Artykuły w Czytelni Medycznej o SARS-CoV-2/Covid-19

Chcesz wydać pracę doktorską, habilitacyjną czy monografię? Zrób to w Wydawnictwie Borgis – jednym z najbardziej uznanych w Polsce wydawców książek i czasopism medycznych. W ramach współpracy otrzymasz pełne wsparcie w przygotowaniu książki – przede wszystkim korektę, skład, projekt graficzny okładki oraz profesjonalny druk. Wydawnictwo zapewnia szybkie terminy publikacji oraz doskonałą atmosferę współpracy z wysoko wykwalifikowanymi redaktorami, korektorami i specjalistami od składu. Oferuje także tłumaczenia artykułów naukowych, skanowanie materiałów potrzebnych do wydania książki oraz kompletowanie dorobku naukowego.

Poniżej zamieściliśmy fragment artykułu. Informacja nt. dostępu do pełnej treści artykułu tutaj
© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2013, s. 76-84
*Robert Kubina, Agata Kabała-Dzik, Beata Bielec, Katarzyna Smolarz, Barbara Stawiarska-Pięta, Ewa Szaflarska-Stojko
Ocena właściwości cytotoksycznych etanolowego ekstraktu z propolisu w stosunku do komórek raka okrężnicy HCT 116
Evaluation of cytotoxic activity of ethanol extract of propolis in human colon cancer cell line HCT 116
Katedra i Zakład Patologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Katowice
Kierownik Katedry i Zakładu: dr hab. n. med. Barbara Stawiarska-Pięta
Summary
Numerous researches showed that propolis exhibits many healing properties. Not only has it antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant, immunoprotective and hepatoprotective activities, but also anti-proliferative and cytotoxicity ones. The aim of this study was to evaluate total polyphenolic content and in vitro cytotoxic activity of ethanol extract of propolis depending on geographic location from where the propolis was derived and EEP concentrations used on HCT 116 colon cancer cells in in vitro tests.
Propolis samples were collected from different geographical locations in Poland. Propolis was characterized by polyphenolic content and flavonoids. A solution of ethanol extract of propolis in dimethyl sulfoxide was used as a material for the research. Ethanol from the extraction of propolis was removed by vaporization under vacuum. Cytotoxicity was evaluated by means of the MTT and LDH assays.
The cytotoxic effect of EEP at concentrations of 3.125-100 μg/ml after a 24-h incubation was from 1.11 % to 22.96% cell death. When EEP at concentration of 100 μg/ml was used, cytotoxicity amounted to 22.96%; 19.31% and 14.84% respectively for propolis from Kamianna, Łomża Landscape Park and Korbielów.
The results showed that in the case of the extract of propolis could inhibit cell growth of HCT 116 cell line. Ethanol extract of propolis from Poland obtained in the study exhibits cytotoxicity activity in colorectal carcinoma cells in vitro. MTT assay demonstrated that anti-proliferative properties of ethanol extract of propolis are dependent on the applied concentration and geographical locations.
Wstęp
Rosnące zainteresowanie niekonwencjonalnymi metodami leczenia wykorzystywanymi przez wieki sprawia, że propolis staje się coraz bardziej popularnym preparatem, stosowanym zarówno w leczeniu schorzeń miejscowych, jak i chorób wewnętrznych, których leczenie tradycyjną farmakoterapią wydaje się być nieskuteczne. Bogactwo składu substancji biologicznie czynnych w produktach pszczelich spowodowało, że znalazły one zastosowanie w wielu specjalnościach medycyny, gdzie stosowanie ich przynosi wymierne korzyści. Przykładem może być leczenie ropnych zapaleń skóry, odleżyn, nadżerek, stanów zapalnych pochwy, stanów zapalnych górnych dróg oddechowych oraz owrzodzeń błony śluzowej górnego odcinka przewodu pokarmowego i wiele innych. Zastosowanie propolisu w leczeniu chorób wewnętrznych jest do dnia dzisiejszego niedoceniane. Pozytywne efekty leczenia uzyskano u osób z chorobami układu krążenia, układu oddechowego, układu pokarmowego, a także u chorych ze schorzeniami reumatycznymi.
Propolis jest jednym z najlepiej poznanych produktów pszczelich. Słowo propolis pochodzi z języka greckiego i oznacza w dosłownym tłumaczeniu “przedmurze miasta”. Propolis jest materiałem budulcowym, będącym spoiwem, służącym zarówno do przytwierdzania plastra do ścian ramek, jak też naprawy wszelkich uszkodzeń ula. Pszczoły formują z kitu pszczelego rodzaj progu, przez który przechodzi każdy mieszkaniec ula. To swoiste „przedmurze” odpowiedzialne jest za ochronę przed wprowadzeniem bakterii oraz grzybów chorobotwórczych do wnętrza ula, gdzie znalazłyby one dogodne warunki do wzrostu, prowadząc do całkowitego wymarcia rodziny pszczelej.
Propolis jest bezpostaciową, żywicowatą, lepką substancją, produkowaną przez pszczoły, stanowiącą połączenie woskowatej wydzieliny owadów z żywicą zebraną z roślin. Wykazuje on charakterystyczny cierpki, gorzki i piekący smak. Barwa propolisu jest różnorodna – od czarnej, brązowej, poprzez czerwoną, żółtą po zieloną. Skład chemiczny propolisu jest niezwykle złożony. Zawiera około 300 różnych substancji chemicznych. Polski propolis pochodzi przede wszystkim z pączków liściowych topoli czarnej (Populus nigra), a także z brzozy (Betula) oraz olchy (Alnus) (1-3).
Liczne badania naukowe wykazały, że propolis wykazuje wiele cennych, leczniczych właściwości: działa przeciwbakteryjnie, przeciwgrzybiczo (4-6), przeciwpasożytniczo (7, 8), przeciwwirusowo (9), przeciwhepatotoksycznie (10), przeciwzapalnie (11), przeciwutleniająco (12), kardioochronnie (13), miejscowo znieczulająco (14), przeciwcukrzycowo (15), przeciwmutagennie (16). Coraz częściej także w literaturze fachowej można odnaleźć informacje na temat przeciwnowotworowego działania kitu pszczelego. Istotnym działaniem propolisu z tego punktu widzenia jest jego aktywność antyproliferacyjna, cytotoksyczna oraz proapoptotyczna w stosunku do komórek nowotworowych (17-19). Prowadzone badania eksperymentalne mają na celu potwierdzenie sposobu działania przeciwnowotworowego oraz poznanie jego dokładnego mechanizmu. Dziś wiadomo, że substancjami, którym przypisuje się działanie przeciwnowotworowe, są flawonoidy (głównie apigenina, luteolina, galangina) oraz estry kwasów fenolowych (w szczególności estry kwasu kawowego oraz ferulowego). Najwyższą aktywność przeciwnowotworową wykazuje ester fenyloetylowy kwasu kawowego. Jego mechanizm nie jest do końca poznany, wiadomo jednak, że zapobiega on wbudowywaniu tymidyny do łańcucha DNA komórek nowotworowych, przez co uniemożliwia on ich proliferację. W licznych badaniach in vitro propolis oraz jego poszczególne składniki biologicznie czynne wykazywały aktywność cytotoksyczną w stosunku do różnych typów komórek nowotworowych, takich jak komórki raka krtani, płuc, trzustki, tarczycy, jelita grubego, sutka, prostaty, a także w stosunku do komórek glejaka złośliwego.
Bufalo i wsp. (20) w badaniach in vitro opisali efekt cytotoksyczny zielonego brazylijskiego propolisu w stosunku do komórek raka krtani HEp-2. Wykazali oni, że jedynie niskie stężenia etanolowego ekstraktu propolisu wywoływały długoterminowy, stały efekt cytotoksyczny. Natomiast wyższe stężenia EEP, dodawane do komórek nowotworowych, działały krótkotrwale. Ponadto zauważyli oni, że aktywność ta jest wynikiem synergizmu substancji chemicznych zawartych w propolisie.
Badania Lee i wsp. (21) wykazały, że ester fenyloetylowy kwasu kawowego (CAPE, ang. caffeic acid phenethyl ester) działa cytotoksycznie w stosunku do linii komórkowej szczurzego glejaka C6. W badaniach tych oreślono bardzo szczegółowy mechanizm działania CAPE. Stwierdzono, że powoduje on uwolnienie cytochromu c z mitochondrium do cytozolu oraz aktywację kaspazy-3, jak również aktywację białek proapoptotycznych z rodziny Bcl-2. Jednoznacznie potwierdzono aktywację mechanizmów biochemicznych prowadzących do kontrolowanej śmierci komórek – apoptozy, w wyniku zastosowania CAPE w stosunku do komórek badanej linii.
Cel pracy
Celem prezentowanej pracy była ocena właściwości cytotoksycznych propolisu w zależności od miejsca pozyskania, jak również użytych stężeń EEP w stosunku do komórek raka okrężnicy HCT 116 w badaniach in vitro.
Materiał i metody
Materiał do badań
Materiał do badań stanowiły próbki propolisu pozyskane od pszczół z pasiek zlokalizowanych w:
– Kamiannej, w powiecie nowosądeckim (P1),
– Łomżyńskim Parku Krajobrazowym Doliny Narwi (P2),
– Korbielowie w powiecie żywieckim (P3).
Aktywność przeciwnowotworową etanolowego ekstraktu propolisu (EEP, ang. ethanol extract of propolis) oceniono przy użyciu linii komórkowej raka jelita grubego (okrężnicy) HCT 116 pochodzącej z kolekcji ATCC.
Otrzymywanie etanolowego ekstraktu z propolisu
Próbki propolisu poddano ekstrakcji etanolem. Po mechanicznym rozdrobnieniu 10 g surowego kitu pszczelego dodawano do kolb okrągłodennych zawierających 100 g 75% etanolu. Szczelnie zamknięte kolby umieszczono na wytrząsarce na okres dwóch tygodni w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła. Po tym czasie ekstrakty chłodzono w temp. 4°C przez 24 godz. w celu usunięcia wszystkich substancji nierozpuszczalnych w etanolu. W kolejnym etapie ekstrakty sączono pod zmniejszonym ciśnieniem przy użyciu sączka filtracyjnego standardowego nr 4 (Whatman Grade No. 4 Filter Paper). Uzyskany filtrat odparowano za pomocą wyparki próżniowej w temperaturze 40°C. W ten sposób w kolbach okrągłodennych (o znanej masie) otrzymano ciągliwą substancję koloru brązowego, która zawierała nieznaczne ilości rozpuszczalników – etanolu i wody. W następnym etapie umieszczono otrzymane ekstrakty w cieplarce na okres 7 dni w celu odparowania pozostałości rozpuszczalników. Po tym czasie otrzymano suchą masę koloru ciemnobrązowego, która posłużyła do sporządzenia roztworów roboczych. W tym celu EEP rozpuszczono w dimetylosulfotlenku, otrzymując roztwór EEP o stężeniu 51,2 mg/ml (EEPDMSO).
Analiza składu polifenoli oraz flawonoidów w badanych próbkach EEP
Całkowitą zawartość polifenoli w próbkach propolisu określono stosując metodę kolorymetryczną z odczynnikiem fenolowym Folin-Ciocalteu. Mieszaninę referencyjną stanowiła pinocembryna oraz galangina w stosunku wagowym 2:1, przygotowana metodą seryjnych rozcieńczeń (od 0,021 do 0,335 mg/ml). Posłużyła ona do wykonania krzywej kalibracyjnej. 1 ml roztworu badanego przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 ml, zawierającej 15 ml wody destylowanej. Następnie dodano 4 ml odczynnika Folin-Ciocalteu i 6 ml 20% roztworu węglanu sodu. Całość doprowadzono wodą destylowaną do objętości 50 ml. Absorbancję mierzono po 2 godz. przy długości fali λ=760 nm.
Całkowitą zawartość flawonoidów określano przez kwantyfikację flawonów/flawonoli i flawanonów/dihydroflawonoli. Roztwory standardowe galanginy (0,04 mg/ml) dla flawonów /flawonoli i pinocembryny (1 mg/ml) dla flawanonów/dihydroflawonoli zostały przygotowane w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej. Przygotowano serię pięciu rozcieńczeń galanginy w stężeniach od 0,005 do 0,04 mg/ml oraz pinocembryny w stężeniach od 0,1 do 0,8 mg/ml.
Próbkę 1 ml badanego roztworu i 0,5 ml 5% metanolowego roztworu chlorku glinu (AICI3) zmieszano w kolbie zawierającej 10 ml metanolu. Objętość doprowadzono do 25 ml poprzez uzupełnienie metanolem i po 30 min mierzono absorbancję przy długości fali λ=425 nm względem ślepej próby, w celu ilościowego oznaczenia flawonów/flawonoli.
Próbkę EEPDMSO (1 ml) oraz 2 ml roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny (1 g DNP), zmieszanego z 2 ml 96% kwasu siarkowego (VI) i rozcieńczonego do 100 ml metanolem, ogrzewano w temperaturze 50°C przez 50 min. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, roztwór rozcieńczono do 10 ml 10% metanolowym roztworem wodorotlenku potasu. Tak uzyskany roztwór w ilości 0,5 ml przeniesiono do kolby miarowej i rozcieńczono ponownie metanolem do objętości 25 ml. W celu oszacowania stosunku flawanonów/dihydroflawonoli, absorbancję mierzono przy długości fali λ=486 nm wobec ślepej próby
Próby ślepe przygotowano podobnie, zastępując EEPDMSO równoważną ilością etanolu i przeprowadzono przez wszystkie kroki zastosowanej wyżej procedury. Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnią zawartość procentową i odchylenie standardowe (SD). Zawartość innych związków polifenolowych oceniano poprzez odjęcie całkowitej zawartości flawonoidów od całkowitej zawartości polifenoli.
Całkowitą zawartość flawonoidów uzyskano przez zsumowanie zawartości flawonów/flawonoli i flawanonów/dihydroflawonoli w badanych próbkach propolisu (22, 23).
Hodowla komórkowa
Doświadczenie wykonano na komórkach raka jelita grubego HCT 116. Linia komórkowa pochodziła z kolekcji ATCC i hodowana była zgodnie z zaleceniami producenta przy użyciu zmodyfikowanego podłoża McCoy‘s z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej. Komórki hodowane były w butelkach o powierzchni 25 cm2 (PAA) w zmodyfikowanym podłożu McCoy’s z dodatkiem następujących antybiotyków 100 IU/ml penicyliny, 100 μl/ml streptomycyny oraz 0,25 μl/ml amfoterycyny B. Komórki hodowano w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze nasyconej parą wodną z 5% dodatkiem CO2.
Po uzyskaniu przez komórki 80% konfluencji, obserwowanej w mikroskopie w układzie odwróconym, dokonywano pasażowania komórek.
Ocena cytotoksyczności testem MTT
W celu określenia cytotoksyczności EEPDMSO komórki raka jelita grubego HCT 116 posiano na płytki 96 dołkowe w ilości 5000 komórek/dołek i dodano świeżej pożywki, a następnie pozostawiono na okres 72 h w celu uzyskania logarytmicznego wzrostu komórek. Po upływie tego czasu pożywkę usunięto, a do dołków dodano podłoże hodowlane zawierające EEPDMSO w stężeniach od 100 μg/ml do 3,125 μg/ml, przygotowane poprzez sporządzenie szeregu rozcieńczeń EEPDMSO w podłożu hodowlanym. Następnie po dodaniu 0,1 ml podłoża wraz z określonym stężeniem EEPDMSO, komórki pozostawiono na 24 godz. w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze nasyconej parą wodną z 5% dodatkiem CO2. Po tym czasie znad komórek usunięto podłoże i dalej postępowano zgodnie z zaleceniami producenta testu. Odczytu absorbancji dokonano przy użyciu czytnika płytek ELISA firmy BioTek przy długości fali λ=570 nm.
Kontrolę stanowiły odczyty absorbancji uzyskane z płytek, na których hodowano linie komórkowe bez dodatku EEPDMSO, zawierające dodatkowo rozpuszczalnik (dimetylosulfotlenek) o stężeniu 0,2%.
Ocena cytotoksyczności testem LDH
W celu oceny cytotoksyczności EEPDMSO przy użyciu testu LDH, komórki raka jelita grubego HCT 116 posiano na płytki 96 dołkowe w ilości 10 000 komórek/dołek i dodano świeżej pożywki, a następnie pozostawiono na okres 72 godz. w celu uzyskania ich logarytmicznego wzrostu. Po upływie 72 godz. pożywkę usunięto, a do dołków dodano podłoże hodowlane zawierające EEPDMSO o stężeniach analogicznych do testu MTT. Następnie komórki pozostawiono na 24 godz. w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze nasyconej parą wodną z 5% dodatkiem CO2. Po tym czasie komórki poddano działaniu odczynnika Accutase. Komórki wirowano 5 min przy prędkości 2000 obr./min. Następnie zebrano po 100 μl supernatantu w trzech powtórzeniach dla każdej próbki badanej. Supernatant przeniesiono na płytkę 96 dołkową i do każdej próbki dodano po 100 μl roztworu reakcyjnego. Płytkę inkubowano przez 30 min na wytrząsarce orbitalnej w temp pokojowej. Odczytu absorbancji dokonano przy użyciu czytnika płytek ELISA przy długości fali λ=490 nm. Jako 100% śmiertelność komórek przyjęto odczyt długości fali dla komórek poddanych lizie za pomocą 1% odczynnika Triton X-100.
Kontrolę stanowiły odczyty absorbancji uzyskane z płytek, na których hodowano badane linie komórkowe bez dodatku EEPDMSO, jednakże zawierające rozpuszczalnik (dimetylosulfotlenek) w stężeniu 0,2%.
Analiza statystyczna uzyskanych wyników
Do utworzenia bazy danych posłużył program Microsoft Excel 2010 for Windows. Analizę statystyczną uzyskanych wyników wykonano za pomocą programu Statistica firmy StatSoft. Normalność wyników zbadano za pomocą testu Shapiro-Wilka. Do oceny wpływu różnych stężeń EEPDMSO na komórki raka jelita grubego HCT 116 użyto testu t-Studenta dla prób niezależnych.
Badania finansowane były z umowy statutowej nr KNW -1-042/P/2/0.
Wyniki

Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.

Płatny dostęp tylko do jednego, POWYŻSZEGO artykułu w Czytelni Medycznej
(uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony)

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem , należy wprowadzić kod:

Kod (cena 19 zł za 7 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

 

 

Płatny dostęp do wszystkich zasobów Czytelni Medycznej

Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu wraz z piśmiennictwem oraz WSZYSTKICH około 7000 artykułów Czytelni, należy wprowadzić kod:

Kod (cena 49 zł za 30 dni dostępu) mogą Państwo uzyskać, przechodząc na tę stronę.
Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.

otrzymano: 2013-01-23
zaakceptowano do druku: 2013-02-05

Adres do korespondencji:
*mgr Robert Kubina
Katedra i Zakład Patologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
ul. Ostrogórska 30, 41-200 Sosnowiec
tel.: +48 (32) 364-13-50
e-mail: rkubina@sum.edu.pl

Postępy Fitoterapii 2/2013
Strona internetowa czasopisma Postępy Fitoterapii