Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 7/2008, s. 431-440
Joanna Matyjasik, Bartłomiej Masojć, *Grzegorz Kurzawski
Analizy molekularne DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych predyspozycji do nowotworów
DNA and RNA analyses in detection of genetic predisposition to cancer
Międzynarodowe Centrum Nowotworów Dziedzicznych Zakład Genetyki i Patomorfologii Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin
Kierownik Zakładu Genetyki i Patomorfologii: prof. dr hab. med. Jan Lubiński
Streszczenie
Pojawienie się w użyciu wielofunkcyjnych robotów laboratoryjnych umożliwiło wykorzystanie ich do izolacji DNA i RNA, normalizacji stężeń rozcieńczania badanych próbek, przygotowania reakcji PCR itp. Równoczesny rozwój oprogramowania i komputeryzacja sprawiły, że dzisiaj istnieje możliwość całkowitej automatyzacji procesu przechowywania, dobrze opisanych, łatwych do odnalezienie próbek i ich testowania, łącznie z transferem wyników. Obecnie czołowe firmy oferują sekwenatory umożliwiające jednoczesne sekwencjonowanie 96 próbek w oparciu o elektroforezę kapilarną produktów otrzymanych metodą cykliczną z użyciem dideoksynukleotydów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. Postęp w tej dziedzinie polegał na opracowaniu nowych żeli i „chemii” umożliwiających analizę sekwencji jednego fragmentu długości prawie 1000 zasad. Oferowane nowe aparaty (GSFLX machine 2007) oparte o równoczesne sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym bardzo wielu stosunkowo krótkich fragmentów DNA (około 200 zasad), wykorzystują pirosekwencjonowanie z detekcją luminescencji powstającej przy udziale ATP, lucyferazy lucyferyny. Aparaty te pozwalają na analizę 100 mln zasad jednego dnia.
Coraz częściej stosowane są metody PCR w czasie rzeczywistym z użyciem sond TaqMana (i modyfikacji tej metody zwanej w skrócie MGB). Do wykrywania rearanżacji w genach odpowiedzialnych za dziedziczne predyspozycje do nowotworów i innych chorób stosuje się technikę MLPA, która w oparciu o reakcję ligacji specyficznych sond i reakcję amplifikacji pozwala na ocenę liczby kopii eksonów. Na jej podstawie można wnioskować o delecjach bądź duplikacjach fragmentów lub całych genów. Oferowane gotowe zestawy sond dotyczą najważniejszych znanych genów silnie predysponujących do nowotworów takich jak: ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, APC, FANCA, FANCD2, PTCH, BMPR1A, SMAD4, TP53, CDH1, MEN1, NF1, NF2, STK11, SMARCB1, RB1, CDKN2A-CDKN2B, WT1.
Summary
Introduction of liquid handling robots made possible their application in DNA or RNA isolation, normalization of samples´ concentration, PCR preparation, etc. Parallel development of software and hardware enabled complete automatic management of large sample series in genetic testing, including data transfer without any user intervention. Nowadays leading companies offer capillary sequencers analyzing simultaneously up to 96 samples amplified by means of cycling sequencing with fluorescent dyes. Improved "chemistry” and gels´ composition enabled accurate sequencing of 1000 bp fragments. Another system (GSFLX machine 2007), based on massively parallel sequencing by synthesis technology can generate 100 Mb of genomic sequence in a single run (about 4.5 h). Real-time PCR techniques with TaqMan(r) probes (or TaqMan(r) MGB probes) have become commonly used in laboratory practice. MLPA technique used in detection of rearrangements in genes associated with hereditary cancers allows the determination of exon copy number. The presence of deletions or duplications of exons or whole genes can be analyzed by that method. Commercial kits are available for genes with a well-documented association with hereditary cancers: ATM, BRCA1, BRCA2, CHECK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, APC, FANCA, FANCD2, PTCH, BMPR1A, SMAD4, TP53, RB1, CDKN2A - CDKN2B, WT1, CDH1, MEN1, NF1, NF2, STK11, SMARCB1.
W ostatnich latach zidentyfikowano szereg genów, których mutacje odpowiedzialne są za wysoką dziedziczną predyspozycję do nowotworów (1).
U nosicieli mutacji tych genów ryzyko zachorowania na chorobę nowotworową może wynosić nawet 90%. Wybrane geny związane z wysoką genetyczną predyspozycją do nowotworów i najczęściej badane w praktyce lekarskiej zestawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Geny, których mutacje predysponują do zespołów nowotworów dziedzicznych. Zestawienie obejmuje geny najczęściej badane w naszym laboratorium.
GEN lokalizacjaPredyspozycja do nowotworówPenetracja*Liczba eksonów
Długość białka
Rb(2)siatkówczakok. 90%27 eksonów
13q14
BRCA1(3)sutek24 eksony, 2 transkrypty
17q21jajnikróżniące się pierwszym eksonem
BRCA2prostataok. 80%1863 aminokwasy
13qjelito grube27 eksonów
3418 aminokwasów
VHL(4)naczyniaki móżdżku,ok. 80%3 eksony
3p25-26siatkówki, rak nerki,213 aminokwasów
guzy nadnerczy
MSH2(5)rak jelita grubego,ok. 90%16 eksonów
2p22rak trzonu macicy,dla mężczyzn934 aminokwasy
MLH1rak żołądka, jelita cienkiegook. 70%19 eksonów
3p22-23nerki i pęcherza moczowego,dla kobiet (6)756 aminokwasów
przewodów żółciowych,
MSH6jajników10 eksonów
2p161361 aminokwasów
*prawdopodobieństwo zachorowania w ciągu życia na nowotwór u nosiciela mutacji
Opracowano szereg metod molekularnych, które pozwalają na wykrywanie mutacji. Można je podzielić na metody wykrywania:
I) nieznanych mutacji,
II) znanych mutacji/polimorfizmów.
I. Wykrywanie nieznanych mutacji
Zastosowanie technik wchodzących w skład tych metod w odpowiednio dobranych pod względem cech rodowodowo-klinicznych przypadkach jest w praktyce lekarskiej uzasadnione mimo tego, że techniki te jak dotychczas są złożone, pracochłonne i kosztowne.
Techniki bezpośredniego wykrywania nosicielstwa mutacji
Analizy DNA
Zasadnicze rodzaje analiz:
a) izolacja DNA
b) amplifikacja fragmentów genów, z reguły sekwencji kodujących
c) wstępne wykrywanie zaburzeń w produktach amplifikacji technikami przesiewowymi
d) sekwencjonowanie
e) metoda Southerna i zależna od ligacji multipleksowa amplifikacja sond.
Izolacja DNA
Materiał do izolacji DNA stanowią na ogół komórki łatwo dostępne takie jak leukocyty z krwi obwodowej lub rzadziej bioptaty innych tkanek. W trakcie analiz wykrywana jest mutacja konstytucyjna, a więc obecna we wszystkich komórkach pacjenta. Materiał do badania najlepiej pobrać bezpośrednio przed izolacją, ale dobre wyniki uzyskuje się również po kilkudniowym przechowywaniu krwi w temperaturze pokojowej lub nawet przez kilka lat w temperaturze poniżej zera. Jeżeli nie dysponujemy tkankami świeżymi to izolację DNA można wykonać z tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w bloczkach parafinowych, chociaż uzyskanie jednoznacznych wyników z takiego materiału jest trudne, niekiedy wręcz niemożliwe. Izolowanie DNA polega na usunięciu białek z lizatu komórkowego. W metodzie fenolowo-chloroformowej uzyskuje się to poprzez trawienie proteinazą K i ekstrakcję w mieszaninie fenolu i chloroformu. Z odbiałczonych w ten sposób próbek kwasy nukleinowe wytrąca się alkoholami: etylowym lub izopropylowym. Mało kto dzisiaj w codziennej pracy używa tej czasochłonnej i toksycznej, choć dającej czyste i nie zdegradowane DNA metody (jest ona nadal stosowana jednynie do izolacji DNA z „bloczków parafinowych”). Zastąpiły ją inne mniej pracochłonne metody, które łatwiej poddają się procesowi automatyzacji, a są oparte na wybiórczym wiązaniu DNA z nośnikiem (złoże chromatograficzne, filtr bądź kuleczki magnetyczne) następnie odmyciu zanieczyszczeń i uwolnieniu DNA do roztworu.
Amplifikacja fragmentów genów
W tej analizie powielane są fragmenty badanego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimeryzacji(PCR). W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą: matryca DNA (zwykle genomowe DNA), polimeraza DNA, para specyficznych starterów („primers”), trójfosforany deoksyrybonukleotydów oraz bufor reakcyjny. Mieszanina ta poddawana jest w specjalnym termostacie cyklicznym zmianom temperatury. Każdy cykl składa się z trzech etapów: denaturacji, przyłączania starterów i syntezy. Po 22 cyklach, przy 100% wydajności, liczba kopii powielanego fragmentu zwiększa się milion razy.
Wstępne wykrywanie zaburzeń w produktach amplifikacji technikami przesiewowymi
Niegdyś popularną techniką wstępnego wykrywania zaburzeń w produktach amplifikacji było badanie zmian konformacji jednoniciowego DNA – SSCP (single stranded conformational polymorphism) (2).
Inne techniki tego rodzaju to analiza heterodupleksów – HET (heteroduplex analysis) (3), chemiczne rozszczepianie niesparowań heterodupleksów – CMC (chemical mismatch cleavage) (4), DHPLC(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) (5) i elektroforeza na żelach z gradientem czynnika denaturującego – DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) (6).
DHPLC – wysokosprawna denaturująca chromatografia cieczowa
Najlepszą i najczęściej używaną techniką wstępnego wykrywania zmian jest obecnie DHPLC (5, 7, 8, 9, 10). Jest to odmiana HET wykorzystująca wysoką rozdzielczość nowoczesnych wypełnień kolumn chromatograficznych. Rozdział analizowanych fragmentów DNA przeprowadzany jest w gradiencie czynnika denaturującego. W warunkach subdenaturacyjnych heterodupleksy wykazują mniejsze powinowactwo niż homodupleksy do złoża kolumny i łatwiej ulegają wymyciu. Całość rozdziału monitorowana jest przez miernik absorbancji mierzonej przy 260 nm. Profil elucji (ryc. 1) jest charakterystyczny i powtarzalny dla danej zmiany i pozwala na odróżnienie nowych zmian od wcześniej wykrytych mutacji bądź polimorfizmów.
Ryc. 1. Profil elucji DHPLC charakterystyczny (przerywana linia) dla mutacji A na G w eksonie 19 genu MLH1.
Z danych literaturowych (11) i badań własnych (12) wynika, że DHPLC łączy zalety dotychczas stosowanych metod. Czułość metody sięga 100% (5, 9, 10) przy stosunkowo niskich kosztach (koszt odczynników najwyżej 20 złotych na próbkę) jest ona szybka, a przy zastosowaniu „autosamplera” pozwala wykonać analizę 200 próbek na dobę.
Sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie jest najbardziej czułą techniką wykrywania zmian w materiale genetycznym umożliwiającą jednocześnie ich pełną charakterystykę. W ostatnich latach znaczny postęp w technologii sekwencjonowania osiągnięto poprzez wprowadzenie automatycznych aparatów do sekwencjonowania, których funkcjonowanie oparte jest o fluorescencję wzbudzaną laserem. Każdy z nukleotydów (A, C, G, T) może być wyznakowany innym fluorochromem (ryc. 2). Najbardziej dogodną techniką jest sekwencjonowanie metodą cykliczną (13). W trakcie badania oceniane są sekwencje produktów PCR obu nici DNA. Rzeczywista zmiana w odróżnieniu od artefaktów wykrywana jest w obu niciach (ryc. 3). Procedura sekwencjonowania składa się z kilku etapów:
Ryc. 2. Obraz żelu sekwencyjnego – wynik rozdziału asymetrycznego PCR (nukleotyd adeninowy wyznakowany fluorochromem zielonym; tymidynowy żółtym; guanidynowy niebieskim; cytozynowy czerwonym).
Ryc. 3. Wstępna analiza sekwencji z wykrytą zmianą w obrębie eksonu 18 genu MLH1.
1) preparatywnego PCR – polegającego na namnożeniu wybranego fragmentu genu przy użyciu pary specyficznych starterów;
2) asymetrycznego PCR – dla każdej próbki amplifikacja osobno z każdym ze starterów z zastosowaniem dideoksynukleotydów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi;
3) elektroforezy na denaturującym żelu poliakrylamidowym z równoczesną detekcją i rejestracją przepływających produktów;
4) analizy otrzymanych wyników przy użyciu pakietu programów komputerowych.
Podczas asymetrycznego PCR powstają wszystkie możliwe, różniące się długością oligonukleotydy komplementarne do matrycy i zawierające na 3´-końcu fluorochrom („zaznaczone kolorem”). Zostają one rozdzielone podczas elektroforezy od najkrótszego po najdłuższy, a kolejność kolorowych nukleotydów odczytana jako sekwencja komplementarna do matrycy. Stwierdzana sekwencja DNA jest później porównywana z sekwencją prawidłową z dostępnych baz danych takich jak GenBank i EMBL. Przez porównanie z sekwencjami prawidłowymi określany jest dokładnie charakter zmiany (ryc. 3 i 4).
Ryc. 4. Zmiany mapy restrykcyjnej i sekwencji aminokwasów w białku spowodowane mutacją w eksonie 18 genu MLH1. Mutacja prowadzi do utraty miejsc restrykcyjnych dla Bca I, Cfo I, Hha I, HinP I oraz pojawienia się miejsca restrykcyjnego dla Cvi R I, co łatwo można wykorzystać do jej wykrywania.
Obecnie czołowe firmy oferują sekwenatory umożliwiające jednoczesne sekwencjonowanie 96 próbek w oparciu o elektroforezę kapilarną produktów otrzymanych metodą cykliczną z użyciem dideoksynukleotydów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. Postęp w tej dziedzinie polegał w ostatnich latach nie tylko na zwiększeniu liczby jednocześnie analizowanych próbek, ale na opracowaniu nowych żeli (umożliwiających wielokrotny rozdział na tym samym wypełnieniu kapilary) i „chemii” (mieszaniny złożonej z buforów; substratów, polimerazy i tak zwanych ulepszaczy) umożliwiających analizę sekwencji jednego fragmentu długości prawie 1000 zasad.
Oferowane są też nowe aparaty GSFLX machine 2007oparte o równoczesne sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym przez syntezę równoczesną bardzo wielu stosunkowo krótkich fragmentów DNA (około 200 zasad). Wykorzystują one pirosekwencjonowanie z detekcją luminescencji powstającej z rozkładu ATP. Aparaty te pozwalają na analizę 100 mln zasad jednego dnia. Pirosekwencjonowanie (14) jako matrycę wykorzystuje jednoniciowy fragment DNA, na którym przeprowadzana jest synteza nici komplementarnej poprzez dodawanie kolejno czterech różnych trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP). Przyłączeniu każdej zasady towarzyszy uwalnianie pirofosforanu, który zostaje przekształcony w ATP przy udziale sulfurylazy i obecnego w mieszaninie adenozyno-5´fosfosiarczanu. Powstały ATP wykorzystywany jest przez lucyferazę do przekształcenia lucyferyny w oksylucyferynę. W reakcji tej powstaje światło w ilości odpowiadającej wyprodukowanemu we wcześniejszym etapie pirofosforanowi. Światło to jest rejestrowane przez kamerę CCD i przekształcane do postaci piku na wykresie. Ten sam schemat reakcji przeprowadzany jest również dla kolejno dodawanych różnych dNTPów. Jeżeli dodawany nukleotyd nie jest komplementarny do matrycy nie następuje włączenie go do nowo syntetyzowanej nici i nie powstaje pirofosforan. Tylko obecność sygnału świetlnego stanowi podstawę do zapisu w sekwencji kolejnego dodawanego nukleotydu.
Mutacje w DNA obejmujące miejsca przyłączania starterów lub inne odcinki poza regionami amplifikowanymi nie są wykrywane za pomocą testów DNA opartych o analizy omówione powyżej. Część takich zmian to duże przemieszczenia.
Metoda Southerna i zależna od ligacji multitpleksowa amplifikacja sond
Jedną z technik, kiedyś powszechnie używaną do wykrywanie dużych przemieszczeń opartą o hybrydyzację jest opisana po raz pierwszy przez E.M. Southerna w 1975 r. i odtąd zwana metodą Southerna (Southern bloting).
Współcześnie metodą godną polecenia, która niemal całkowicie zastąpiła metodę Southerna w wykrywania rearanżacji w genach jest zależna od ligacji multitpleksowa amplifikacja sond ( MLPA – multiplex ligation-dependent probe amplification) (15). Technika ta w oparciu o reakcję ligacji specyficznych sond i reakcję amplifikacji pozwala na ocenę liczby kopii eksonów. Na jej podstawie można wnioskować o delecjach bądź duplikacjach fragmentów lub całych genów (geny odniesienia jako kontrola). W technice tej stosuje się wiele par sond. Sondy zawierają oprócz sekwencji docelowych komplementarnych do sekwencji eksonowych (sekwencje ulegające hybrydyzacji), sekwencje starterowe, a jedna z każdej pary dodatkowo unikatową sekwencję wstawki (ryc. 5).
Ryc. 5. Budowa sond w MLPA.
Sekwencje hybrydyzujące każdej pary sond wiążą się komplementarnie do sąsiadujących ze sobą fragmentów DNA i tylko przy w pełni komplementarnej hybrydyzacji może zajść ligacja (ryc. 6).
Ryc. 6. Hybrydyzacja i ligacja sond.
Po przyłączeniu sond do matrycy następuje ich ligacja, a następnie denaturacja. Oddysocjowana zligowana sonda zawierająca sekwencje startowe zostaje poddana amplifikacji w reakcji PCR. Obecność różnej długości wstawek pozwala na rozróżnienie produktów skierowanych na różne cele, a ilość produktu jest proporcjonalna do ilości sekwencji matrycowej. Każdy pik odpowiada produktowi amplifikacji zligowanej specyficznej pary sond (ryc. 7).
Ryc. 7. Wynik elektroforezy próby kontrolnej.
Różnice względne w wysokości bądź powierzchni piku wskazują na zmiany ilościowe (bądź czasami jakościowe) docelowej sekwencji sondy (ryc. 8).
Ryc. 8. Wynik elektroforezy próby badanej wskazujący na delecję eksonu 13.

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2008-04-23
zaakceptowano do druku: 2008-05-15

Adres do korespondencji:
*Grzegorz Kurzawski
Międzynarodowe Centrum Nowotworów Dziedzicznych. Zakład Genetyki i Patomorfologii, Pomorska Akademia Medyczna
ul. Połabska 4, 70-115 Szczecin
tel.: (0-91) 466-15-32
e-mail: gkurz@sci.pam.szczecin.pl

Postępy Nauk Medycznych 7/2008
Strona internetowa czasopisma Postępy Nauk Medycznych