przez Gardan臋 i wsp. (21), kt贸rzy oznaczyli ilo艣ciowo szereg zwi膮zk贸w polifenolowych i flawonoid贸w. Dokonano charakterystyki metody analitycznej, w kt贸rej uzyskano limity wykrywalno艣ci (LOD) r贸wne 0,8 μg/ml, limity oznaczalno艣ci (LOQ) na poziomie 2,0 μg/ml oraz wysok膮 powtarzalno艣膰 wynik贸w (RSD = 5,4%).
Podsumowanie
Spektrometria mas, w sprz臋偶eniu z technikami rozdzielczymi, znajduje szerokie zastosowanie w analizie sk艂adu propolisu oraz wytworzonych z niego produkt贸w, zar贸wno w analizie jako艣ciowej, w tym w identyfikacji nowych sk艂adnik贸w, jak i typowym oznaczeniu ilo艣ciowym. Z przegl膮du pi艣miennictwa wynika, 偶e najbardziej rozwini臋tym po艂膮czeniem chromatografii ze spektrometri膮 mas w analizie sk艂adu propolisu jest sprz臋偶enie w uk艂adzie GC-MS, kt贸re charakteryzuje si臋 wysok膮 czu艂o艣ci膮 oraz wszechstronno艣ci膮 zastosowa艅 (2, 8, 15, 23, 25, 26, 29, 36). Po艂膮czenie chromatografu gazowego ze spektrometrem mas jest bardzo wygodne ze wzgl臋du na przebieg analizy w fazie gazowej. Sk艂adniki rozdzielonej mieszaniny opuszczaj膮ce kolumn臋 chromatograficzn膮 z 艂atwo艣ci膮 przemieszczaj膮 si臋 do spektrometru mas, gdzie ulegaj膮 jonizacji i fragmentacji. Przyrz膮dy, oparte na po艂膮czeniu chromatografii cieczowej ze spektrometri膮 mas, nie osi膮gn臋艂y jeszcze takiego stopnia rzetelno艣ci wynik贸w, kt贸ry w codziennej rutynowej praktyce osi膮gaj膮 instrumenty GC-MS.
Urz膮dzenia LC-MS zyskuj膮 uznanie w przypadkach, kiedy mamy do czynienia z analiz膮 zwi膮zk贸w nielotnych lub termicznie nietrwa艂ych, takich jak glikozydy flawonoidowe (20, 22). Z kolei przygotowanie pr贸bek propolisu do analizy LC-MS jest cz臋sto 艂atwiejsze i nie wymaga w por贸wnaniu do metody GC-MS derywatyzacji. Po艂膮czenia chromatografu cieczowego ze spektrometrem tandemowym LC-MS-MS charakteryzuj膮 si臋 wysok膮 specyficzno艣ci膮 i du偶膮 czu艂o艣ci膮. W艂a艣nie z tego wzgl臋du nadaj膮 si臋 one do bada艅 jako艣ciowych i ilo艣ciowych wielosk艂adnikowych mieszanin, takich jak propolis (21).
Pi艣miennictwo
1. Silverstein RM, Webster FX, Kiemle DJ. Spectrometric identification of organic compounds. PWN, Warszawa 2007; 1-13. 2. Czy偶ewska U, Kono艅czuk J, Teul J i wsp. Verification of chemical composition of commercially available propolis extracts by gas chromatography-mass spectrometry analysis. J Med Food 2015; 18:584-91. 3. Bankova VS, Castro SL, Marcucci MC. Propolis: recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie 2000; 31:3-15. 4. Guo S, Fu S, Shen Z i wsp. Chemical composition, biological activity and application in animal science of propolis – a review. Adv Biomed Engin 2011; 98-101. 5. Huang S, Zhang C-P, Wang K i wsp. Recent advances in the chemical composition of propolis. Molecules 2014; 19:19610-32. 6. Toreti VC, Sato HH, Pastore GM i wsp. Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin. Evid Based Complement 2013; 2013:Article ID 697390, 13 pages. 7. Abu-Mellal A, Koolaji N, Duke RK i wsp. Prenylated cinnamate and stilbenes from Kangaroo Island propolis and their antioxidant activity. Phytochem 2012; 77:251-9. 8. Aliboni A, D’Andrea A, Massanisso P. Propolis specimens from different locations of central Italy: chemical profiling and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) quantitative analysis of the allergenic esters benzyl cinnamate and benzyl salicylate. J Agric Food Chem 2011; 59:282-8. 9. Fernandes-Silva CC, Salatino A, Salatino MLF i wsp. Chemical profiling of six samples of brazilian propolis. Quimica Nova 2013; 36:237-40. 10. Valencia D, Alday E, Robles-Zepeda RA i wsp. Seasonal effect on chemical composition and biological activities of Sonoran propolis. Food Chem 2012; 131:645-51. 11. Guo X, Chen B, Luo L i wsp. Chemical compositions and antioxidant activities of water extracts of Chinese propolis. J Agric Food Chem 2011; 59:12610-6. 12. Salatino A, Fernandes-Silva CC, Righi AA i wsp. Propolis research and the chemistry of plant products. Nat Prod Rep 2011; 28:925-36. 13. Christov R, Trusheva B, Popova M i wsp. Chemical composition of propolis from Canada, its antiradical activity and plant origin. Nat Prod Res 2006; 20:531-6. 14. Gardjeva PA, Dimitrova SZ, Kostadinov ID i wsp. A study of chemical composition and antimicrobial activity of Bulgarian propolis. Folia Med 2007; 49:63-9. 15. Maciejewicz W, Daniewski M, Dzido TH i wsp. GC-MS and HPLC analysis of phenolic acids extracted from propolis and from Populus nigra bud exudate. Chem Anal 2002; 47:21-30. 16. K臋dzia B. Pochodzenie propolisu w 艣wietle teorii i bada艅 naukowych. Herba Pol 2008; 54:179-86. 17. Johnstone RAW, Rose ME. Spektrometria mas. Wyd Nauk PWN, Warszawa 2001; 56-103, 131-69. 18. Lavagnini I, Magno F, Seraglia R i wsp. Quantitative application of mass spectrometry. John Wiley & Sons LTD, Atrium, Chichester 2006; 1-35. 19. Siuzdak G. The expanding role of mass spectrometry in biotechnology. MCC Press San Diego 2006; 1-48. 20. Falcao SI, Vale N, Gomes P i wsp. Phenolic profiling of Portuguese propolis by LC-MS spectrometry: uncommon propolis rich in flavonoid glycosides. Phytochem Anal 2013; 24:309-18. 21. Gardana C, Scaglianti M, Pietta P i wsp. Analysis of the polyphenolic fraction of propolis from different sources by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal 2007; 45:390-9. 22. Ristivojevic P, Trifkovic J, Gasic U i wsp. Ultrahigh-performance liquid chromatography and mass spectrometry (UHPLC-LTQ/Orbitrap/MS/MS) study of phenolic profile of Serbian poplar type propolis. Phytochem Anal 2015; 26:127-36. 23. Nunes CA, Guerreiro MC. Characterization of Brazilian green propolis throughout the seasons by headspace GC/MS and ESI-MS. J Sci Food Agric 2012; 92:433-8. 24. Pellati F, Orlandini G, Pinetti D i wsp. HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS/MS methods for metabolite profiling of propolis extracts. J Pharm Biomed Anal 2011; 55:934-48. 25. Chang R, Pilo-Veloso D, Morais SAL i wsp. Analysis of a Brazilian green propolis from Baccharis dracunculifolia by HPLC-APCI-MS and GC-MS. Braz J Pharmacogn 2008; 18:549-56. 26. Marquez-Hernandez I, Cuesta-Rubio O, Campo-Fernandez M i wsp. Studies on the constituents of yellow Cuban propolis: GC-MS determination of triterpenoids and flavonoids. J Agric Food Chem 2010; 58:4725-30. 27. Choudhari MK, Punekar SA, Ranade RV i wsp. Antimicrobial activity of stingless bee (Trigona sp.) propolis used in the folk medicine of Western Maharashtra. J Ethnopharmacol 2012; 141:363-7. 28. Gao X, Williams SJ, Woodman OL i wsp. Comprehensive two-dimensional gas chromatography, retention indices and time-of-flight mass spectra of flavonoids and chalcones. J Chromatogr A 2010; 1217:8317-26. 29. Isidorov VA, Szczepaniak L, Bakier S. Rapid GC/MS determination of botanical precursors of Eurasian propolis. Food Chemistry 2014; 142:101-6. 30. Markiewicz-Zukowska R, Car H, Naliwajko SK i wsp. Ethanolic extract of propolis, chrysin, CAPE inhibit human astroglia cells. Adv Med Sci 2012; 57:208-16. 31. Popova M, Silici S, Kaftanoglu O i wsp. Antibacterial activity of Turkish propolis and its qualitative and quantitative chemical composition. Phytomed 2005; 12:221-8. 32. Morlock GE, Ristivojevic P, Chernetsova ES i wsp. Combined multivariety data analysis of high-performance thin-layer chromatography fingerprints and direct analysis in real time mass spectra for profiling of natural products like propolis. J Chromatogr A 2014; 1328:104-12. 33. Szliszka E, Sokol-Letowska A, Kucharska AZ i wsp. Ethanolic extract of Polish propolis: chemical composition and TRAIL-R2 death receptor targeting apoptotic activity against prostate cancer cells. Evid Based Complement 2013; 2013:Aritcle ID 757628, 12 pages. 34. Restivo A, Degano I, Ribechini E i wsp. Development and optimisation of an HPLC-DAD-ESI-Q-ToF method for the determination of phenolic acids and derivatives. Plos One 2014; 9:e88762. 35. Kasote D, Ahmad A, Chen W i wsp. HPTLC-MS as an efficient hyphenated technique for the rapid identification of antimicrobial compounds from propolis. Phytochem Lett 2015; 11:326-31. 36. Witkiewicz Z, Ka艂u偶na-Czapli艅ska J. Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych. WNT, Warszawa 2012:119-32.
otrzymano: 2015-05-27
zaakceptowano do druku: 2015-11-10

Adres do korespondencji:
*Urszula Czy偶ewska
ul. Kili艅skiego 1, 15-089 Bia艂ystok
tel. +48 (85) 748-57-35
e-mail: urszula.czyzewska@umb.edu.pl

Post阷y Fitoterapii 2/2016
Strona internetowa czasopisma Post阷y Fitoterapii